水稻小G蛋白OsRab5b的亞細(xì)胞定位研究

邵軍麗 龍躍生 徐增富

（1.廣東醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，東莞 523808；2.中山大學(xué)基因工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510275；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)研究所，廣州 510260；4.中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園熱帶植物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650223）

小GTP結(jié)合蛋白（20-25 kD），簡(jiǎn)稱小G蛋白，是一個(gè)很大的蛋白超家族，存在于所有的真核生物中，其功能依賴GTP的水解，是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子開關(guān)［1]。Rab蛋白是小G蛋白超家族中最大的一個(gè)家族，是3個(gè)（Ras、Rho和Rab）在羧基端存在翻譯后脂類修飾的小G蛋白家族之一，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)各個(gè)細(xì)胞器及內(nèi)膜系統(tǒng)的運(yùn)輸［1]。Rab蛋白的羧基端包含兩個(gè)半胱氨酸的高變區(qū)，翻譯后的脂類修飾發(fā)生在高變區(qū)末端的半胱氨酸上。這種脂類修飾是蛋白與膜結(jié)合必不可少的［2]，在酵母及動(dòng)物中沒有發(fā)現(xiàn)例外。有意思的是，在植物中除了在羧基端進(jìn)行脂類修飾的Rab5，即傳統(tǒng)的Rab5（植物中稱作Rab5a）外，還發(fā)現(xiàn)了植物特異的Rab5b類，如冰葉日中花（Mesembryanthemum crystallinum）的McRab5b（m-Rab（mc））［3]，擬南芥（Arabidopsis thaliana）的Ara6/AtRabF1［4]，輪藻（Chara australis）中的CaARA6（CaRABF1）［5]等。這類植物特異性的Rab5b羧基端缺少24-33個(gè)包括兩個(gè)半胱氨酸的高變區(qū)序列。取而代之的是N端比傳統(tǒng)的Rab5a多出13-26個(gè)保守的氨基酸序列。其中擬南芥的Ara6第二位甘氨酸在體外翻譯修飾實(shí)驗(yàn)中可以豆蔻?；⒃谝欢ǔ潭壬嫌绊慉ra6細(xì)胞定位［6]。但其它植物中Rab5b第二位甘氨酸的作用還沒有研究。

水稻小G蛋白OsRab5b基因由林慧賢等［7]克隆和鑒定，它與冰葉日中花的McRab5b（GenBank AJ 006225）和百脈根的LiRab5b（GenBank Z73939）cDNA 核苷酸序列相似程度分別為74% 和76 %。在大腸桿菌中表達(dá)的GST-OsRab5b具有GTP結(jié)合活性［8]。本實(shí)驗(yàn)研究OsRab5b在煙草BY-2細(xì)胞中的定位及OsRab5b第二位甘氨酸在其亞細(xì)胞定位中的作用，旨在為深入研究OsRab5b的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞 OsRab5b原核表達(dá)質(zhì)粒、GFP植物表達(dá)質(zhì)粒pYS22由本實(shí)驗(yàn)室保存，OsRab5b-GFP與OsRab5b（Gly2Ala）-GFP（將第二位甘氨酸突變?yōu)楸彼幔┲参锉磉_(dá)質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建。農(nóng)桿菌EHA105為本實(shí)驗(yàn)室保存。煙草BY-2（Bright Yellow-2）細(xì)胞由香港中文大學(xué)姜里文教授惠贈(zèng)。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 乙酰丁香酮：少量DMSO（二甲基亞砜）溶解后，再用蒸餾水定容配成100 mmol/L母液；wortmannin：Sigma 19545-26-7；DMSO配成1 mmol/L貯存液；BFA：Sigma-Aldrich；B-6542；DMSO配成2.5 mg/mL貯存液；FM4-64：Molecular probe（T316），用氯仿配成12 mmol/L貯存液；固定液：50 mmol/L 磷酸鈉緩沖液 pH7.0，5 mmol/L EGTA，0.02% Azide，4.5%多聚甲醛；磷酸鈉-EGTA緩沖液：50 mmol/L磷酸鈉緩沖液pH7.0，5 mmol/L EGTA，0.02% Azide；封閉緩沖液 1（B1）：1×PBS，1%BSA；封閉緩沖液2（B2）：1×PBS，0.25% BSA，0.25%Gelatin，0.05% NP-40，0.02% Azide。VSRAt-1抗體由香港中文大學(xué)姜里文教授惠贈(zèng)。農(nóng)桿菌EHA105培養(yǎng)基為YEB。BY-2細(xì)胞培養(yǎng)基為植物組織培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)基MS。

