氟代檸檬酸對骨癌痛大鼠CB2表達的影響研究

張卉,李賓,張輝

(1.河南黃淮學院 護理學系，河南 駐馬店 463000；2.河南黃淮學院 生物工程系，河南 駐馬店 463000；3.駐馬店市中心醫(yī)院 泌尿外科，河南 駐馬店 463000)

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氟代檸檬酸對骨癌痛大鼠CB2表達的影響研究

張卉1,李賓2,張輝3

(1.河南黃淮學院 護理學系，河南 駐馬店 463000；2.河南黃淮學院 生物工程系，河南 駐馬店 463000；3.駐馬店市中心醫(yī)院 泌尿外科，河南 駐馬店 463000)

目的 研究氟代檸檬酸(fluorocitrate，F(xiàn)C)對骨癌痛大鼠CB2基因表達的影響及意義。方法 40只SD大鼠注射Walker-256腫瘤細胞，建立骨癌痛模型，另取10只SD大鼠作為假手術組，10只作為對照組。首先比較假手術組和骨癌痛大鼠熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawl latency, TWL)。再將骨癌痛大鼠隨機分為FC組和非FC組，每組20只。FC組術后14 d注射氟代檸檬酸0.01 mL(1 nmol)，非FC組注射生理鹽水0.01mL，記錄大鼠機械縮足閾值(paw withdrawl mechanical threshold,PWMT)。同時采用免疫印跡法測定CB2表達結果，觀察灰度值。結果 骨癌痛組大鼠TWL先縮短后恢復正常，假手術組基本保持不變，2者在第3 d具有統(tǒng)計學差異(P< 0.05)。FC組大鼠注射氟代檸檬酸后，PWMT值有先升高后降低現(xiàn)象。假手術組和骨癌痛組大鼠CB2均明顯高于基礎值(P< 0.05)；非FC組大鼠CB2逐漸降低，第7天和第14天時顯著高于假手術組(P< 0.05)。FC組大鼠與非FC組相比，CB2在7d時有統(tǒng)計學差異(P< 0.05)， 14 d和21 d時略低，但差異無統(tǒng)計學意義。結論 患骨癌痛后，機體CB2表達會有一定程度增加，引起疼痛，而氟代檸檬酸可抑制CB2的表達，從而緩解疼痛。

氟代檸檬酸；骨癌痛；CB2

骨癌痛是骨癌患者晚期出現(xiàn)的癥狀，疼痛較嚴重，且目前尚無有效的治療方法。大麻素是一組萜酚類化合物，其相應的受體有CB1和CB2兩種亞型，CB2主要存在于小膠質(zhì)細胞和星狀膠質(zhì)細胞中。有文獻報道[1]CB2可能與骨癌痛的發(fā)生機制有關。本研究以骨癌痛大鼠為模型，主要探討膠質(zhì)細胞抑制劑氟代檸檬酸對骨癌痛患者CB2表達的影響。以下為研究過程回顧。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗動物許可證號 選取60只健康雌性SD大鼠，體質(zhì)量150～200 g，許可證號:SCXK(蘇)2002-0037。由蘇州大學醫(yī)學院實驗動物研究中心提供。所有大鼠均在相同環(huán)境中適應5 d后用于實驗。室溫20 ℃～25 ℃，通風、光照和空氣過濾系統(tǒng)良好，能自由攝食、攝水，且遵循《實驗動物保護條例》。

1.2 材料兔抗CB2(美國Abcam 公司)，Walker-256乳腺癌細胞株( 中國上海生物醫(yī)學工程研究所)，Von Frey 纖維絲(美國Stoelting 公司) 。試劑：氟代檸檬酸、水合氯醛、鹽酸利多卡因注射液(均由上海復興藥業(yè)提供)。儀器：熱輻射刺激儀(BME-410A)；倒置顯微鏡(Olympus CKX41)。

