苦參堿對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的促凋亡作用及其對(duì)線粒體跨膜電位的影響分析

谷牧人,李駿白,張?bào)泸?殷詠梅

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)定理臨床學(xué)院溫州市中心醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科，浙江 溫州 325000；3.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇 南京 210029)

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苦參堿對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的促凋亡作用及其對(duì)線粒體跨膜電位的影響分析

谷牧人1,李駿白1,張?bào)泸?Δ,殷詠梅3

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)定理臨床學(xué)院溫州市中心醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科，浙江 溫州 325000；3.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇 南京 210029)

目的 研究苦參堿對(duì)人乳腺癌(michigan cancer foundation-7，MCF-7)細(xì)胞的促凋亡作用及對(duì)線粒體跨膜電位的影響。方法 體外培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，觀察組細(xì)胞中加入不同濃度的苦參堿溶液，對(duì)照組細(xì)胞中加入等量的培養(yǎng)液。MCF-7細(xì)胞的凋亡與細(xì)胞線粒體跨膜電位采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，MCF-7細(xì)胞的抑制率采用MTT的方法檢測(cè)。結(jié)果 苦參堿處理24h后觀察組的MCF-7細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著濃度的升高而升高；苦參堿對(duì)于MGF-7細(xì)胞抑制率的結(jié)果顯示，隨著時(shí)間與濃度的增加苦參堿對(duì)于MGF-7細(xì)胞抑制率效應(yīng)也隨之增強(qiáng)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；苦參堿處理24 h后的羅丹明染色陽(yáng)性數(shù)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明線粒體跨膜電位與濃度呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論 苦參堿對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞有促凋亡的作用，其促凋亡的作用可能是通過(guò)降低線粒體跨膜電位而使MMP的通道打開(kāi)。

苦參堿；乳腺癌；線粒體跨膜電位

近年來(lái)乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響了女性的健康和生存質(zhì)量。目前，治療方法多采用藥物化療，其化療制劑毒副作用大，費(fèi)用昂貴，許多患者因此無(wú)法有效治療而喪失了生存的機(jī)會(huì)。由于傳統(tǒng)的中藥具有毒副作用小、療效好和價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)，逐漸受到人們的關(guān)注。苦參堿(matrine，MAT)是從苦豆子、苦參等豆科植物中提取得到一種生物活性堿，研究發(fā)現(xiàn)，其在肺癌、肝癌、大腸癌、胃癌等的癌細(xì)胞中起到了促凋亡與抑制的作用[1-2]。本文旨在通過(guò)研究苦參堿對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的促凋亡作用及對(duì)線粒體跨膜電位的影響，初步探討苦參堿抗乳腺癌的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 苦參堿購(gòu)自西安融升生物科技有限公司；乳腺癌MCF-7細(xì)胞株由溫州醫(yī)科大學(xué)定理臨床學(xué)院溫州市中心醫(yī)院的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室來(lái)提供；RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自南京醫(yī)藥股份有限公司；羅丹明染色試劑盒購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；新生胎牛血清購(gòu)自四川科倫實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；胰酶與四甲基噻唑藍(lán)MTT購(gòu)自中美上海施貴寶制藥有限公司。