1.2 方法

1.2.1 OsRab5b蛋白序列分析 利用軟件Clustal X 1.83進(jìn)行多重蛋白序列比對(duì)。進(jìn)化樹分析采用軟件MEGA 4.0［9]（http：//www.megasoftware.net/）。選用N-J（Neighbor-Joining）法，bootstrap 值通過10 000次的重復(fù)確定。蛋白序列比對(duì)用到的Rab5同源蛋白基因的GenBank序列號(hào)依次是：OsRab5b（AF323991），LjRab5b（Z73939），McRab5b（AJ006225），Ara6（NM_115341），NtRab5（X63875），LjRab5a（Z73938），Rha1（X59152），OsRab5a（AY029301），HsRab5a（M28215），YeastYpt51（P36017）。

1.2.2 載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 以O(shè)sRab5b原核表達(dá)質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增野生型的OsRab5b讀碼框和突變型的OsRab5b（Gly2Ala）讀碼框，所用引物如下：

OsRab5b：上游引物（XhoI）5'-TAATTCATGGGTTGCT-3'，下游引物（KpnI）5'-TAAGACGCCGTTGGCCTG-3'。

OsRab5b（Gly2Ala）：上游引物（XhoI）：5'-TA-AATTCATGGCTTGCT-3'，下游引物（KpnI）：5'-TAAGACGCCGTTGGCCTG-3'。

PCR反應(yīng)程序：94℃5 min；94℃30 s，53℃40 s，72℃50 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃10 min?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物。XhoI 和KpnI酶切擴(kuò)增產(chǎn)物和GFP植物表達(dá)載體pYS22（含CaMV35S 啟動(dòng)子），回收酶切后的擴(kuò)增產(chǎn)物和線性載體。將酶切擴(kuò)增產(chǎn)物與線性載體連接，得到OsRab5b-GFP與OsRab5b（Gly2Ala）-GFP質(zhì)粒（圖1）。轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序、酶切鑒定。經(jīng)鑒定成功的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，方法為電擊轉(zhuǎn)化法。電擊儀（Eppendorf公司生產(chǎn)的2510型）電擊參數(shù)為電壓1 800 V，持續(xù)5 ms。電擊結(jié)束后，加入YEB 液體培養(yǎng)基至電擊杯中，于28℃、100 r/min 培養(yǎng)4 h。取50 μL 菌液涂布含利福平（50 mg/L）和壯觀霉素（100 mg/L）的 YEB 固體平板上培養(yǎng)36 h。挑取菌落用YEB液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，鑒定成功的轉(zhuǎn)化菌株用于BY-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

圖1 OsRab5b-GFP與OsRab5b（Gly2Ala）-GFP質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

1.2.3 BY-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、wortmannin和BFA處理、免疫熒光標(biāo)記、FM4-64的攝取實(shí)驗(yàn) 均參照相關(guān)文獻(xiàn)［10，11]進(jìn)行，簡(jiǎn)述如下。