1.3 方法 40只SD大鼠注射Walker-256腫瘤細胞，建立骨癌痛模型，另取10只SD大鼠作為假手術組，10只作為對照組。首先按Hargreaves 法驗證骨癌痛模型的可靠性，具體步驟如下：將大鼠置于透明有機玻璃箱內(nèi)，放置于鐵絲網(wǎng)架，使其自由活動。用100 W鹵素投射燈，用輻射熱刺激儀刺激的大鼠后爪，記錄大鼠出現(xiàn)縮足逃避反應的時間，重復測量3次，每8 min 1次，取其平均值，即熱縮足反射潛伏期。比較假手術組和骨癌痛大鼠熱縮足反射潛伏期。再將骨癌痛大鼠隨機分為FC組和非FC組，每組20只。FC組術后14 d注射氟代檸檬酸0.01 mL(1 nmol)。非FC組注射生理鹽水0.01 mL，觀察2組大鼠注射前、注射后1、2、4、8、12、24 h記錄大鼠機械縮足閾值。

本研究采用Von Frey纖維絲測定機械縮足閾值，將大鼠置于透明有機玻璃箱內(nèi)，放置于鐵絲網(wǎng)架，大鼠在其中可以自由活動。大鼠安靜后，以不同折力的Von Frey纖維絲刺激大鼠足底中后部，約持續(xù)6～8 s。再從0.20 g開始，按照遞增的順序依次施加Von Frey纖毛，直至大鼠出現(xiàn)縮爪。每只大鼠測定3次，每8 min測定1次，取其平均值。采用免疫印跡法測定CB2表達結果，觀察灰度值。

1.3.1 骨癌痛模型建立：大鼠腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后，直至角膜反射消失，且腳趾對有齒鑷鉗夾無反應。于大鼠背部L3-4脊髓處剪毛、消毒，作1 cm縱向切口，分離肌肉，挑破韌帶，暴露脛骨。用5 mL一次性注射針頭在脛骨處穿孔，直至提示進入髓腔。給藥時，將大鼠軀干固定，以5 μL一次性注射針頭緩慢向髓鞘注射5 μL腫瘤細胞。最后用生物膠水封孔，逐層縫合。假手術組大鼠不注射腫瘤細胞，換以等量Hanks液，其他同骨癌痛組。

1.3.2 免疫印跡法檢測CB2表達：采用Western blot 法測定脊髓CB2 的表達水平。大鼠斷頭處死，快速將其脊髓L3-4段取出并冷凍保存。取少量組織經(jīng)裂解、超聲、離心得總胞膜蛋白。以BCA法測定蛋白總量。加入堿性磷酸酶標記的羊抗兔二抗(1:500)，室溫震蕩孵育2 h，加入顯色劑(NBT/BCIP)曝光，以灰度掃描儀測條帶的灰度值。本研究中與注射FC后7、14、21 d時測定FC組和非FC組大鼠的CB2條帶灰度值。

2 結果

2.1 假手術組與骨癌痛組大鼠熱縮足反射潛伏期(TWL)比較 骨癌痛組大鼠TWL先縮短后恢復正常，從第3天左右縮短，顯著低于假手術組和基礎值(P< 0.05)，第7天基本恢復。而假手術組TWL與基礎值比較，差異均無統(tǒng)計學意義。表明此骨癌痛大鼠模型可信可靠。見表1。

表1 假手術組與骨癌痛組大鼠熱縮足反射潛伏期比較±s，s)Tab.1 Comparison of TWL between sham group and bone cancer pain ±s，s)

#P<0.05，與同期假手術組相比，compared with sham operation group

2.2 氟代檸檬酸對機械縮足反射閾值(PWMT)比較 FC組大鼠注射氟代檸檬酸后，PWMT值逐漸升高，至8 h時開始下降，最后恢復至基礎值，表明氟代檸檬酸可提高大鼠疼痛閾值。詳見表2。

表2 氟代檸檬酸對大鼠PWMT的影響Tab.2 Effect of fluorocitrate on rats ±s，g)

##P<0.01,#P<0.05，與非FC組相比，compared with non FC group

2.3 CB2表達情況 大鼠CB2表達基礎值為(0.22±0.02)。假手術組和骨癌痛組大鼠7、14、21 d時CB2值明顯高于基礎值。非FC組大鼠CB2灰度值逐漸降低，第7天和第14天時顯著高于假手術組，說明骨癌痛大鼠體內(nèi)CB2表達增加。FC組大鼠與非FC組相比，CB2值在7 d時差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)， 14 d和21 d時略低，但差異無統(tǒng)計學意義。表明注射氟代檸檬酸后CB2表達減少，但隨著時間延長，又趨于一致。

表3 各組大鼠CB2表達情況Tab.

