HPLC法測定生姜半夏湯單煎與合煎中6-姜酚和6-姜醇含量

劉蕓,王珂佳,黃鍇,莫正昌

(1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2.貴州輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化工系，貴州 貴陽 550025；3.貴州理工學(xué)院 干部科，貴州 貴陽 550003)

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HPLC法測定生姜半夏湯單煎與合煎中6-姜酚和6-姜醇含量

劉蕓1,王珂佳2,黃鍇3,莫正昌1

(1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2.貴州輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化工系，貴州 貴陽 550025；3.貴州理工學(xué)院 干部科，貴州 貴陽 550003)

目的 HPLC法測定生姜半夏湯單煎液與合煎液中6-姜酚、6-姜醇的含量變化。方法 采用Amethyst C18-P柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇 -水(60:40)為流動相，檢測波長281 nm，流速0.9 mL/min，柱溫25 ℃。結(jié)果 6-姜酚、6-姜醇在合煎液中含量均明顯高于單煎液。結(jié)論 生姜半夏湯使用時應(yīng)采用合煎的方式制備，否則會降低6-姜酚、6-姜醇浸出的含量，影響生姜半夏湯的藥效。

生姜半夏湯；6-姜酚；單煎；合煎；6-姜醇；含量測定

生姜與半夏是我國兩味傳統(tǒng)止嘔藥材，2者互為君輔，可構(gòu)成生姜半夏湯和小半夏湯兩種傳統(tǒng)止嘔方劑，2種方劑組成相同，只是劑量有差別。小半夏湯半夏劑量較高，而生姜半夏湯生姜劑量較高，2者都具有止嘔功效，但2者側(cè)重點(diǎn)不一樣。經(jīng)藥理學(xué)研究證明， 生姜半夏湯和小半夏湯2種方劑起到止嘔作用的主要藥材為生姜，姜有抗炎、解熱、鎮(zhèn)吐、鎮(zhèn)痛、抗心衰、促進(jìn)膽汁分泌等藥理活性[1-3]，被應(yīng)用于生產(chǎn)抗暈、止嘔藥物[4-5]，主要化學(xué)成分為揮發(fā)油、姜辣素類化合物[5-7]，其中起到止嘔功效的活性物質(zhì)為姜酚、姜醇類[8]。

中藥是中華傳統(tǒng)瑰寶，中藥飲片煎劑更是華夏幾千年文明在醫(yī)療實(shí)踐中的體現(xiàn)，在不斷的實(shí)踐和使用過程中積累了非常豐富的理論基礎(chǔ)，其療效明確，迄今仍是中醫(yī)用藥的主要劑型。但其藥理作用及藥物相互作用復(fù)雜。其中一味藥方單獨(dú)煎煮或者合煎，其藥效可能會產(chǎn)生巨大變化。本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取，HPLC 法檢測，研究了生姜半夏湯單煎與合煎液中主要有效成分6-姜酚、6-姜醇煎出量的變化，為生姜半夏湯顆粒劑的研制方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為研究中藥復(fù)方配伍變化提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 Agilent110高效液相色譜儀(美國Angilent公司，四元梯度泵，手動進(jìn)樣)；HMC-WS10(韓國Human 公司)；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器公司)；RE52-05旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化yiqichang)；AR1530電子天平(美國Ohaus公司)；20kHz超聲波發(fā)生器；6-姜酚對照品(上海一基生物技術(shù)有限公司，批號：241200706)；6-姜醇(日本和光純藥株式會社，批號：20020911)；半夏(產(chǎn)地貴州銅仁，經(jīng)梁玉勇教授鑒定為天南星科植物半夏PinelLiaternata(Thunb.) Breit. 的干燥塊莖)；生姜(產(chǎn)地貴州銅仁，經(jīng)梁玉勇教授鑒定為姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.新鮮根莖)。

1.2 方法

1.2.1 測定波長的選擇：采用紫外區(qū)全波長掃描的方法，對6-姜酚和6-姜醇的最大吸收波長進(jìn)行研究。

1.2.2 色譜條件：色譜柱：Amethyst C18-P柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：甲醇-水(60:40)，檢測波長：281 nm;流速:0.9 mL/min，柱溫：25 ℃進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.3 方法學(xué)研究

① 對照品溶液的制備 精密稱取6-姜酚7.52 mg，6-姜醇1.43 mg。甲醇溶解后移至50 mL容量瓶中，甲醇定容。即配成6-姜酚和6-姜醇對照品儲備液。

② 線性關(guān)系的考察 分別精密量取6-姜酚和6-姜醇對照品貯備液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL，置于10 mL量瓶，甲醇定容。進(jìn)樣20 μL測定。以6-姜酚、6-姜醇標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度X對色譜峰面積Y進(jìn)行線性回歸，得6-姜酚、6-姜醇化合物的線性回歸方程。

