孕馬尿中主要結(jié)合雌激素的TLC定性鑒別

姚軍　任麗君　李敏等

摘要為了建立薄層色譜法快速評價新疆孕馬尿中結(jié)合雌激素品質(zhì)的方法，將孕馬尿樣品采用大孔吸附樹脂固相萃取進行前處理，薄層板為硅膠G板（20×10 cm），展開劑為乙酸乙酯-二氯甲烷-甲醇（30∶90∶22，體積比），顯色劑為20%的硫酸乙醇溶液。孕馬尿中3種主要結(jié)合雌激素在薄層板上呈現(xiàn)藍綠色斑點，尿中其他雜質(zhì)無干擾。建立的薄層色譜法能夠?qū)υ旭R尿中主要結(jié)合雌激素快速鑒別，可用于孕馬尿結(jié)合雌激素品質(zhì)評價。

關(guān)鍵詞結(jié)合雌激素；孕馬尿；薄層色譜法；質(zhì)量控制

中圖分類號S857.2+2文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2015）07-147-03

女性進入更年期，激素分泌急劇減少甚至不再分泌，激素的減少將嚴(yán)重影響婦女生理及心理健康。如果不予以重視和治療，將會大大增加更年期癥狀。雌激素補充療法作為治療婦女更年期綜合征的方法之一，在預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松[1]、冠心病[2]及阿爾茲海默癥[3]方面起著非常重要的作用。懷孕母馬的尿液中富含雌激素，每匹孕馬在孕期內(nèi)可形成雌激素50～ 100 g[4]。這些雌激素是一類結(jié)構(gòu)較為相似的甾體化合物，在馬尿中它們多以硫酸鈉鹽形式結(jié)合，因此稱為結(jié)合雌激素（Conjugated estrogens，CE）。其中，雌酮硫酸鈉（Sodium estrone sulfate，ES）、馬烯雌酮硫酸鈉（Sodium equilin sulfate，EqS）及17α雙氫馬烯雌酮硫酸鈉（Sodium 17α-dihydroequilin sulfate， 17α-EqS）是其中最主要的成分，占孕馬結(jié)合雌激素總含量的90%以上，成為孕馬結(jié)合雌激素指標(biāo)性成分?；菔瞎緩?0世紀(jì)40年代就開始從孕馬尿中提取結(jié)合雌激素，作為更年期婦女雌激素補充療法的藥物，結(jié)合雌激素一直作為婦女雌激素補充療法的主要藥物。

新疆地區(qū)具有極其豐富的牧業(yè)資源，其中伊犁河谷是目前世界上馬匹最集中的地區(qū)之一，不僅數(shù)量多，而且伊犁馬的優(yōu)良品質(zhì)揚名海內(nèi)外。根據(jù)《新疆統(tǒng)計年鑒（2011）》有關(guān)數(shù)據(jù)[5]可知，截止2010年年底新疆馬匹存欄量為85.29萬匹，其中伊犁哈薩克自治州為新疆馬匹的集中分布區(qū)，其馬匹存欄量為56.04萬匹，占新疆馬匹存欄總量的65.71%。目前，已有不少制藥企業(yè)從孕馬尿中提取結(jié)合雌激素研發(fā)新的雌激素藥物，但由于孕馬資源屬于當(dāng)?shù)啬翍?，在收購馬尿時需要對孕馬尿品質(zhì)進行評價，因此建立簡便易行的檢測方法就顯得至關(guān)重要。目前，已經(jīng)建立了銀化硅膠板分離孕馬結(jié)合雌激素的方法，但是由于銀化硅膠板中的銀離子極易氧化，實際操作中仍存在諸多問題，難以實際應(yīng)用[6]。筆者建立了孕馬尿3種主要CE的TLC快速定性方法，可用于孕馬尿中結(jié)合雌激素品質(zhì)的快速定性檢測。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1

儀器。薄層色譜儀（包括CAMAG LINOMAT5自動點樣器、CAMAG REPROSTAR3成像系統(tǒng)、CAMAG ADC2自動展開系統(tǒng)，瑞士卡瑪公司）；AB135-S電子天平（梅特勒托利多公司，瑞士）；高速冷凍離心機（HERAEUS MULTIFUGE X3R，美國Thermo scientific公司）；恒溫真空干燥箱（型號DZF-6090，購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.1.2

試劑。ES、EqS及17α-EqS對照品（新疆新姿源生物制藥公司提供，含量≥99.0%）；薄層色譜法所用甲醇、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、二氯甲烷、乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、硫酸均為分析純；HPD-400大孔樹脂（上海摩速公司）；硅膠G板（20×10 cm）（青島海洋公司）。

1.1.3

試驗材料。

采集的孕馬尿樣品均來自新疆伊犁州新源縣土爾根鄉(xiāng)牧戶，批號分別為201301、201302、201303、201304、201305、201306、201307、201308、201309，以上9批為懷孕母馬尿液；批號分別為201310、201311、201312、201313為未懷孕母馬尿液。

1.2方法

1.2.1

3種CE對照品溶液的制備。精確稱取ES、EqS和17α-EqS對照品各20.0、10.0和7.5 mg，分別置于100 ml的容量瓶中，加入甲醇-水（50∶50）溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成ES、EqS、17α-EqS的濃度分別為200、100和75 μg/ml的儲備液。分別精密量取上述3種對照品儲備液2.0 ml置于10 ml容量瓶中，以甲醇-水（50∶50）溶劑定容，得到3種CE濃度分別40、20和15 μg/ml混合對照品溶液。