1.2 儀器 SW-GJ-2FD型的超凈工作臺(tái)購(gòu)自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器有限公司；3319型CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Forma公司；BDFACS-Aria流式細(xì)胞儀購(gòu)自雙鴿集團(tuán)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)以及傳代：將乳腺癌MCF-7細(xì)胞株從液氮罐中快速的取出放入37 ℃～42 ℃左右的水浴箱中進(jìn)行解凍，待融化后把凍存管置于1500 r/min的離心機(jī)進(jìn)行離心，將離心過(guò)的凍存管放在超凈臺(tái)內(nèi)拿掉凍存液之后往里加入事先準(zhǔn)備好的RPMI-1640培養(yǎng)液2 mL，用吸管輕輕的吹打懸浮著的細(xì)胞之后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液添加到4～5 mL，放入溫度為37 ℃，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)過(guò)24 h的培養(yǎng)之后，通過(guò)倒置的顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到瓶底的80%左右時(shí)進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，把培養(yǎng)液換成約2 mL左右的消化液進(jìn)行消化，繼續(xù)通過(guò)倒置的顯微鏡觀察，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)收縮細(xì)胞間有裂隙產(chǎn)生，還未變圓前，停止消化，把消化液換成新鮮的培養(yǎng)液，再輕輕的吹打貼在瓶壁上的細(xì)胞，使其全部懸浮后，在平均分開(kāi)放入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)繼續(xù)在溫度為37 ℃，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞凋亡情況的檢測(cè)：分別取觀察組與對(duì)照組的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用胰酶進(jìn)行消化，加入首先預(yù)冷的PBS進(jìn)行洗滌，輕輕的吹打貼在瓶壁上的細(xì)胞使其懸浮。收集培養(yǎng)細(xì)胞在1500 r/min的尖底離心管內(nèi)進(jìn)行7 min的離心。把細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×105個(gè)/mL，采用相同的方法進(jìn)行2次PBS洗滌，2次離心前都先把細(xì)胞放到流式測(cè)定管內(nèi)，離心之后在流式測(cè)定管里加入100 μL的結(jié)合緩沖液來(lái)使細(xì)胞懸浮，在分別加入5 μL的Annexin V/FITC與10 μL的碘化丙啶溶液，混和均勻后在室溫避光培養(yǎng)15 min，再加入400 μL的結(jié)合緩沖液及時(shí)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.2.3 苦參堿對(duì)于MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率：取處于對(duì)數(shù)期的乳腺癌MCF-7細(xì)胞，采用濃度為0.25%的胰酶消化和培養(yǎng)液輕輕的吹打懸浮的細(xì)胞，把濃度調(diào)整為2×104個(gè)/mL，接種于96個(gè)孔板內(nèi)每個(gè)孔100 μL，再培養(yǎng)24 h，對(duì)細(xì)胞貼壁進(jìn)行觀察待生長(zhǎng)良好之后，分別加入苦參堿溶液100 μL使其濃度為0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL，為觀察組，另外對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)液，各自設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。溫度為37 ℃，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在苦參堿對(duì)其作用24、46、72 h之后MTT檢測(cè)，檢測(cè)前在每個(gè)孔內(nèi)加入100 μL的DMSO，輕輕的振蕩，10～15 min后，用酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度的測(cè)定。測(cè)量波長(zhǎng)選擇492 nm。計(jì)算出各個(gè)時(shí)間段觀察組以及觀察組的4個(gè)復(fù)孔內(nèi)的平均吸光度的值。計(jì)算公式為：腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率=(1-觀察組的吸光度/對(duì)照組的吸光度)×100%。

1.2.4 線粒體跨膜電位檢測(cè)：選擇5瓶對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MCF-7細(xì)胞，其中選取4瓶各自加入4 mL苦參堿溶液(含有培養(yǎng)液)，苦參堿的濃度為0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL作為觀察組，取1瓶作為對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)液。在溫度為37 ℃，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。藥物對(duì)其作用24 h之后細(xì)胞采用0.25%的胰酶消化后再放置在培養(yǎng)液中，取細(xì)胞數(shù)1×106個(gè)/mL，然后添加10 μg/mL 羅丹明123染液在溫度為37 ℃，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 min離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液清洗2次，然后用上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 苦參堿處理24 h后細(xì)胞凋亡率的比較 對(duì)照組MCF-7細(xì)胞凋亡率為(1.12±0.06)%；觀察組中，濃度為0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL的苦參堿處理的細(xì)胞凋亡率分別為(4.27±0.26)%、(6.59±0.17)%、(16.16±0.23)%和(20.16±0.16)%。苦參堿處理24h后觀察組的MCF-7細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著濃度的升高而升高。見(jiàn)表1。

表1 苦參堿處理24 h后細(xì)胞凋亡率的比較Tab.1 Comparison of cell apoptosis rate by matrine after ±s,n=5)

*P<0.05，與對(duì)照組相比，compared with control group

2.2 MGF-7細(xì)胞抑制率的比較 苦參堿對(duì)于MGF-7細(xì)胞抑制率的結(jié)果顯示，隨著時(shí)間與濃度的增加苦參堿對(duì)于MGF-7細(xì)胞抑制率效應(yīng)也隨之增強(qiáng)，且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 MGF-7 細(xì)胞抑制率的比較Tab.2 Comparison of cell inhibition rate for ±s,n=5)

2.3 苦參堿處理24 h后線粒體膜電位的比較 苦參堿處理24 h后的羅丹明染色陽(yáng)性數(shù)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且羅丹明染色陽(yáng)性數(shù)隨著濃度的增升高而降低，呈負(fù)相關(guān)。見(jiàn)表3。

表3 苦參堿處理24 h后線粒體膜電位的比較±s,n=5)Tab.3 Comparison of mitochondrial transmembrane potential by ±s,n=5)