③ 精密度試驗(yàn) 取同一濃度對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，計算RSD值。

④ 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 對同一提取液，按 “2.3.2”項(xiàng)下所述制備樣品。5 份樣品溶液，測定峰面積，計算RSD。

⑤ 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品溶液于室溫下0、1、2、4、6、8 h 分別進(jìn)樣，測定峰面積，計算RSD。

⑥ 回收率試驗(yàn) 6-姜酚、6-姜醇分別精密量取同一水煎液樣品各6份，其中5份分別精確加入對照品，另一份作為測定本底值樣品用，各份均按上述色譜條件測定HPLC值，計算回收率。

1.2.4 生姜單煎液的制備：稱取生姜0.6 g，甲醇60 mL，于67 ℃超聲提取1 h。補(bǔ)足損失，離心，即得生姜單煎液。

1.2.5 半夏單煎液的制備：稱取半夏0.3 g，甲醇30 mL，于67 ℃超聲提取1 h。補(bǔ)足損失，1000 r/min離心5 min，即得0.3 g半夏單煎液；可同法制備0.4 g半夏單煎液；半夏0.6 g單煎液；半夏0.9 g單煎液；半夏1.2 g單煎液。

1.2.6 生姜半夏合煎液的制備：按處方比例準(zhǔn)確稱取生姜0.6 g，半夏0.3 g待用。于回流裝置中加入甲醇90 mL，于67 ℃回流提取1 h。補(bǔ)足損失，離心，即得生姜半夏6:3合煎液；稱取生姜0.6 g，半夏0.4 g，按上述方法操作，即得生姜半夏6:4合煎液；稱取生姜0.6 g，半夏0.6 g，按上述方法操作，即得生姜半夏6:6合煎液；準(zhǔn)確稱取生姜0.6 g，半夏0.9 g，按上述方法操作，即得生姜半夏6:9合煎液；準(zhǔn)確稱取生姜0.6 g，半夏1.2 g，按上述方法操作，即得生姜半夏6:12合煎液。

1.2.7 供試品中各成分含量測定：精密吸取各煎液50 mL，置150 mL分液漏斗中，加入等量石油醚，萃取3次，取甲醇層，過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。取20 μL進(jìn)樣測定。

1.2.8 生姜半夏湯的單煎與合煎對6-姜酚和6-姜醇溶出量影響的單因素考察：按照1.2.6項(xiàng)下的方法進(jìn)行試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 測定波長的選擇 2者均在281 nm處呈現(xiàn)最大吸收，因此確定在281 nm處進(jìn)行測定。見圖1。

圖1 6-姜酚和6-姜醇的全波長掃描圖Fig.1 Full wavelength scan map of 6- gingerol and 6-shogaol

2.2 6-姜酚和6-姜醇的高效液相色譜圖 理論踏板大于4000，在“1.2.2”條件下的6-姜酚、6-姜醇分離良好，見圖2。且生姜半夏湯中，6-姜酚、6-姜醇與其他組分的分離度均大于1.5，見圖3。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品6-姜醇、6-姜酚的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of 6- gingerol,6- shogaol reference substance

圖3 生姜半夏湯6-姜醇、6-姜酚的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of 6- gingerol,6- shogaol of ginger pinellia decoction

2.3 線性關(guān)系的考察 6-姜酚在1.504 μg/mL～24.064 μg/mL有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=5.38400X-1996，r=0.9997；6-姜醇在0.286 μg/mL～4.576 μg/mL有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=2.37900X-1203.3，r=0.9998 。

2.3.1 精密度試驗(yàn)：6-姜酚RSD為1.42 %，6-姜醇RSD為1.31%。表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)：5份樣品溶液，測定峰面積，計算RSD，6-姜酚為1.73%，6-姜醇為1.30%。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)：6-姜酚為2.00%，6-姜醇為1.47 %。結(jié)果表明，樣品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 回收率試驗(yàn)：6-姜酚本底值為1557 μg，6-姜醇為347 μg，結(jié)果6-姜酚平均回收率97.97%，RSD為1.01%。6-姜醇平均回收率100.86%，RSD為0.35%。

2.4 生姜半夏湯的單煎與合煎對6-姜酚和6-姜醇溶出量影響的單因素考察 生姜半夏湯的單煎與合煎對6-姜酚和6-姜醇溶出量影響的單因素考察，見表1。分析表明合煎生姜半夏湯中6-姜酚和6-姜醇溶出量要比單煎的溶出量高。

