洛伐他汀生物合成途徑中酰基轉(zhuǎn)移酶LovD的活性機(jī)制研究

于靖,曹緒芬,王佳旺,廉錚,趙晨

(1.河北省滄州市中心醫(yī)院 心血管內(nèi)一科，河北 滄州 061000；2.河北省人民醫(yī)院 婦科，河北 石家莊 310014)

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洛伐他汀生物合成途徑中?；D(zhuǎn)移酶LovD的活性機(jī)制研究

于靖1,曹緒芬1,王佳旺1,廉錚1,趙晨2

(1.河北省滄州市中心醫(yī)院 心血管內(nèi)一科，河北 滄州 061000；2.河北省人民醫(yī)院 婦科，河北 石家莊 310014)

目的 將突變前后的蛋白進(jìn)行分子動力學(xué)模擬，從而探討?；D(zhuǎn)移酶LovD活性提高的原因。方法 對酰基轉(zhuǎn)移酶的平面結(jié)構(gòu)進(jìn)行擬合，通過底物通道NVR2.1計算軟件得到LovD的主要底物，在酶活性測定過程中計算均方根偏差(root mean square deviation，RMSD)和勢能、G0和G5的均方根波動(root mean square fluctuation,RMSF)數(shù)值、主要α螺旋區(qū)域I與通道周圍其他螺旋區(qū)域的距離等指標(biāo)。結(jié)果 RMSD和勢能的計算結(jié)果表明，疊合后的蛋白結(jié)構(gòu)組成并沒有發(fā)生較大的變換；G0和G5的RMSD數(shù)值比較表明，G0和G5整體的運(yùn)動沒有發(fā)生較大的變化；G0和G5的RMSF數(shù)值比較表明，4個局部柔性峰值微弱變化區(qū)域和1個柔性變化較大的區(qū)域；通過底物通道計算軟件得到LovD主要的4條底物通道，α螺旋區(qū)域I是形成通道的核心螺旋區(qū)域；比較G0和G5的主要通道的寬度、長度、彎曲率等數(shù)值，突變后G5的主要通道變寬、變短、彎曲率變?。籊5的距離變大。結(jié)論 遠(yuǎn)距離的突變使得LovD活性提高是由于α螺旋I末端的柔性變化，導(dǎo)致α螺旋I的運(yùn)動的變化，使得在α螺旋I附近底物通道變短、變寬、彎曲率減小。這些變化可能降低了底物進(jìn)出主要通道的阻力，使得參與酶催化的底物在通過這些通道的時候的速率加快，從而使得催化效率提高。

酰基轉(zhuǎn)移酶；LovD；洛伐他汀；酶活性；動力學(xué)模擬

自然界中他汀類化合物有洛伐他汀和康帕克汀，洛伐他汀主要由真菌土曲霉(aspergillus terreus)模式菌株產(chǎn)生，而康帕克汀由橘青霉(penicillium citrinum)菌株產(chǎn)生。在洛伐他汀的生物合成途徑中，大部分的合成編碼基因都比較清楚，而基因LovD 編碼2-mehtylbutyryl/MJA(monacolin J acid，形成洛伐他汀的前體化合物)的轉(zhuǎn)移酶催化最后一步，使得從LovF 過來的?；糠峙c加載到MJA 上C8的位置，最后生物合成為洛伐他汀[1]。在這一過程中，LovD 和LovF 的?；d體區(qū)域(acyl carrier protein，ACP)的蛋白-蛋白的相互作用使得這一最后一步反應(yīng)在土曲霉中高效進(jìn)行[2]。傳統(tǒng)的他汀類化合物生產(chǎn)工藝是以洛伐他汀為原料，經(jīng)化學(xué)合成得到。隨著現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，洛伐他汀的生物合成受到越來越多的重視，?；D(zhuǎn)移酶LovD是洛伐他汀的生物合成中一個重要酶，所以研究?；D(zhuǎn)移酶LovD活性對提高洛伐他汀的生物合成具有重要的意義,底物通道中G0和G5是影響活性的重要通道。本研究將突變前后的蛋白進(jìn)行分子動力學(xué)模擬，從而探討?；D(zhuǎn)移酶LovD活性提高的原因。

1 材料與方法

1.1 材料 LovD突變前后的?；D(zhuǎn)移酶，購買于深圳市博谷網(wǎng)絡(luò)科技有限公司，批號為ZL110619。

1.2 方法 對酰基轉(zhuǎn)移酶的平面結(jié)構(gòu)進(jìn)行擬合，通過底物通道NVR2.1計算軟件得到LovD主要的底物，在酶活性測定過程中計算RMSD和勢能、G0和G5的RMSF數(shù)值(G0和G5通道中輸入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的數(shù)目為a、b 是通道的平均半徑[?]、c是通道的最大位置處的半徑[?]、d為 通道的平均長度[?]、e為通道平均彎曲率)、主要α螺旋區(qū)域I與通道周圍其他螺旋區(qū)域的距離等指標(biāo)。

