卜天 馬劍茵
摘要[目的] 研究蝦蛄多肽的免疫活性。[方法] 采用胰蛋白酶水解蝦蛄的生物組織,通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)探索其最佳酶解條件,采用MTT試驗(yàn)研究蝦蛄多肽對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活性,并通過中性紅吞噬試驗(yàn)分析蝦蛄多肽的免疫調(diào)節(jié)能力。[結(jié)果] 蝦蛄多肽的最佳酶解條件為:溫度62.5 ℃、pH 9.5、酶解時(shí)間8 h、加酶量0.08%,此時(shí)蝦蛄多肽對(duì)RAW264.7有最高的細(xì)胞活性,并對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用。[結(jié)論] 該研究為從海洋蛋白中獲取高生物活性的酶解產(chǎn)物和具有免疫活性的多肽提供了一定的科學(xué)依據(jù)。
關(guān)鍵詞蝦蛄多肽;胰蛋白酶;酶解條件;免疫活性
中圖分類號(hào)S917文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611(2015)07-139-02
蝦蛄(Oratosquilla oratoria)隸屬節(jié)肢動(dòng)物門[1]、甲殼綱、軟甲亞綱、口足目、蝦蛄科口蝦蛄屬,又名皮皮蝦、東方蝦蛄、富貴蝦、瀨尿蝦等,廣泛分布在我國、日本以及東南亞的沿海地區(qū)。我國南北沿海等地均有大量生產(chǎn)。蝦蛄肉質(zhì)鮮美,營養(yǎng)豐富,物美價(jià)廉,深受消費(fèi)者喜愛。從海洋生物中提取到的多肽,其功能活性主要集中在抗菌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抑制胰島細(xì)胞凋亡及改善胰島素抵抗、降血壓、降血脂、增強(qiáng)骨質(zhì)強(qiáng)度及預(yù)防骨質(zhì)疏松、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖及抗血管生成等方面[2-5]。目前,關(guān)于蝦蛄藥用價(jià)值的研究有口蝦蛄乙酸乙酯提取物與阿霉素或順鉑聯(lián)合作用對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制[6],口蝦蛄提取物對(duì)人低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2的遷移及體外血管生成擬態(tài)的抑制作用[7]等。有關(guān)蝦蛄的研究中大多是提取其酶解液進(jìn)行腫瘤抑制試驗(yàn),然而關(guān)于蝦蛄酶解液對(duì)免疫細(xì)胞作用的研究還不多。筆者采用蝦蛄為原料,用胰蛋白酶作為水解酶,以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞活性作為多肽活性指標(biāo),采用正交試驗(yàn)方法探討其最佳酶解條件,提取多肽,同時(shí)通過小鼠巨噬細(xì)胞中性紅吞噬試驗(yàn)探索蝦蛄多肽的免疫活性。
1材料與方法
1.1原料與試劑
新鮮蝦蛄采集自浙江省舟山市附近海域;胰蛋白酶(購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);氫氧化鈉,購自無錫市晶科化工有限公司,分析純;鹽酸(36%~38%),購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,優(yōu)級(jí)純;二甲基亞砜(DMSO)、MTT試劑、中性紅試劑,均購自美國Sigma公司。
1.2儀器
DS-1高速組織搗碎機(jī),為上海標(biāo)本模型廠產(chǎn)品;BS110電子分析天平,為北京賽多利斯天平有限公司產(chǎn)品;PHS-250精密pH計(jì),為上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;SSW-420-2S恒溫水浴鍋,為上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;LGJ-18冷凍干燥機(jī),北京松源華興科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品;CF16RXⅡ高速冷凍離心機(jī),日本日立公司產(chǎn)品。
1.3試驗(yàn)方法
1.3.1
MTT法檢測(cè)蝦蛄多肽對(duì)細(xì)胞活性的影響。取對(duì)數(shù)生長期的小鼠巨噬細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,接種至96孔板,每孔200 μl,設(shè)置5個(gè)平行孔,于5% CO2、37 ℃條件下貼壁12 h,置于倒置顯微鏡下觀察,并棄去培養(yǎng)液,同時(shí)將蝦蛄酶解液凍干粉以10 mg/ml溶于培養(yǎng)液中。然后分別加入每個(gè)孔,同時(shí)設(shè)置不加樣品的空白對(duì)照組,置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h,加入含有MTT的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng),離心并去除上清液。每孔加入二甲基亞砜100 μl,并置于搖床上低速振蕩15 min,采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于波長570 nm處測(cè)定各孔的吸光值(A值),以A值大小表示小鼠巨噬細(xì)胞代謝活性的強(qiáng)弱[8]。