BY-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)化：按1∶10繼代BY-2細(xì)胞，第3天，向培養(yǎng)皿加入4 mL BY-2懸浮細(xì)胞、4 mL MS培養(yǎng)基及乙酰丁香酮（終濃度50-100 μmol/L），反復(fù)吸打20次。加入100 μL OD=0.6左右的農(nóng)桿菌，混勻，包上封口膜，28℃黑暗培養(yǎng)3 d后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入50 mL離心管。在50 mL 離心管中用40 mL MS液體培養(yǎng)基洗細(xì)胞，上下顛倒，自然沉降，棄上清，重復(fù)3-5次。1 mL MS液體培養(yǎng)基重懸BY-2細(xì)胞，涂于MS固體培養(yǎng)基（卡那霉素100 μg/mL，羧芐青霉素250 μg/mL），吸出所有液體。包上封口膜，28℃黑暗培養(yǎng)3-5周，即可見陽(yáng)性克隆長(zhǎng)出。

Wortmannin和BFA處理：取0.5 mL BY-2懸浮細(xì)胞于1.5 mL 離心管中，自然沉降，棄上清，加入新鮮MS液體培養(yǎng)基0.5 mL，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入相應(yīng)體積的wortmannin或BFA貯存液。避光放置1 h，取樣放于載玻片上，共聚焦掃描顯微鏡下觀察拍照。

BY-2細(xì)胞的免疫熒光標(biāo)記：取1 mL 的細(xì)胞沉淀裝入15 mL 離心管中，加10 mL 固定液，混勻，常溫過夜。用磷酸鈉-EGTA洗細(xì)胞，室溫1 h 或4℃過夜。用磷酸鈉緩沖液配制的1%-3%細(xì)胞溶解纖維素酶（cellulysin cellulase）孵育細(xì)胞，室溫20-30 min。磷酸鈉-EGTA洗2次。加200-500 μL 0.5%Triton X-100孵育細(xì)胞，室溫2 min。B1洗細(xì)胞2次。B1封閉細(xì)胞，室溫30 min。離心棄去B1。加B2，按1∶50 或 1∶100 稀釋加入多克隆抗血清或4 μg/mL親和純化的一抗，4℃過夜。B2洗細(xì)胞3次，依次10、10和30 min。離心棄去B2，加新鮮B2，1∶100稀釋加入熒光標(biāo)記的二抗，室溫放置 1 h。B2洗細(xì)胞3次，依次15、15和20 min。免疫熒光標(biāo)記完畢，取樣放于載玻片上，共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

BY-2細(xì)胞的FM4-64攝取：取0.5 mL BY-2懸浮細(xì)胞于1.5 mL離心管，自然沉降，棄上清，加入新鮮MS液體培養(yǎng)基500 μL，加入1 μL FM4-64（母液：12 mmol/L）混勻，冰上避光放置5 min。MS液體培養(yǎng)基洗2次（冰上）。洗完放于室溫，開始計(jì)時(shí)，15、30和60 min取樣放于載玻片上，共聚焦掃描顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 OsRab5b是一種植物特異性小GTP結(jié)合蛋白

圖2 OsRab5b和其它物種同源蛋白序列比對(duì)分析（A）及系統(tǒng)進(jìn)化分析（B）

將OsRab5b與植物、人及酵母中的同源蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果（圖2-A）表明，Rab5b與Rab5a家族的成員有較高的相似性，兩類Rab5都具有在GTP結(jié)合蛋白家族中非常保守的5個(gè)結(jié)構(gòu)域，即G1-G5。OsRab5b與其它植物特異性的Rab5b一樣，也缺少羧基端的一段不保守的含半胱氨酸的高變區(qū)序列，而氨基端多出一段氨基酸序列。采用程序WolfPSORT（http：//wolfpsort.seq.cbrc.jp/）預(yù)測(cè)時(shí)，氨基端第二個(gè)甘氨酸會(huì)被豆蔻?；５鞍仔蛄邢到y(tǒng)進(jìn)化分析（圖2-B）也表明，植物中存在兩類Rab5，即Rab5a類和Rab5b類，OsRab5b屬于植物特異性的Rab5b。