1.2.2

顯色劑溶液的配制。量取200 ml濃硫酸溶液，溶于乙醇中，最終定容至1 L，搖勻后得到濃度約為20%的硫酸乙醇溶液。

1.2.3

孕馬尿樣品的處理。

1.2.3.1

稀釋直接點樣。取馬尿10 ml，以5 000 r/min離心5 min，取上清液稀釋5倍，點樣。

1.2.3.2

液液萃取處理。 取馬尿10 ml，以5 000 r/min離心5 min，取上清液5 ml，加入0.5 g NaCl固體，分別加入10 ml和15 ml乙酸乙酯萃取2次，每次渦旋5 min合并乙酸乙酯層，搖勻，點樣。

1.2.3.3

固相萃取前處理。5 ml注射器管，用一篩板置于出口處，取HPD-400大孔吸附樹脂1.0 g，干法裝填，裝填體積約2 ml。

活化方法：先用5 ml無水乙醇活化，然后用5 ml純水在重力作用下洗脫。

取孕馬尿5 ml于高速離心機5 000 r/min離心5 min，準(zhǔn)確量取上清液1.0 ml，緩慢滴入固相萃取小柱中，用5%NaCl溶液4 ml清洗，再用1.5%NaOH溶液4 ml清洗，棄去清洗液，再用無水乙醇洗脫并收集流出液至5 ml，搖勻，作為薄層色譜方法供試品，清洗和洗脫步驟均在重力作用洗脫。

1.2.3.4

薄層色譜條件。

薄層板：硅膠G板（20×10 cm）；展開劑：乙酸乙酯-二氯甲烷-甲醇（體積比30∶90∶22）；點樣量為20 μl，點樣寬度3 mm；展開方式：利用自動展開系統(tǒng)，3次增量展開（即展開至硅膠板的1/3、2/3處時取出涼風(fēng)吹干，放入缸中繼續(xù)展開）；顯色方式：浸入法顯色；于105 ℃加熱5 min后置于成像系統(tǒng)中紫外燈365 nm處檢視。

2結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的考察

分別進行了稀釋直接點樣、液液萃取、固相萃取3種前處理方法的考察，3種方法處理的樣品的TLC圖譜見圖1～3。

注：1～3分別為ES、EqS、17α-EqS對照品溶液；4～12為孕馬尿供試品；13～16分別為陰性樣品。

圖1 馬尿稀釋后直接點樣TLC

注：1～3分別為ES、EqS、17α-EqS對照品溶液；4～12為孕馬尿供試品；13～16分別為陰性樣品。

圖2孕馬尿液液萃取后TLC

注：1～3分別為ES、EqS、17α-EqS對照品溶液；4～12為孕馬尿供試品；13～16分別為陰性樣品。

圖3 孕馬尿固相萃取TLC

從圖1～3可以看出，大孔吸附樹脂固相萃取前處理方法在除雜方面的效果較好，薄層色譜圖中有效成分斑點清晰，雜質(zhì)無干擾。因此，選擇大孔吸附固相萃取方法作為TLC前處理方法。

2.2薄層展開劑的考察

薄層展開劑1為乙酸乙酯-二氯甲烷-甲醇（體積比30∶90∶22），圖3中采用的為此展開劑；薄層展開劑2為乙酸乙酯-二氯乙烷-甲醇（體積比35∶65∶20），其色譜情況見圖4；薄層展開劑3為乙酸乙酯-氯仿-正丁醇（體積比35∶50∶15），其色譜情況見圖5。

注：1～3分別為ES、EqS、17α-EqS對照品溶液；4～12為孕馬尿供試品；13～16分別為陰性樣品。

圖4乙酸乙酯-二氯乙烷-甲醇（體積比35∶65∶20）條件下孕馬尿的TLC

注：1～3分別為ES、EqS、17α-EqS對照品溶液；4～12為孕馬尿供試品；13～16分別為陰性樣品。

圖5乙酸乙酯-氯仿-正丁醇（體積比35∶50∶15）條件下孕馬尿的TLC

采用不同展開系統(tǒng)，只能將3種結(jié)合雌激素中的17α-EqS與ES、EqS在薄層板上分開，但由于ES、EqS結(jié)構(gòu)極為相似，因此在硅膠板上無法分開。

通過上述3種薄層展開劑的TLC圖譜比較，薄層展開劑1乙酸乙酯-二氯甲烷-甲醇（體積比30∶90∶22）的分離情況較好，因此選擇薄層展開劑1作為TLC展開劑（圖3～5）。

3小結(jié)

孕馬尿中結(jié)合雌激素品質(zhì)評價是結(jié)合雌激素藥物研發(fā)的原料采購環(huán)節(jié)的重要一環(huán)，由于需要檢測的孕馬尿樣品數(shù)目大、樣品中結(jié)合雌激素含量差異大，建立快速、簡便和低成本的孕馬尿檢測方法尤為重要。

建立的孕馬尿中結(jié)合雌激素薄層快速定性方法，能夠有效區(qū)分懷孕母馬尿液與未懷孕母馬尿液，并能夠根據(jù)斑點顏色深淺評價結(jié)合雌激素品質(zhì)，為收購孕馬尿提供一種快速鑒別的方法。

參考文獻

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