1.3 洛伐他汀的生物合成途徑，見圖1[3]。

圖1 洛伐他汀的生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis of lovastatin

2 結(jié)果

2.1 ?；D(zhuǎn)移酶LovD 分子動力學(xué)計算 在蛋白質(zhì)I末端區(qū)域柔性發(fā)生了明顯的變化：通過比較G0和G5的α原子均方根波動(root mean square fluctuation，RMSF)發(fā)現(xiàn)氨基酸區(qū)域的柔性變化位置并且柔性變化位置的氨基酸結(jié)構(gòu)變化性較大。為了更加清楚RMSF變化區(qū)域所在的位置，將LovD主要α螺旋區(qū)域和β 折疊區(qū)域分別用大寫英文字母A～N標(biāo)記顯示，如圖2，每一段區(qū)域分別用一個字母所代替[3]。

在β折疊區(qū)域K(1)、loop區(qū)域K-B(2)，β折疊區(qū)域L(3)，G0 的波動稍大于G5，在β折疊區(qū)域M(4)，G5的波動稍稍大于G0。而在α螺旋區(qū)域I 末端(5)有明顯的波動變化，并且G5 的波動小于G0 的波動。6個突變的位點并不在有波動的區(qū)域，引起這樣的結(jié)果可能是突變后，氨基酸殘基的之間的相互作用發(fā)生變化。見圖3。

圖2 LovD 主要α螺旋區(qū)域和β折疊區(qū)域的標(biāo)記Fig.2 Main α-helix domain and LovD regional andβ folded tag

圖3 G0和G5的α碳原子均方根波動(上線：G0；下線：G5)Fig.3 RMS fluctuation of alpha carbon atoms in G0 and G5

通過以上結(jié)構(gòu)的分析和比較，發(fā)現(xiàn)這6個位點的突變并沒有明顯改變整體的蛋白結(jié)構(gòu)，但是，G5 的活性口袋張開幅度減小，即活性口袋變小，口袋變小可能導(dǎo)致底物與酶的結(jié)合能力發(fā)生變化，可能是影響酶催化活性變化的一個原因，本研究認(rèn)為這不是主要的原因。因此，將分析的重點放在在蛋白質(zhì)I區(qū)域末端，可以發(fā)現(xiàn)G5的均方根波動(RMSF)明顯降低，認(rèn)為這個區(qū)域?qū)ovD的酶催化活性有著很重要的影響，G5的活性提高與這個區(qū)域的氨基酸運(yùn)動有很大關(guān)系。

G5 的柔性減小的區(qū)域I末端處在活性中心附近：通過前面的計算和分析發(fā)現(xiàn)，區(qū)域I末端對LovD有至關(guān)重要的影響，可能是引起催化活性變化的主要氨基酸位置，因此，為了更好地研究蛋白質(zhì)區(qū)域I末端部分的氨基酸與底物的相互關(guān)系，本研究對原始晶體結(jié)構(gòu)的底物蛋白相互作用進(jìn)行分析。在α 螺旋區(qū)域I末端是一段loop區(qū)域，并且這段區(qū)域靠近活性中心，圖3顯示位于活性中心的底物MJA靠近柔性變化I末端區(qū)域。位于活性中心區(qū)域的氨基酸由于直接與底物發(fā)生相互作用，將直接影響酶催化的活性。

2.2 對LovD的底物通道的分析 LovD 突變后的主要通道的變化：為了進(jìn)一步研究G0和G5的通道的特性，通過分析和比較G0和突變后G5主要通道的平均半徑、最大半徑、長度、彎曲率。表1顯示，G0和G5的通道，除了3c，其他3個主要通道的平均半徑(Avg_BR)與最大半徑(Max_BR)增大了，在表格中箭頭標(biāo)示增大趨勢，表明小分子底物進(jìn)入反應(yīng)活性中心的阻力將減??；主要通道的長度(Avg_L)也變短，并且通道的彎曲率(Avg_C)也減小，在表格中箭頭標(biāo)示下降趨勢，表明長度越短小分子底物將在通道中的時間縮短，而彎曲率的降低表明小分子底物進(jìn)入活性中心的阻力也將降低。

表1 G0 和G5 的通道特性的比較Tab.1 Comparison of the characteristics of G0 and G5 channel

注：a大于等于0.9?通道的輸入蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的數(shù)目、b通道的平均半徑[?]、c通道的最大位置處的半徑[?]、d通道的平均長度[?]、e通道平均彎曲率

從上面的分析可以看出，突變后的LovD(G5)主要通道變寬且變長，并且彎曲率也有所降低，由于這些通道特征值的改變，使得小分子在通過通道進(jìn)入酶活性中心時與通道間的作用發(fā)生改變，小分子進(jìn)入活性中心的阻力變小，小分子進(jìn)入活性中心更加容易，這可能是G5產(chǎn)量提高的原因，而G0和G5的通道3c并沒有發(fā)生上述變化，很有可能是與其他3個底物通道相區(qū)別的底物通道，即通過3c通道的底物與通過通道1a、2b、4d的底物是不同的。因此，提出假設(shè)，對于LovD本研究認(rèn)為底物MJA是首先進(jìn)入到活性中心的，然后參與反應(yīng)。因此，在排除其他因素的條件下，通過計算出來并根據(jù)通道理論得出的結(jié)論是，影響反應(yīng)速率的關(guān)鍵是DMB-SMMP進(jìn)入到活性中心的速率。

