促紅細(xì)胞生成素對(duì)外傷性顱腦損傷大鼠神經(jīng)絲的保護(hù)作用

劉健,高佳星,汪葉松

(1.四川省綿陽市人民醫(yī)院 腦外科，四川 綿陽 621000；2.四川省綿陽市人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，四川 綿陽 621000；3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 腦外科，浙江 杭州 310000)

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促紅細(xì)胞生成素對(duì)外傷性顱腦損傷大鼠神經(jīng)絲的保護(hù)作用

劉健1,高佳星2,汪葉松3

(1.四川省綿陽市人民醫(yī)院 腦外科，四川 綿陽 621000；2.四川省綿陽市人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，四川 綿陽 621000；3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 腦外科，浙江 杭州 310000)

目的 觀察促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin EPO)對(duì)創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)大鼠腦皮質(zhì)中神經(jīng)絲的影響，并探討其意義。方法 45只Wistar大鼠按隨機(jī)原則分為9組，正常對(duì)照組、顱腦損傷組(各組于建模后6、12、24、72 h取標(biāo)本)，EPO處理組(各組于建模后6、12、24、72 h取標(biāo)本)，每組5只，采用Myneurolab腦立體定向儀和Benchmark顱腦損傷撞擊器制作創(chuàng)傷性顱腦損傷模型。應(yīng)用免疫組化法觀察上述時(shí)間點(diǎn)損傷灶周圍皮層神經(jīng)絲的形態(tài)改變，Western blot檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)中神經(jīng)絲蛋白H(neurofilament H，NF-H)的表達(dá)變化。結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示：正常對(duì)照組NF-H含量豐富，呈棕黃色絲狀結(jié)構(gòu)，在腦皮質(zhì)的大椎體細(xì)胞層、小椎體細(xì)胞層，海馬區(qū)，胼胝體中表達(dá)尤為明顯，而顱腦損傷組于腦外傷后6 h見NF-H較正常組稀疏，部分結(jié)構(gòu)中斷，6～24 h內(nèi)可見神經(jīng)絲數(shù)目進(jìn)一步減少，排列紊亂加重，至24 h破壞程度達(dá)到高峰，72 h時(shí)上述情況有所緩解，外傷后EPO處理組神經(jīng)絲數(shù)量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均比外傷組多，且排列較外傷組整齊。神經(jīng)絲的密集程度在12 h達(dá)到高峰，然后逐漸降低。Western blot顯示：與正常組相比，顱腦損傷組損傷后 6h可見 NF-H 的表達(dá)減少(P<0.05)。6～12 h內(nèi)NF-H蛋白表達(dá)持續(xù)減少(P<0.05)，24 h 后達(dá)最低值(P<0.01)，72 h時(shí)升高(P< 0.05)。但與顱腦損傷各組比較，EPO處理組NF-H的表達(dá)升高(P<0.05)。結(jié)論 EPO對(duì)腦具有保護(hù)作用，其可能機(jī)制為抑制神經(jīng)絲蛋白降解。

促紅細(xì)胞生成素；創(chuàng)傷性腦損傷；神經(jīng)絲

顱腦損傷發(fā)生率居高不下，目前護(hù)腦藥物療效不確切，尋找新的治療藥物成為當(dāng)務(wù)之急[1]。神經(jīng)絲三聯(lián)蛋白NF-L，NF-M，NF-H，是神經(jīng)細(xì)胞的骨架蛋白，對(duì)于維持神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，軸漿運(yùn)輸?shù)确矫嬗兄匾饔?。神?jīng)細(xì)胞骨架在腦損傷后15 min即可在損傷灶同側(cè)及對(duì)側(cè)檢測(cè)到有輕微的形態(tài)改變，并在24 h內(nèi)降解逐漸加重[2]。通常在腦損傷后，三聯(lián)蛋白中神經(jīng)絲蛋白H(neurofilament H，NF-H)的降解最為嚴(yán)重，因此常將其作為評(píng)價(jià)早期腦損傷程度的標(biāo)志物[3]。近年來，多項(xiàng)細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)可以減輕腦損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但其保護(hù)機(jī)制尚未完全明確[4]。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)等多處研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證EPO能否減輕顱腦損傷以及幫助患者獲得康復(fù)[5]。對(duì)于EPO的腦保護(hù)作用的研究多有報(bào)道[6-10]，腦損傷后神經(jīng)絲降解這一重要的病理生理機(jī)制的論述也常見，而對(duì)于EPO對(duì)神經(jīng)絲的保護(hù)作用及其機(jī)制卻鮮有研究。因此，本文旨在觀察促紅細(xì)胞生成素對(duì)創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)大鼠腦皮質(zhì)中神經(jīng)絲的影響，并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)健康雄性Wistar 大鼠45只，8周齡，體質(zhì)量(220±20)g，許可證號(hào)2003-0004，由湖北省疾控中心提供。按隨機(jī)原則分為9組，正常對(duì)照組、顱腦損傷組(各組于建模后6、12、24、72 h取標(biāo)本)，EPO處理組(各組于建模后6、12、24、72 h取標(biāo)本)，每組各5只，本實(shí)驗(yàn)遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》。

