雙光子共聚焦顯微鏡在植物學(xué)研究中獲取高質(zhì)量圖像的應(yīng)用

管利萍,趙 陽,彭 亮

(蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,甘肅蘭州 730000)

雙光子共聚焦顯微鏡在植物學(xué)研究中獲取高質(zhì)量圖像的應(yīng)用

管利萍,趙 陽,彭 亮

(蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,甘肅蘭州 730000)

介紹了雙光子共聚焦顯微鏡的基本原理和特點,從儀器操作、參數(shù)調(diào)節(jié)等方面記敘了利用雙光子共聚焦顯微鏡FV1000 MPE在植物學(xué)研究中如何獲取高質(zhì)量圖像的問題,旨在為該儀器的使用者與管理者提供參考,使之更好地服務(wù)于的教學(xué)與科研研究。

雙光子激光共聚焦顯微鏡;熒光;圖像

雙光子共聚焦顯微鏡是集雙光子和激光共聚焦顯微鏡為一體的掃描成像和分析系統(tǒng),是生命科學(xué)領(lǐng)域大型實驗平臺,是重點實驗室和科研院所必備的大型儀器,自二十世紀(jì)九十年代開發(fā)應(yīng)用到現(xiàn)在,為生命科學(xué)眾多領(lǐng)域的研究提供了強大的技術(shù)支持,成為高質(zhì)量圖像和數(shù)據(jù)信息采集的必備儀器。由于該儀器價格昂貴、管理要求嚴(yán)格,使用者必須系統(tǒng)地了解和掌握其使用和管理方法。

1 雙光子共聚焦顯微鏡簡介

激光共聚焦顯微鏡技術(shù)(laser scanning confocal microscope,LSCM)是光學(xué)顯微鏡技術(shù)的一次革命,對生命科學(xué)等相關(guān)學(xué)科的研究工作起到了不可估量的推動作用[1]。激光共聚焦顯微鏡,基本原理是Marvin Minsky于1957年提出的,它以激光作為光源,采用共軛聚焦技術(shù)消除焦點以外雜散光的干擾,配合光掃描技術(shù)實現(xiàn)對樣品的光學(xué)切片和三維成像[2]。但由于其光毒害、光降解、光漂白等原因以及受到顯微鏡本身復(fù)雜的紫外光學(xué)元件的限制,LSCM的特點和潛力最初沒有完全發(fā)揮出來[3]。1990年美國康奈爾大學(xué)Denk 等[4]將雙光子激發(fā)現(xiàn)象應(yīng)用到激光共聚焦掃描顯微鏡中,并制造出了第一臺雙光子激光共聚焦顯微鏡(Two-photon laser scanning microscope,TPLSM)。雙光子技術(shù)多采用鎖模的飛秒鈦寶石激光器得到足夠強的紅外激光,紅外激光具有相對較深的傳播距離,不同于單光子激發(fā)的線性過程,雙光子只在焦點處的微小區(qū)域內(nèi)樣品才能吸收雙光子而發(fā)出熒光[5]。所以雙光子技術(shù)問世后由于其低損傷、大成像深度、活體長時間三維成像和背景干擾極小,很快被用于神經(jīng)信號傳導(dǎo)、生物代謝和藥物研究,近年逐漸成熟的雙光子全內(nèi)反射技術(shù),更是將雙光子高信噪比和實時動態(tài)成像等優(yōu)點發(fā)揮到了極致[6-7]。

2 雙光子共聚焦顯微鏡獲取植物圖像的操作

貴重大型儀器的使用從開機到使用,每一步都必須遵守嚴(yán)格的操作流程。如果不嚴(yán)格按照流程操作,輕者減少設(shè)備壽命,重者會直接造成設(shè)備損壞,所以操作者每一個步驟都要嚴(yán)格、細(xì)心執(zhí)行。