LovD主要是α螺旋區(qū)域的運(yùn)動導(dǎo)致了通道的變化：為了更進(jìn)一步分析主要通道變化的過程，分別計算了G0和G5的主要α螺旋區(qū)I和B、I和J域隨時間的距離變化，G0和G5I-B的距離的變化。G0的α螺旋區(qū)I和B的隨時間的變化與G5有微弱差別，但是，α螺旋區(qū)域I和J隨時間的變化有較大的差別，G5的α螺旋區(qū)I和J的距離比G0距離較大，而α螺旋區(qū)I和J是形成通道2b的主要螺旋區(qū)域，α螺旋區(qū)I和B是形成通道1a和4d(2條通道被一段loop區(qū)域隔開)的主要螺旋區(qū)域。因此，α螺旋區(qū)I、B和J區(qū)域是通道產(chǎn)生變化的直接原因。

3 討論

本研究結(jié)合蛋白質(zhì)的通道理論進(jìn)行分子動力學(xué)模擬來解釋酰基轉(zhuǎn)移酶LovD突變引起酶催化效率的改變。通常酶底物通過蛋白質(zhì)的表面或者內(nèi)部的通道進(jìn)入活性心，對酶催化效率也起著至關(guān)重要的作用[4-7]。通過以上計算和分析，本研究對一個全新的突變引起催化效率改變的原因并作出了合理的解釋和闡明。首先，遠(yuǎn)離酶活性中心的氨基酸突變導(dǎo)致酶活性變化的解釋本身是一個難點，其次，這樣的突變引起的變化也是一個復(fù)雜的變化[8-10]。本文通過動力學(xué)的方法結(jié)合蛋白質(zhì)通道分析，發(fā)現(xiàn)這樣的突變結(jié)果并沒有引起?；D(zhuǎn)移酶LovD蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和組成的變化，也并沒有引起蛋白質(zhì)整體運(yùn)動的變化[11]，但是，找到了遠(yuǎn)離活性中心的多位點的氨基酸突變導(dǎo)致活性變化的一個原因：突變后的LovD的某一局部柔性發(fā)生較大的變化[12]，導(dǎo)致靠近這一區(qū)域的α螺旋區(qū)域的運(yùn)動變化，使得以蛋白質(zhì)α螺旋區(qū)域形成的主要通道的長度變短、平均半徑變大、彎曲率降低等[13-16]。因此提出假設(shè)：這些通道特性的變化，降低了底物進(jìn)出主要通道的阻力，使得參與酰基轉(zhuǎn)移酶催化的底物在通過這些通道時的速率加快，使得催化效率提高。這一計算的研究發(fā)現(xiàn)，為解釋酶催化效率的提高提供了新的可能性，也將為酶催化設(shè)計提供可靠的指導(dǎo)依據(jù)。。

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(編校：王冬梅)

Catalytic activity mechanism study of acyltransferase LovD in biosynthesis of lovastatin

YU Jing1,CAO XU-fen1,WANG Jia-wang1,LIAN Zheng1,ZHAO Chen2

(1.Cardiovascular Internal Medicine, Cangzhou Central Hospital, Cangzhou 061000, China; 2.Department of Gynaecology, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 310014,China)

ObjectiveTo explore the reasons for the increase of acyltransferase activity of LovD by molecular dynamics simulation of before and after mutation protein.MethodsThe planar structure of acylase were fitted, the main substrate LovD through the substrate channel NVR2.1 calculation, calculation of RMS deviations(root mean square deviation, RMSD) and potential energy in the determination of enzyme activity, root mean square fluctuation (RMSF) value of G0 and G5, mainlyα helical region I and channel around other helical region distance index.ResultsThe results showed that the calculation of RMSD and potential energy, consisting of protein structure after superposition which there were no great transformation; G0 and G5 RMSD numerical comparison showed that the whole movement of G0 and G5 had not changed; G0 and G5 RMSF numerical comparison showed that the 4 local flexible peak weak change in area and 1 flexible change in the larger region; LovD 4 major channels were calculated by substrate channel calculation software, αhelical region I was the core of helical region formed channel; comparison of G0 and G5 values of the main channel of width, length, bending rate, the main channel of the G5 mutation become wider, shorter, bending rate become smaller; G5 distance enlarged.ConclusionConclusion Distant mutation which increases the LovD activity is due to the flexible change α helical I end, lead to changes in motion αhelical I, makes the α helix I near the substrate channel becomes short and wide, bending rate decreasing. These changes may reduce main channel resistance in and out the substrate, that participate in enzyme catalyzed substrate to accelerate rate through these channels, thereby improving catalytic efficiency.

acyltransferase; LovD; lovastatin; enzyme activity; dynamics simulation

浙江衛(wèi)生廳(2012KYB010)

于靖，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：心血管內(nèi)科方向，E-mail：yj12114@163.com。建議方法和結(jié)果也按照這個順序?qū)憽?/p>

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1005-1678(2015)02-0096-04