1.2 主要儀器及耗材 大鼠腦立體定向儀，電動(dòng)顱鉆、BenchmarkTM電磁顱腦損傷撞擊器(美國(guó)Myneurolab公司)；明膠海綿、骨蠟(武漢大學(xué)人民醫(yī)院)；LS-50HJ不銹鋼壓力鍋(廣州罡然機(jī)電設(shè)備有限公司)；MSE微量電子天平(上海亞津電子科技有限公司)；GT10-1臺(tái)式高速離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)；DZF-6050干燥箱(北京北方利輝試驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司)；GSS/DSS不銹鋼切片架(北京桑翌實(shí)驗(yàn)儀器研究所)；YD-202A切片機(jī)(廣州晟龍實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；OLYMPUS BX51顯微鏡(上海澤仕光電科技有限公司)；水浴箱(常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司)；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)(深圳市超杰實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；電化學(xué)發(fā)光(ECL)系統(tǒng)(美國(guó)Pierce公司)。

1.3 主要試劑 EPO[沈陽三生制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字(2000)沈三生s-01號(hào)]；NF-H 鼠抗人多克隆抗體(Santa Cruz公司，sc-56575)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠二抗、SP 試劑盒、DAB 顯色試劑盒(武漢博士德)；GAPDH(Santa Cruz 公司)；4%多聚甲醛、PBS液(武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)；胰蛋白酶(美國(guó)Amresco公司)。

1.4 方法 顱腦損傷模型的建立[11]：將實(shí)驗(yàn)大鼠在室溫(23±2) ℃，濕度60%～80%的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d，用新配制的10%水合氯醛(4 mL/kg體質(zhì)量) 腹腔注射麻醉，俯臥位，頭部固定于腦立體定向儀上，沿中線剪開頭皮，暴露右頂骨，用牙科鉆在冠狀縫后 1.5 mm、矢狀線旁2.5 mm處鉆孔并擴(kuò)大為一直徑5 mm骨窗，注意保持硬腦膜完整。正常對(duì)照組骨窗造好后用骨蠟封閉，然后縫合頭皮。顱腦損傷組用同樣方法制造骨窗，然后用BenchmarkTM電磁顱腦損傷撞擊器撞擊硬腦膜(深度為2.0 mm，撞擊面直徑2.0 mm，撞擊速度為4 m/s)，致右頂葉腦挫裂傷，保持硬腦膜完整，骨蠟封閉骨窗。造模好后供給飼料和飲水，分籠飼養(yǎng)。

EPO處理組如上方法造模成功后10 min，大鼠腹腔注射EPO，劑量為5000 U/kg，然后分籠飼養(yǎng)，常規(guī)供給飼料和飲水。

術(shù)后未見死亡大鼠，外傷后6、12、24、72 h時(shí)間段處死大鼠5只，取大鼠腦組織。

1.5 檢測(cè)指標(biāo) Western blot檢測(cè)NF-H的表達(dá)：將組織樣品按每10 mg組織加入 50 μL裂解液的比例加入裂解液，用玻璃勻漿器在冰浴中勻漿，直至組織充分裂解。裂解后10000 r/min 4 ℃ 離心5 min，取上清。取適量上清加入5×SDS loading buffer，沸水煮5～10 min 冷卻至室溫后上樣電泳。分別配制8%和12%的PAGE膠，各樣品取等量上樣電泳。GAPDH用12%的PAGE 膠；NF-H 用8%的PAGE分離膠。80 V電壓開始電泳，待溴酚藍(lán)跑過積層膠后將電壓升高至120 V，根據(jù)預(yù)染marker顯示，判斷目的蛋白充分分離后，停止電泳。以同一樣品中各目的蛋白OD值/GAPDH OD值的比值作為檢測(cè)蛋白的相對(duì)含量。用 Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖象分析。

免疫組化法觀察NF-H的表達(dá)：把本實(shí)驗(yàn)中固定好的的腦部石蠟切片置于65 ℃烘箱中，烘片2 h，脫蠟至水，用 PBS(pH7.4)沖洗3次，每次5 min；高壓熱修復(fù)；室溫下孵育；甩去PBS液，一抗1:200濃度稀釋，4 ℃過夜；甩去PBS液，用的二抗，濃度1:200每張切片加50～100 μL稀釋液，室溫下孵育30～60 min；顯色；自來水沖洗，復(fù)染，0.1%鹽酸分化，PBS沖洗返藍(lán)；切片經(jīng)過梯度酒精(70%～100%)脫水干燥，透明，封固。PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。在200倍鏡下拍照觀察各組NF-H表達(dá)變化情況。