2.1 開機

激光器等設(shè)備價格昂貴,開機前使用者要明確本次開機的工作目的,根據(jù)實驗需求開啟相應(yīng)的激光器,避免打開不必要的設(shè)備而造成損耗和浪費。一般掃描植物材料不需要開啟雙光子激光器的電源和AOM裝置電源。雙光子進行活體動物掃描時使用的是長工作距離雙光子專用水鏡,配備的電動載物臺固定在大型防震臺上,而使用其他物鏡進行共聚焦掃描時需要在電動載物臺上安裝便攜式小載物臺(見圖1),否則無法對焦,所以在開機時需要特別注意如下問題:使用共聚焦掃描在打開軟件前不能安裝便攜式小載物臺,因為軟件開啟時自動恢復(fù)的是前次物鏡的工作位置,如果前次使用者使用的是25×水鏡,開啟軟件時系統(tǒng)自檢到的是25×水鏡的位置,物鏡會自動下降到很接近電動載物臺的位置,如果軟件未打開前就安裝上便攜小載物臺,就會發(fā)生軟件啟動時物鏡碰撞到便攜小載物臺的危險。所以正確的做法是:打開電腦和設(shè)備電源,再打開軟件,將物鏡轉(zhuǎn)換器升高到最高位置,清除原有雙光子Z掃描的起止點數(shù)據(jù),最后安裝便攜小載物臺。

圖1 雙光子共聚焦顯微鏡FV1000 MPE的載物臺

2.2 各參數(shù)調(diào)節(jié)

(1)圖像采集的參數(shù)調(diào)節(jié)。選擇合適的掃描速度,掃描速度一般在8～10之間,過慢易發(fā)生淬滅,過快則分辨率較低,背景噪影升高。掃描分辨率可根據(jù)需要在64×64～4096×4096間選擇;圖片實際分辨率與使用的物鏡也有關(guān),要選擇合適的物鏡,需用高倍物鏡時就不能用低倍物鏡代替;提高實際分辨率時還要注意數(shù)字放大ZOOM值不能過大,一般選擇3～4, ZOOM過高則無意義。為提高信噪比可選擇Kalman濾波器,一般情況下設(shè)置幅平均為2～6,實際操作中要根據(jù)材料的耐受性和實驗?zāi)康暮侠磉x擇。

(2)熒光檢測通道的精細(xì)調(diào)節(jié)。針孔(pinhole)的調(diào)節(jié):針孔的大小與物鏡數(shù)值孔徑有關(guān),為保證圖像質(zhì)量,針孔值越接近1 Au(airy unit)則越好,熟練掌握軟件的操作者可根據(jù)需要調(diào)節(jié)針孔大小。

激光管電壓的調(diào)節(jié):激光管電壓越高,激光強度越強,收集的熒光信號也越強,但標(biāo)本更容易漂白或淬滅,長時間高電壓還會縮短半導(dǎo)體激光器壽命。FV1000 MPE的405 nm、635 nm激光器是半導(dǎo)體激光器,這2個激光器沒有單獨的電源控制開關(guān),只要開啟設(shè)備它們就已通電,所以為保證其使用壽命,這2個激光器使用結(jié)束后,一定要將它的激光強度降為0才能進行其他操作?？傊?在保證圖像質(zhì)量的前提下,激光強度越低越好,且隨著使用時間的推移,激光器功率會有所降低,所以在激光器使用一段時間后,同類實驗材料根據(jù)實際情況可在以往基礎(chǔ)上適當(dāng)提高激光強度。

檢測通道的調(diào)節(jié):光電倍增管(PMT)的電壓(HV)值越高,熒光信號越強,但過高的電壓會縮短PMT的壽命,一般HV不超過800為宜;增益(Gain)增大則信號和噪聲都增強,減小則信號和噪聲都減小,原則上以圖像質(zhì)量為準(zhǔn),增益值越接近1越好;背景扣除(Offset)根據(jù)經(jīng)驗選擇7～15較好。

可調(diào)光欄(VBF)的調(diào)節(jié):VBF可對發(fā)射光接收范圍進行調(diào)節(jié),在掃描前實驗者要明確所用的染料或探針的發(fā)射譜線,選擇正確接收范圍,避免噪聲或串色[8]。

設(shè)置以上參數(shù)時應(yīng)避免出現(xiàn)曝光過度和曝光不足,可適時點擊ctrl＋F鍵檢查曝光程度,以免影響圖像質(zhì)量和后續(xù)的數(shù)據(jù)分析[9]。