*P<0.05，與對照組相比，compared with control group；#P<0.05，與同期非FC組相比，compared with non FC group

3 討論

骨癌痛發(fā)生機制比較復雜，可能與炎性痛和神經(jīng)病理性痛有關[2-3]。早期由于腫瘤細胞在骨髓腔內(nèi)生長，刺激破骨細胞，引起骨溶解和骨形成的失衡，產(chǎn)生明顯的骨質(zhì)破壞，引起疼痛；炎癥和神經(jīng)病理因素在腫瘤發(fā)展的后期發(fā)揮作用。氟代檸檬酸(fluorocitrate,FC)是一種特異性膠質(zhì)細胞抑制劑，F(xiàn)C通過抑制順烏頭酸酶，并影響檸檬酸在線粒體中的轉運，以干擾膠質(zhì)細胞的代謝。有文獻[4]報道發(fā)現(xiàn)大鼠鞘內(nèi)注射選擇性膠質(zhì)細胞代謝抑制劑(FC)可減輕足底注射酵母多糖引起的熱和機械痛覺過敏。而大麻素受體CB2主要表達于肥大的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞，可通過膠質(zhì)細胞參與骨癌痛的痛覺過敏的產(chǎn)生和維持。在被一些活性神經(jīng)活性物質(zhì)激活后，膠質(zhì)細胞通過調(diào)控神經(jīng)活性物質(zhì)的攝取間接影響神經(jīng)元的生物活性，活化后還可作為免疫細胞，合成和釋放多種致炎性細胞因子產(chǎn)生致痛作用[7-9]。脊髓鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸可以阻斷一側坐骨神經(jīng)炎性痛誘致的動物的鏡像痛行為反應[10-13]。但說明氟代檸檬酸可通過干擾膠質(zhì)細胞的代謝而抑制CB2的表達，因此，注射氟代檸檬酸后，骨癌痛大鼠體內(nèi)CB2表達減少，產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。

本文中，表1顯示骨癌痛組大鼠TWL先縮短后恢復正常，從第3天左右縮短，顯著低于假手術組和基礎值(P< 0.05)，第7天基本恢復。而假手術組TWL與基礎值比較，差異均無統(tǒng)計學意義。表明此骨癌痛大鼠模型可信可靠，這是后續(xù)實驗的前提。表2說明FC組大鼠注射氟代檸檬酸后，PWMT值逐漸升高，至8 h時開始下降，最后恢復至基礎值，表明氟代檸檬酸可提高大鼠疼痛閾值。而CB2與骨癌痛疼痛機制有關，因此可推測氟代檸檬酸可影響CB2的表達。表3顯示，假手術組和骨癌痛組大鼠7、14、21 d時CB2灰度值明顯高于基礎值；非FC組大鼠CB2灰度值逐漸降低，第7天和第14天時顯著高于假手術組，說明大鼠患骨癌痛后體內(nèi)CB2表達增加；FC組大鼠與非FC組相比，CB2灰度值在7 d時顯著降低，灰色條帶變淺，14 d和21 d時略低，但差異無統(tǒng)計學意義。表明注射氟代檸檬酸后CB2表達減少，但隨著時間延長，又趨于一致。上述結果顯示，注射氟代檸檬酸后，CB2表達減少。

綜上所述，患骨癌痛后，機體CB2表達會有一定程度增加，產(chǎn)生疼痛，而氟代檸檬酸可抑制CB2的表達，從而緩解疼痛。

[1] 吳永濤.大麻素CB1、CB2受體在腦組織中分布及其表達特性的研究[D].第三軍醫(yī)大學，2009.

[2] 周子超，姚尚龍.鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸對切口痛大鼠痛閾和脊髓TNF-α mRNA表達的影響[J].華中科技大學學報(醫(yī)學版)，2010，39(4)：515-518.