表1 不同煎煮6-姜酚、6-姜醇測定結(jié)果(n=10)Tab.1 The determination results of 6- gingerol,6- shogaol by different decocting method(n=10)

3 討論

本文中使用的生姜半夏湯單煎與合煎所用藥材為同批藥材，供試品的處理方法平行進(jìn)行，采用加熱超聲提取，這樣便于提高提取效率。在方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，其結(jié)果專屬性強(qiáng)、線性關(guān)系好、穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好、精密度高、回收率高，這都表明測量生姜半夏湯中6-姜酚和6-姜醇含量的方法良好。

比起單煎，生姜與半夏配來合煎，6-姜酚和6-姜醇的煎出量均發(fā)生了明顯的變化，合煎后煎煮液中6-姜酚和6-姜醇的含量均比單煎時所得含量有明顯提高。結(jié)果顯示，合煎與單煎的比值隨著生姜與半夏的比例變化而變化，6-姜酚和6-姜醇的溶出率呈現(xiàn)類似于拋物線規(guī)律變化。6:4配伍合煎時，6-姜酚和6-姜醇的溶出量達(dá)到峰值。分別是單煎時的1.19倍、1.10倍。我們認(rèn)為，生姜半夏合煎液中6-姜酚和6-姜醇含量的提高可能是因?yàn)楹霞暹^程生姜和半夏某些成分間可能存在著助溶作用或者幫助其脫離植物體，從而提高兩者的溶出率，是否有其他原因，有需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明生姜和半夏合煎優(yōu)于單煎。就6-姜酚和6-姜醇含量為指標(biāo)而言，生姜半夏湯中藥免煎顆粒劑的制備應(yīng)采用生姜與半夏合煎的方式，且比例最好是接近于6：4，這樣可以大大地提高6-姜酚和6-姜醇的含量，節(jié)省半夏的用量。

近些年來，中藥免煎顆粒劑由于其使用和攜帶方便被醫(yī)療界廣泛使用，同時爭議之聲也不斷喧漲。畢竟中藥成分復(fù)雜，各種藥物相互作用相互影響。單就生姜半夏在單煎與合煎時有顯著性差異，且是合煎的溶出度高于單煎，這說明半夏與生姜合煎有利于6-姜酚、6-姜醇的溶出，若只從6-姜酚、6-姜醇的單體含量方面看合煎優(yōu)于其單煎。但是，中藥復(fù)方的復(fù)雜之處在于其并不是一個或幾個單體的簡單相加。在研究單煎和合煎問題時， 不能夠簡單地以某幾個指標(biāo)性成分來定論。 而應(yīng)該從復(fù)方整體布局，宏觀分析，并結(jié)合藥效學(xué)、藥理學(xué)等相關(guān)學(xué)科， 綜合評價單煎和合煎孰優(yōu)孰劣，還需對生姜半夏湯不斷深入研究。

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(編校：王冬梅)

Determination of 6-gingerol and 6-shogaol in ginger pinellia decoction of different decoction by HPLC

LIU Yun1,WANG Ke-jia2,HUANG Kai3,MO Zheng-chang1

(1.Pharmacy College, Tongren Polytechnic College, Tongren 554300, China; 2.Department of Chemical Engineering, Guizhou Light Industry Technical College, Guiyang 550025, China; 3.Department of Cadre, Guizhou Institute of Technology, Guiyang 550003, China)

ObjectiveTo determine the content of 6-gingerol and 6-shogaol in separately decocted and mingly decocted ginger pinellia decoction by HPLC.MethodsThe samples were separated on Amethyst C18-P (4.6 mm×250 mm，5 μm) column. The mobile phase was methanol-water(60:40) at the flow rate of 0.9 mL/min. The detection wavelength was 281 nm.The column temperature was 25 ℃.ResultsThe content of 6-gingerol and 6-shogaol in separately decocted obviously less than that in mingly decocted ginger pinellia decoction.ConclusionGinger pinellia decoction should be used mingly decocted. Otherwise, it will reduce the contents of 6-gingerol and 6-shogaol , affect the efficacy of ginger pinellia decoction.

ginger pinellia decoction; 6-gingerol; 6-shogaol; single-decoction;mixed-decoction;determination

劉蕓，女，碩士，講師，執(zhí)業(yè)藥師，研究方向：天然藥物提取，E-mail：yun4028@sina.com。

R286.02

A

1005-1678(2015)02-0168-03