1.3.2
單因素試驗(yàn)探索酶解工藝條件。用高速組織搗碎機(jī)將蝦蛄組織搗碎勻漿,用緩沖液調(diào)pH,加入胰蛋白酶酶解數(shù)小時(shí),100 ℃下滅酶15 min,于4 ℃下離心15 min(10 000 r/min)并取上清液,采用MTT法測(cè)定酶解液對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞活性的影響。采用單因素試驗(yàn)分析酶解溫度、pH、時(shí)間及加酶量對(duì)細(xì)胞活性的影響,并初步確定酶解法制備蝦蛄多肽的工藝條件。
1.3.3
酶解蝦蛄多肽工藝的優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,運(yùn)用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝條件,并采用MTT法測(cè)測(cè)小鼠巨噬細(xì)胞活性。
1.3.4
中性紅法檢測(cè)蝦蛄多肽免疫調(diào)節(jié)活性。
取對(duì)數(shù)生長期的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7制成濃度為106個(gè)/cell的細(xì)胞懸液,接種至96孔板,每孔200 μl,設(shè)5個(gè)平行孔,于5% CO2、37 ℃條件下貼壁3 h,倒置顯微鏡下觀察,棄去培養(yǎng)液,同時(shí)將上述最佳酶解條件下制備的蝦蛄酶解液以梯度濃度分別溶于培養(yǎng)液中,每孔150 μl。另外,設(shè)置不加樣品的空白對(duì)照組和加入LPS(1 mg/L)擬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的陽性對(duì)照組。置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育48 h,每孔再加入0.1%中性紅溶液50 μl,繼續(xù)培養(yǎng)3 h,終止培養(yǎng)后離心并吸棄上清液,用 PBS 洗滌 3 次,每孔加入 100 μl 細(xì)胞裂解液(乙酸∶無水乙醇=50∶50),4 ℃下靜置過夜,使用酶標(biāo)儀于540 nm處測(cè)定吸光度A值。以A值大小表示巨噬細(xì)胞吞噬功能的強(qiáng)弱[9-10]。以試驗(yàn)組A值與空白組A值的比值表示蝦蛄多肽作用下對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的促進(jìn)率,按照以下公式進(jìn)行計(jì)算:
促進(jìn)率=A試驗(yàn)組/A空白組×100%。
2結(jié)果與分析
2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果
2.1.1
溫度對(duì)蝦蛄酶解產(chǎn)物的影響。從圖1可以看出,隨著酶解溫度的增加,小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞活性(A值)不斷增加,當(dāng)酶解溫度為60 ℃時(shí)A值達(dá)到最大值。
圖1 酶解溫度對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞活性的影響
2.1.2
pH對(duì)蝦蛄酶解產(chǎn)物的影響。從圖2可以看出,隨著pH的升高,小鼠巨噬細(xì)胞活性不斷增加,并在pH為10時(shí)達(dá)到最大值,此后開始降低。
圖2酶解pH對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞活性的影響
2.1.3
酶解時(shí)間對(duì)蝦蛄酶解產(chǎn)物的影響。從圖3可以看出,小鼠巨噬細(xì)胞活性(A值)隨著酶解時(shí)間的增長而升高,當(dāng)酶解8 h后A值最大,此后A值隨著酶解時(shí)間的增長而降低。
圖3酶解時(shí)間對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞活性的影響
2.1.4
加酶量對(duì)蝦蛄酶解產(chǎn)物的影響。從圖4可以看出,隨著加酶量的增長,小鼠巨噬細(xì)胞(A值)不斷降低,當(dāng)加酶量為0.12%時(shí)(A值)最大。
圖4加酶量對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞活性的影響
2.2正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝條件
由表5可知,各因素對(duì)胰蛋白酶酶解蝦蛄的影響程度依次為溫度>加酶量>pH>時(shí)間。溫度是優(yōu)化條件中影響最大的因素,加酶量次之,而時(shí)間的影響最小。最佳酶解工藝條件為:酶解溫度62.5 ℃,pH為9.5,酶解時(shí)間8 h,加酶量為0.08%。