2.2 Wortmannin和BFA對(duì)OsRab5b-GFP及其突變（Gly2Ala）蛋白分布的影響

為了研究OsRab5b在細(xì)胞中的定位及第二位甘氨酸在定位中的作用，分別構(gòu)建了OsRab5b、OsRab5b（Gly2Ala）與報(bào)告基因GFP融合的植物表達(dá)質(zhì)粒（圖1），并轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將2個(gè)GFP融合載體轉(zhuǎn)化到煙草BY-2細(xì)胞，通過共聚焦顯微鏡篩選得到GFP陽(yáng)性克隆。OsRab5b-GFP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的GFP大部分呈點(diǎn)狀分布，少部分在細(xì)胞質(zhì)彌散分布。OsRab5b（Gly2Ala）-GFP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的GFP全部彌散分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)（圖3）。Wortmannin 處理使OsRab5b-GFP 標(biāo)記的細(xì)胞器膨脹成小的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；BFA 在100 μg/mL時(shí)使OsRab5b-GFP標(biāo)記的細(xì)胞器聚集，但在 10 μg/mL時(shí)沒有引起OsRb5b-GFP標(biāo)記的細(xì)胞器形態(tài)發(fā)生變化（圖3-A）。據(jù)此可以初步判斷OsRab5b-GFP 標(biāo)記的細(xì)胞器是前液泡區(qū)（prevacuolar compartment）。Wortmannin和 BFA處理沒有引起OsRab5b（Gly2Ala）-GFP信號(hào)的任何變化（圖3-B）。

2.3 OsRab5b與前液泡區(qū)標(biāo)記物VSRAt-1的共定位

為了進(jìn)一步確證OsRab5b-GFP 定位于前液泡區(qū)，本研究選用擬南芥液泡分選受體VSRAt-1作為前液泡區(qū)標(biāo)記物對(duì)OsRab5b-GFP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行了免疫熒光標(biāo)記。如圖4所示，在沒有藥物（圖4-A）及有藥物處理（圖4-B，4-C，4-D）時(shí)，OsRab5b-GFP標(biāo)記的細(xì)胞結(jié)構(gòu)都有一部分被VSRAt-1抗體染色。

2.4 OsRab5b與內(nèi)吞示蹤染料FM4-64的共定位

圖3 OsRab5b-GFP（A）和OsRab5b（Gly2Ala）-GFP（B）轉(zhuǎn)基因細(xì)胞對(duì)藥物wortmannin和BFA的反應(yīng)

OsRab5b定位于內(nèi)吞途徑的前液泡區(qū)（晚期內(nèi)吞體），所以O(shè)sRab5b應(yīng)該和內(nèi)吞示蹤染料FM4-64有共定位。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，本研究進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因BY-2細(xì)胞的FM4-64攝取實(shí)驗(yàn)。如圖5所示，在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞攝取FM4-64的60 min，而不是較早的15 min和30 min時(shí)，OsRab5b-GFP標(biāo)記的結(jié)構(gòu)大部分被FM4-64標(biāo)記。

3 討論

Wortmannin 可以使前液泡區(qū)（晚期內(nèi)吞體）膨脹形成小的空泡（small vacuoles），熒光圖上表現(xiàn)為小的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，但不會(huì)影響高爾基體［11，12]。BFA低濃度時(shí)（5-10 μg/mL）使高爾基體形成聚集，不影響前液泡區(qū)形態(tài)。但是，BFA 高濃度時(shí)（50-100 μg/mL）既可以使高爾基體也可以使前液泡區(qū)形成聚集［10]。根據(jù)本研究藥物處理的結(jié)果，可以推斷OsRab5b-GFP 定位于前液泡區(qū)。擬南芥液泡分選受體VSRAt-1主要定位于煙草BY-2細(xì)胞的前液泡區(qū)［11]，本研究將VSRAt-1作為前液泡區(qū)的標(biāo)記物，對(duì)OsRab5b-GFP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行了VSRAt-1抗體免疫熒光標(biāo)記，結(jié)果表明OsRab5b有一部分和VSRAt-1共定位于前液泡區(qū)。FM4-64是一種苯乙烯基熒光染料，可通過內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，常被用作內(nèi)吞示蹤染料［13，14]。OsRab5b-GFP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的FM4-64攝取實(shí)驗(yàn)表明OsRab5b主要定位于晚期內(nèi)吞體，即前液泡區(qū)［11，15]。綜合上述3個(gè)亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)，可以判定OsRab5b定位于前液泡區(qū)。