(3)XYZ掃描應(yīng)注意的問題。FV1000 MPE可對樣品進行連續(xù)分層掃描和三維重建。如需對樣品結(jié)構(gòu)進行三維重建,在掃描時要注意Z軸掃描深度為該樣品Z軸深度的兩倍,即掃描樣品本身深度加樣品上、下部二分之一Z軸深度,這在進行三維重建時不會丟失信息,且后期處理的效果會更好。還要注意步距(Z-steps),不同的結(jié)構(gòu)需設(shè)置不同的步距,以原生質(zhì)體為例,步距在0.5～0.8μm即可,細(xì)胞骨架步距在0.4～0.6μm,過小的步距不但無法實現(xiàn)預(yù)期目的,而且浪費時間和材料。還要注意排除一切引起水平和Z軸方向產(chǎn)生移動的因素,比如掃描時保持安靜、人員不要來回走動、不能碰觸防震臺等。

3 雙光子共聚焦顯微鏡在植物研究中獲取高質(zhì)量圖像應(yīng)用舉例

3.1 擬南芥根尖

選取4～6天生長的根尖(成熟區(qū)根毛多不宜作為掃描區(qū)),臨時裝片加蓋玻片時介質(zhì)要適宜,液體偏少會產(chǎn)生較多的氣泡,液體偏多容易出現(xiàn)流動,兩者都會影響成像。掃描時選擇4∶3模式,即掃描分辨率為1024×768,使用20×或40×復(fù)消色差物鏡,ZOOM值為2～4,Kalman為2～4。如需進行Z掃描,步距為0.7～0.8μm,但層數(shù)不宜過多,否則影響合成效果。圖2(a)為擬南芥根尖Z掃描合成圖,步距0.7μm,4層合成,紅色為PI染色,綠色表示生長素水平指示基因DR5的表達情況。

3.2 葉表皮

植物葉片上表皮由于具有較多的表皮毛會影響掃描,如果觀察表皮細(xì)胞應(yīng)將下表皮朝上。制備臨時裝片時葉齡要適宜,不宜太老,取材面積不宜過大[10],以小拇指甲面積的0.2～0.3為宜,鋪平,掃描分辨率1024× 1024,40×復(fù)消色差物鏡,ZOOM值為3～4,Kalman為2～3,需要Z掃描時步距根據(jù)材料確定,細(xì)胞骨架步距不超過0.6μm,其他步距0.7～0.8μm均可。圖2(b)為擬南芥葉表皮Z掃描合成圖,紅色為FM4-64染色的細(xì)胞膜,綠色為GFP,步距0.7μm。圖2(c)為擬南芥葉表皮示骨架Z掃描合成圖,步距0.6μm。

3.3 原生質(zhì)體

為防止由于液體流動發(fā)生圖像飄移,可用加樣槍吸取15μL左右的材料并制成臨時裝片,40×復(fù)消色差物鏡,掃描分辨率為1024×1024,ZOOM值為4～8。由于激光刺激,單細(xì)胞更易在液體中移動或旋轉(zhuǎn)而影響成像,因此可不使用Kalman。要獲得立體感強的圖片需要Z掃描,步距0.6～0.7μm,掃描速度不宜過慢。圖2(d)和(e)為原生質(zhì)體自發(fā)綠色和紅色熒光圖,圖2(e)為通過VBF將自發(fā)綠色熒光去除采集到的GFP信號和葉綠體紅色自發(fā)熒光,步距0.6μm,均采用Z掃描合成。

圖2 雙光子共聚焦顯微鏡獲取的植物組織和細(xì)胞的圖像

通過以上的技術(shù)和方法,我們已經(jīng)為多個課題組獲取了大量的高質(zhì)量的圖像,相關(guān)研究成果已經(jīng)發(fā)表在《PLOS Genetics》[11]、《Plant Journal》[12]、《Plant Physiology》、《Molecular Plant》[13]等10余種國際高水平SCI期刊,得到了廣大師生的充分肯定和歡迎。