2 結(jié)果

2.1 NF-H的免疫組化結(jié)果 正常對(duì)照組 NF-H的免疫組化結(jié)果：NF-H在組織切片上含量豐富，呈棕黃色絲狀結(jié)構(gòu)，在腦皮質(zhì)的大椎體細(xì)胞層、小椎體細(xì)胞層，海馬區(qū)，胼胝體中表達(dá)尤為明顯。NF-H在大椎體細(xì)胞層中，大部分呈微細(xì)平行的絲狀排列，少部分交織成網(wǎng)狀(見圖1)。

圖1 正常對(duì)照組NF-H的免疫組化結(jié)果(×200)Fig.1 The immunohistochemical results of NF-H in normal control group(×200)

顱腦損傷組NF-H的免疫組化結(jié)果：腦外傷后6 h見神經(jīng)絲較正常組稀疏，部分結(jié)構(gòu)中斷，6～24 h內(nèi)可見神經(jīng)絲數(shù)目進(jìn)一步減少，排列紊亂加重，至24 h破壞程度達(dá)高峰，72 h時(shí)上述情況有所緩解(見圖2)。

圖2 大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后不同時(shí)間NF-H的免疫組化結(jié)果(×200)Fig.2 The immunohistochemical results of NF-H after traumatic brain injury at different time(×200)

EPO處理組的免疫組化結(jié)果：EPO 處理組與正常對(duì)照組相比，神經(jīng)絲數(shù)量減少。但是在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均比外傷組的數(shù)量多，且排列較外傷組整齊。神經(jīng)絲的密集程度在12h達(dá)到高峰，然后逐漸降低(見圖3)。

圖3 大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷使用EPO后不同時(shí)間NF-H的免疫組化結(jié)果(×200)Fig.3 The immunohistochemical results of NF-H after given EPO in rats with traumatic brain injury at different time(×200)

2.2 NF-H的Western blot免疫印跡結(jié)果 與對(duì)照組比較，顱腦損傷各組腦損傷后6 h即可見NF-H的表達(dá)減少(P<0.05)。6 h至12 h內(nèi)NF-H蛋白表達(dá)持續(xù)性減少，24 h 后達(dá)最低值(P<0.01)。72 h時(shí)升高，但差異仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。與顱腦損傷相同時(shí)間點(diǎn)比較，EPO處理組顯著提高了NF-H的表達(dá)(P<0.05)，見表1。

表1 Western blot檢測(cè)NF-H蛋白表達(dá)量Tab.1 The expression levels of NF-H protein detected by Western ±s)

**P<0.01，*P<0.05，與對(duì)照組比較，compared with control group；#P<0.05，與TBI組比較，compared with TBI group

3 討論

近年來，多項(xiàng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)促紅細(xì)胞生成素可以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，目前研究表明其機(jī)制可能為：減少興奮性氨基酸毒性的作用、抗氧化作用、抗炎作用、抗凋亡作用、穩(wěn)定細(xì)胞代謝、促進(jìn)血管形成等[11]。神經(jīng)絲三聯(lián)蛋白NF-L，NF-M，NF-H，是神經(jīng)細(xì)胞的骨架蛋白，對(duì)于維持神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、軸漿運(yùn)輸?shù)绕鹬匾饔?。神?jīng)絲蛋白的降解會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的崩解，信號(hào)傳導(dǎo)障礙，及神經(jīng)細(xì)胞功能紊亂，宏觀則表現(xiàn)為神經(jīng)功能的缺失。國(guó)外研究表明NC證實(shí)腦損傷后NF-H的表達(dá)量會(huì)有明顯改變[12-14]。