[3] 彭艷，張艷兵，姚明，等.鞘內(nèi)注射氟代檸檬酸對骨癌痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用[J].蘇州大學學報(醫(yī)學版)，2010，4：718-720+737+897.

[4] 任炳旭.脊髓水平mGluR3和mGluR5調(diào)控星形膠質(zhì)細胞活化在小鼠骨癌痛形成中的作用及中醫(yī)藥干預的研究[D].南京中醫(yī)藥大學，2011.

[5] 張靜.電針對炎性痛大鼠病灶局部皮膚組織CB2受體蛋白表達的影響[D].華中科技大學，2009.

[6] 賈濟.大麻素CB2受體激動劑預處理在調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞活化和損傷中的作用[D].第四軍醫(yī)大學，2011.

[7] 張霞婧.CB2受體激動劑預處理通過影響小膠質(zhì)細胞EAAT產(chǎn)生神經(jīng)保護作用[D].第四軍醫(yī)大學，2012.

[8] 陳炯炯.新型大麻受體CB2選擇性配體的設計、合成及構效關系研究[D].浙江大學，2013.

[9] 朱芳蕓.電針預處理通過調(diào)節(jié)CB2R/EAAT2產(chǎn)生腦缺血耐受作用[D].第四軍醫(yī)大學，2013.

[10] Watkins LR,Milligan ED,Maier SF .Spinal cord glia:new players in pain[J].Pain,2001，93(3):201-205.

[11] Milligan ED,O’Connor KA,Nguyen KT, et al.Inrtathecal HIV 1 envelope glyco -protein gp120 induces enhancedpain states mediated by spinal cord proinflammatory cytokines[J].J Neurosci,2001,21(8):2808-2819.

[12] Milligan ED,Mehmert KK,Hinde JL,et al.Thermal hyperalgesia and mechanical allodynia produced by intrathecal administration of the human immunodeficiency Virus-1(HIV1) envelope glycoprotein gp120[J].Brain Res,2000,861(1):105-116.

[13] Sun S,Chen WL,Zhang YQ,et al.Disruption of glial function enhances electroacupuncture analgesia in arthritic rats[J].Exp Neuro,2006,198(2):294-302.

(編校：譚 玲)

Effect of fluorocitrate on expression of CB2 in a rat model of bone cancer pain

ZHANG Hui1,LI Bin2,ZHANG Hui3

(1.Department of Nursing, Henan Huanghuai University, Zhumadian 463000, China; 2.Department of Biological Engineering, Henan Huanghuai University, Zhumadian 463000, China; 3.Department of Urology Surgery, Zhumadian Central Hospital, Zhumadian 463000, China)

ObjectiveTo study effect of fluorocitrate on expression of CB2 in a rat model of bone cancer pain.MethodsThe Walker-256 tumor cells were injected into 40 rats to establish the bone cancer pain model.Another 10 SD rats were as sham operation group, and 10 rats were as control group.Compared TWL between sham operation(sham) group and bone cancer pain(BCP) group, the bone cancer pain rats were divided into FC group and non FC group, 0.01mL (1nmol) fluorocitrate were injected into FC group, while physiological saline were given to none FC group.Paw withdrawl mechanical threshold was recorded in rats.CB2 was determined by Western blot at the same time.ResultsTWL of BCP group initially decreased and then returned to normal, and sham group remained unchanged.After injection of fluorocitrate, PWMT of FC group increased.CB2 of sham group and BCP group were significantly higher than basal values(P< 0.05).For the none FC group rats, CB2 gradually decreased, which was significantly higher than that in sham group in 7 d and 14 d(P< 0.05).Morever, compared with the non FC group, CB2 of FC group were significantly less in 7 d(P< 0.05). ConclusionAfter suffering bone cancer pain, CB2 expression may increase to a certain extent, leading to the pain.Fluorocitrate can inhibit expression of CB2, thus relieve pain.

fluorocitrate; bone cancer pain; CB2

黃淮學院青年骨干教師資助計劃；河南省教育廳科技攻關項目(14B180006)

張卉，女，研究生，講師，研究方向：生物技術、分子生物學，E-mail：zghuii163@163.com。

R735.2

A

1005-1678(2015)02-0052-03