4 結(jié)束語

隨著激光成像技術(shù)、計算機技術(shù)的發(fā)展,雙光子共聚焦系統(tǒng)的應(yīng)用水平會得到更大的提升。同時,要開發(fā)利用好該儀器,要求儀器管理者具備強烈的責(zé)任心[14],堅持做到儀器設(shè)備的日常維護和定期保養(yǎng),完善使用制度,不斷提高自身業(yè)務(wù)水平和工作積極性[15-16]。管理者還可以通過開設(shè)研究生課程等方式對使用者進行系統(tǒng)的培訓(xùn),開通網(wǎng)上預(yù)約系統(tǒng),以便更好地為師生和科研工作者服務(wù)。

References)

[1]Cannon J,Armas M.Laser Focus World,Ultraviolet lasers expand uses of confocal microscopes[J].Laser Focus World,1993,29: 99-104.

[2]王春梅.激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)[M].西安:第四軍醫(yī)大學(xué)出版社,2004.

[3]陳德強,夏安東.雙光子激光掃描熒光顯微鏡及其應(yīng)用[J].物理, 2000,29(4):232-236.

[4]Denk W,strickler J H,Webb W W.Two-photon laser scanning fluorescence microscopy[J].Science,1990,248:73-76.

[5]Svoboda K,Denk W,Kleinfield D,et al.In vivo dendritic calaium dynamics in neocortical pyramidal neurons[J].Nature,1997,385: 161-165.

[6]夏偉強,周源.雙光子顯微成像技術(shù)的新進展[J].中國醫(yī)療器械雜志,2011,35(3)204-207.

[7]Schapper F,Gonslves J T,Oheim M.Fluorescence imaging with two-photo evanescent wave excitation[J].European Biophysics Journal,2003,32:635-643.

[8]段妍,關(guān)苑君.Zeiss LSM710激光共聚焦顯微鏡的使用和管理[J].實驗室研究與探索,2012,31(8)228-230.

[9]袁蘭,激光掃描共聚焦顯微技術(shù)教程[M].北京,北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社,2004.

[10]劉向東.利用激光掃描共聚焦顯微鏡研究植物細(xì)胞發(fā)育形態(tài)學(xué)變化[J].激光生物學(xué)報,2007,16(2)173-178.

[11]Qin Q Q,Wang W,Guo X L,et al.Arabidopsis DELLA protein degradation is controlled by a type-one protein phosphatase, TOPP4[J].PLOS Genetics,2014,10(7):e1004464.

[12]Qian P P,Han B,Forestier E,et al.Sterols are required for cell fate commitment and maintenance of the stomatal lineage in Arabidopsis[J].The Plant Journal,2013,74:1029-1044.

[13]Zhu J,Yuan S,Wei G et al.Annexin5 is essential for pollen development in Arabidopsis[J].Molecular Plant,2014,4:751-754.

[14]習(xí)曉遠,袁慶祝.實驗隊伍與實驗室可持續(xù)發(fā)展的研究[J].實驗技術(shù)與管理,2000,17(5):67-69.

[15]董偉,劉瑾.加強大型儀器設(shè)備科學(xué)化管理,提高使用效益[J].實驗技術(shù)與管理,2008,25(4):173-175.

[16]楊威.提高大型儀器設(shè)備的綜合管理水平[J].實驗技術(shù)與管理, 2012,29(2):200-202.

Application of two-photon confocal microscopy in botany research for high quality images

Guan Liping,Zhao Yang,Peng Liang
(School of Life Sciences,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China)

As a widely used large and expensive equipment in the life science field,the two-photon confocal microscope has been used in the research of botany,zoology,molecular cell biology,neurobiology,genetics and biological medicine.This study discusses the key problems in actual operation and daily maintenance of this equipment in botany research and provides a good reference for its users and managers,which can improve the use ful efficiency of the equipment for teaching and research in universities.

two-photon laser scanning confocal microscope;fluorescence;image

Q-336

B

1002-4956(2015)4-0044-03

2014-012-25修改日期：2015-01-04

蘭州大學(xué)實驗技術(shù)創(chuàng)新基金項目(234820911)資助

管利萍(1971—),女,甘肅蘭州,碩士,實驗師,主要從事雙光共聚焦顯微鏡的操作與管理.

E-mail:guanlp＠lzu.edu.cn