本實(shí)驗(yàn)將NF-H作為評(píng)價(jià)早期腦損傷的指標(biāo)。和對(duì)照組比較：免疫組化表明，腦損傷后神經(jīng)絲結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，損傷后6 h即可見神經(jīng)絲較正常組稀疏，部分結(jié)構(gòu)中斷，6～24 h內(nèi)可見神經(jīng)絲排列紊亂加重，至24 h破壞程度達(dá)到高峰；Western blot表明6、12、24、72 h各時(shí)段顱腦損傷組均較對(duì)照組NF-H量減少(P<0.01)。由此提示神經(jīng)絲在腦損傷后會(huì)發(fā)生降解，且在早期即有明顯的改變。將腦損傷組和EPO處理組比較：腦損傷使用EPO之后，神經(jīng)絲排列較外傷組整齊，神經(jīng)絲的密集程度在12 h達(dá)到高峰，然后逐漸降低；Western blot表明各時(shí)段用藥組均較外傷組NF-H數(shù)量多(P<0.05)，且在12 h和24 h更加明顯(P<0.01)。以上結(jié)果提示EPO具有保護(hù)細(xì)胞骨架抑制其降解的功能。尤其需要注意的是外傷用藥后12 h的神經(jīng)絲更加密集，神經(jīng)絲蛋白的表達(dá)量也是用藥后的最高值，表明EPO早期的腦保護(hù)作用更強(qiáng)。由于原發(fā)性腦損傷主要是由于受傷本身及傷后早期的病理生理演變所致，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)一步推測(cè)EPO通過抑制神經(jīng)絲蛋白的降解，從而對(duì)原發(fā)性腦損傷有較好的減輕作用。

本實(shí)驗(yàn)通過腦立體定向儀和電磁顱腦損傷撞擊器制作創(chuàng)傷性顱腦損傷模型，致傷部位、范圍、深度、撞擊速度等參數(shù)都進(jìn)行數(shù)字化設(shè)定，避免了常規(guī)顱腦損傷模型中的致傷程度不一致，重復(fù)性差的缺陷，較精確地模擬了臨床創(chuàng)傷性顱腦損傷的致傷特點(diǎn)，為實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。本試驗(yàn)將NF-H作為評(píng)價(jià)腦損傷程度的指標(biāo)，檢測(cè)不同的干預(yù)措施對(duì)NF-H的形態(tài)和量的改變，來評(píng)價(jià)干預(yù)措施對(duì)腦的影響。同時(shí)設(shè)定不同的觀察時(shí)間點(diǎn)，有利于進(jìn)一步明確NF-H的變化趨勢(shì)。NF-H作為評(píng)價(jià)腦損傷程度的指標(biāo)已經(jīng)被廣泛使用，敏感性好，特異性高，同時(shí)通過免疫組化檢測(cè)的圖像直觀清晰，具有其他檢測(cè)指標(biāo)無法替代的優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，創(chuàng)傷性顱腦損傷后，給予外源性EPO能抑制神經(jīng)絲降解，達(dá)到保護(hù)神經(jīng)作用。其通過何種途徑發(fā)揮抑制作用則需要進(jìn)一步研究。

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(編校：王儼儼)

Neuroprotective effect of EPO on neurofilaments in rats with traumatic brain injury

LIU Jian1,GAO Jia-xing2,WANG Ye-song3

(1.Department of Neurosurgery, Mianyang City People’s Hospital, Mianyang 621000, China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology, Mianyang City People’s Hospital, Mianyang 621000, China; 3.Department of Cerebral Surgery, The Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310000, China)

ObjectiveTo observe the erythropoietin (EPO) on neurofilaments in rats traumatic brain injury(TBI) and its significance.Methods45 Wistar rats were divided into nine groups: normal control group, brain injury(6, 12, 24, 72 h after brain injury), and EPO treatment after brain injury(6, 12, 24, 72 h after brain injury).The Myneurolab of stereotactic apparatus and the Benchmark of traumatic brain injury impactor were used to produce TBI model.The morphologic changes of neurofilament were observed by immunohistochemistry in lesion peri cortex，and the expressions of neurofilament H(NF-H) were detected by Western blot at the above time points.ResultsThe immunohistochemistry result showed that in normal control group, NF-H was abundant in tissue section with the tan filamentous structure, and existed in big cones, small cones, hippocampus, especially obvious in corpus callosum of cerebral cortex layer; in brain injury group, NF-H was sparse with part of the structure interrupted after traumatic brain injury of 6h, further nerve filament number reduced with disordered arrangement after 6～24 h, the damage reached its peak after 24 h, and the above situation eased after 72 h.The number of neurofilaments in EPO treatment group at each time point was higher than that in brain injury group after trauma, arranged neatly and the intensity of neurofilament reached the peak at 12 h, then gradually reduced.Western blot result showed that compared with normal group, the expression of NF-H reduced after traumatic brain injury of 6h (P<0.05), within 6～12 h NF-H protein expression persistent decrease (P< 0.05), reached the lowest after 24 h (P<0.01), and elevated after 72 h (P<0.05).But compared with groups of brain injury, the expression of NF - H decreased in EPO treatment group (P<0.05). Conclusion EPO has a neuroprotective effect, and its possible mechanism is to inhibit the degradation of neurofilament protein.

traumatic brain injury; erythropoietin;neurofilaments

2012年浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃(2012KYB096)

劉健，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：腦外傷，E-mail:lj1104881684@163.com。

R3

A

1005-1678(2015)02-0063-04