圖4 OsRab5b-GFP和前液泡區(qū)標(biāo)記物VSRAt-1的共定位

圖5 OsRab5b-GFP定位于FM4-64標(biāo)記的內(nèi)吞途徑上的晚期內(nèi)吞體（即前液泡區(qū)）

在冰葉日中花中，McRab5b除了大部分定位于BP-80和AtPEP12p標(biāo)記的前液泡區(qū)，還與JIM84和ST標(biāo)記的高爾基體結(jié)構(gòu)有一定程度的聯(lián)系［3]。同樣，輪藻CaARA6既有內(nèi)吞體定位，也有高爾基體定位［5]。那么被OsRab5b-GFP標(biāo)記而沒有被VSRAt-1標(biāo)記的結(jié)構(gòu)也有可能是高爾基體結(jié)構(gòu)。前液泡區(qū)，也叫晚期內(nèi)吞體，是內(nèi)吞途徑的細(xì)胞器，而高爾基體是分泌途徑的細(xì)胞器。一種蛋白可以既定位于分泌途徑又定位于內(nèi)吞途徑，并不矛盾。因?yàn)橐呀?jīng)有很多證據(jù)表明內(nèi)吞途徑和分泌途徑可以在高爾基體［16]、早期內(nèi)吞體［15]和前液泡區(qū)（晚期內(nèi)吞體）匯合［17]。這就提示，OsRab5b可能在內(nèi)吞途徑和分泌途徑都發(fā)揮功能，這可作為下一步研究的方向。還有一部分OsRab5b-GFP信號(hào)彌散于細(xì)胞質(zhì)中，這與Rab5在膜與細(xì)胞質(zhì)兩個(gè)區(qū)域循環(huán)［18]一致。

OsRab5b（Gly2Ala）-GFP彌散分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而且wortmannin和BFA處理沒有引起OsRab5b（Gly2Ala）-GFP信號(hào)的任何變化，所以可以推測(cè)第二位甘氨酸具有引導(dǎo)OsRab5b正確定位的功能。

從轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的激光共聚焦顯微鏡圖片上看，一個(gè)非常有趣的現(xiàn)象是OsRab5b（Gly2Ala）-GFP表達(dá)量遠(yuǎn)高于OsRab5b-GFP，這在植物中還未見報(bào)道。這可能是因?yàn)镺sRab5b（Gly2Ala）-GFP定位錯(cuò)誤，功能喪失，導(dǎo)致降解調(diào)節(jié)機(jī)制失靈，最后造成了OsRab5b（Gly2Ala）蛋白的大量積累。在動(dòng)物細(xì)胞中也存在類似的現(xiàn)象。Rab5、Rab7羧基端的異戊烯化被藥物洛伐他?。╨ovastatin）抑制后，其蛋白量增加4倍之多［19]。因此，對(duì)這一現(xiàn)象的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究具有重要意義。

4 結(jié)論

水稻小G蛋白OsRab5b屬于植物特異性的Rab5b類。3個(gè)定位實(shí)驗(yàn)都表明OsRab5b定位在BY-2細(xì)胞的前液泡區(qū)，即晚期內(nèi)吞體，可能在內(nèi)吞及分泌過程中發(fā)揮功能。突變體OsRab5b（Gly2Ala）彌散分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，所以O(shè)sRab5b的第二位甘氨酸在該蛋白的正確定位中具有重要作用。

致謝：本研究得到了香港中文大學(xué)姜里文教授和繆嚴(yán)松博士的大力幫助，在此表示衷心的感謝。

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