表5酶解正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
序號(hào)時(shí)間pH溫度加酶量吸光值
11(7.5 h)1(9.5)1(57.5 ℃)1(0.08%)1.784
212(20)2(60 ℃)2(0.12%)2.114
313(10.5)3(62.5 ℃)3(0.16%)1.323
42(8 h)1232.344
522312.793
623111.512
73(8.5 h)1322.432
832131.602
933212.245
X11.7402.1871.6332.274
X22.2162.1702.2342.019
X32.0931.6932.2831.756
極差0.4760.4940.6010.518
2.3中性紅吞噬試驗(yàn)結(jié)果
由表1可知,隨著蝦蛄多肽濃度的升高,陽性對(duì)照組及部分試驗(yàn)組的吸光度顯著升高(P<0.05),小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力逐漸增強(qiáng),說明蝦蛄多肽具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力,但其增強(qiáng)作用低于陽性對(duì)照,即不會(huì)引起細(xì)胞炎癥反應(yīng)。
表1小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中性紅吞噬試驗(yàn)結(jié)果(x±S,n=5)
組別濃度∥mg/ml吸光值促進(jìn)率∥%
空白0.092±0.004-
陽性對(duì)照(LPS)0.142±0.015*154
150.099±0.018107
2100.107±0.013116
3150.110±0.004119
4200.116±0.010*126
5250.115±0.008*125
注:*表示與空白對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。
3討論
蝦蛄生長于海洋世界,其多肽的氨基酸結(jié)構(gòu)和組成均有其特殊性,為從海洋生物多肽酶解液中獲得較高生物活性的多肽提供了可能性。筆者采用組織勻漿、酶解、冷凍離心等方法提取蝦蛄活性多肽,中性紅吞噬試驗(yàn)結(jié)果表明蝦蛄經(jīng)過酶解后具有一定的免疫活性。
筆者采用胰蛋白酶對(duì)蝦蛄進(jìn)行酶解,并對(duì)影響多肽酶解過程的各個(gè)因素及水平進(jìn)行綜合分析,酶解最佳條件為酶解溫度62.5 ℃,pH為9.5,酶解時(shí)間8 h,加酶量0.08%。通過MTT試驗(yàn)和小鼠巨噬細(xì)胞中性紅吞噬試驗(yàn)探索了蝦蛄多肽的細(xì)胞活性與免疫活性,試驗(yàn)結(jié)果為更好地使用酶解從海洋蛋白中獲取高生物活性的產(chǎn)物和具有免疫活性的多肽提供了一定的科學(xué)依據(jù),其免疫活性及其機(jī)制還有待于深入研究。
參考文獻(xiàn)
[1]
盛福利.青島近??谖r蛄(Oratosquilla oratoria)漁業(yè)生物學(xué)的初步研究[D].青島:中國海洋大學(xué),2009.
[2] 王導(dǎo),朱翠鳳.海洋生物活性肽的生理活性研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2011,17(5):661-662.
[3] 趙珊珊.酶法水解羅非魚肉條件優(yōu)化的研究[J].中國釀造,2008(9):67-70.
[4] 王靜鳳,王 奕,崔鳳霞.魷魚皮膠原蛋白多肽對(duì)B16黑素瘤細(xì)胞黑素合成的影響[J].國藥理學(xué)通報(bào),2007,23(9):1181-1184.
[5] 景文鵬,吳 蕾.海洋多肽藥物合成的研究進(jìn)展[J].健康與生物醫(yī)藥,2008(8):202-203.
[6] 邵松軍,李明勇,張湘寧,等.口蝦蛄乙酸乙酯提取物聯(lián)合阿霉素或順鉑對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)研究[J].中國醫(yī)藥生物技術(shù),2013,8(5):344-348.
[7] 孔霞,尚九龍,李麗,等. 口蝦蛄提取物對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞遷移和體外血管生成擬態(tài)的抑制作用[J].中國病理生理雜志,2013,29(6):1025-1028.
[8] 紀(jì)麗娜. 金槍魚頭酶解物免疫活性肽的分離及對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響[D].湛江:廣東海洋大學(xué),2012.
[9] 郭淼,崔犁,翟夢(mèng)新,等.林蛙油蛋白中性蛋白酶水解物促進(jìn)脾細(xì)胞和巨噬細(xì)胞功能[J].食品工業(yè)科技,2014,35(1):345-348.
[10] 田維毅,王文佳,李海峰,等.中性紅法檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬功能的實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化[J].貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,31(2):23-26.