*P<0.05，與對(duì)照組相比，compared with control group

3 討論

苦參堿是多種中草藥的有效成分[3-4]。有研究表明，其具有很重要生物學(xué)活性，主要表現(xiàn)為抗病毒、抗癌、抗纖維化以及免疫調(diào)節(jié)等，具有上述多種藥理生理作用，并通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)顯示苦參堿能夠?qū)Χ喾N癌細(xì)胞具有抑制生長(zhǎng)或者廣泛殺傷的作用[5-7]。羅丹明123能夠透過(guò)細(xì)胞細(xì)胞膜，是一種陽(yáng)離子的熒光染料，同時(shí)也是線粒體的跨膜電位指示劑。羅丹明123在正常的細(xì)胞中可以依賴線粒體的跨膜電位從而進(jìn)入細(xì)胞的線粒體基質(zhì)內(nèi)，在進(jìn)入的過(guò)程中其熒光的強(qiáng)度逐漸減弱直至消失，而在其發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞的線粒體膜的完整性受到破壞，使管理線粒體的膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔打開(kāi)，從而引起細(xì)胞內(nèi)線粒體的跨膜電位發(fā)生崩解[8-9]。本研究對(duì)體外對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，觀察組細(xì)胞中加入不同濃度的苦參堿溶液，對(duì)照組細(xì)胞中加入等量的培養(yǎng)液。

本研究發(fā)現(xiàn)，加入苦參堿溶液處理24 h后的MCF-7細(xì)胞凋亡率顯著高于等量的培養(yǎng)液的MCF-7細(xì)胞凋亡率，且隨著苦參堿溶液濃度的升高M(jìn)CF-7細(xì)胞凋亡率不斷升高。研究說(shuō)明了苦參堿溶液對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡有明顯的促進(jìn)作用，能夠促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的凋亡。其機(jī)制可能為苦參堿會(huì)影響線粒體的跨膜電位的MMP通道，其會(huì)導(dǎo)致MMP通道打開(kāi)，從而觸發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[10]?；蚩赡苁峭ㄟ^(guò)改變線粒體的膜內(nèi)外的離子濃度，從而使細(xì)胞的跨膜電位發(fā)生崩潰，促使MMP通道發(fā)生開(kāi)放，導(dǎo)致內(nèi)外膜中的許多離子發(fā)生逆流，進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。本研究表明苦參堿溶液對(duì)于MGF-7細(xì)胞的抑制率結(jié)果為隨著時(shí)間與濃度的增加，苦參堿對(duì)于MGF-7細(xì)胞抑制率效應(yīng)也隨之增強(qiáng)，抑制率逐漸增強(qiáng)；同時(shí)也說(shuō)明苦參堿處理能夠明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，且與濃度呈正相關(guān)，濃度越高則抑制率越高。Rh123會(huì)從線粒體中釋放出來(lái)，從而會(huì)發(fā)出黃綠色的熒光，熒光可由流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)[11-12]。進(jìn)而通過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)弱能夠檢測(cè)細(xì)胞線粒體的膜電位所發(fā)生的變化以及監(jiān)測(cè)凋亡的發(fā)生與否[13]。

本研究顯示，苦參堿溶液能夠?qū)CF-7細(xì)胞凋亡有明顯的促進(jìn)作用，能夠促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的凋亡，明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)可以明顯降低羅丹明染色陽(yáng)性數(shù)，且作用能力與濃度呈正相關(guān)。

綜上所述，苦參堿對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞有促凋亡的作用，其促凋亡的作用可能是通過(guò)降低線粒體跨膜電位而使MMP的通道打開(kāi)。

[1] 鮑嬌琳，陸金健，陳修平，等.苦參堿與氧化苦參堿抗腫瘤作用及其機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中藥新藥與臨床藥理，2012，23(3)：369-373.

′[3] 陳曉峽，向小慶，葉紅，等.苦參堿及氧化苦參堿抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(11)：361-364.

[4] 羅應(yīng)，李利軍，鄧春燕，等.硅溶膠-納米金修飾金電極電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定苦參堿的研究[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2013，32(1)：74-78.

[5] Gray GK,Therapeutic CK2 inhibition attenuates diverse prosurvival signaling cascades and decreases cell viability in human breast cancer cells[J].Oncotarget.2014,5(15):6484-6496.

[6] 高艷，鄭萍，閆琳，等.苦參堿對(duì)大鼠慢性酒精性肝損傷的作用及初步機(jī)制研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013，29(7)：1012-1016.

[7] 官妍，馬越，程惠娟，等.苦參堿對(duì)表皮葡萄球菌生物被膜作用初探[J].微生物學(xué)通報(bào)，2011，11(1)：91-96.

[8] 閆曉方，許偉，高吉照，等.苦參堿聯(lián)合順鉑對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞藥物敏感性及TrkB表達(dá)的影響[J].臨床兒科雜志，2012，30(5)：456-459.

[9] 桂蜀華，付濤，梁遠(yuǎn)園，等.苦參堿體外抗真菌活性研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2011，22(4)：382-385.

[10] 張俊，唐安洲.苦參堿及其衍生物對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用[J].中藥材，2012，35(12)：1989-1994.

[11] 馬小花，魏玉輝，王丹，等.苦參堿大鼠腸吸收動(dòng)力學(xué)研究[J].中成藥，2011，33(10)：1695-1699.

[12] 莫利鋒，郅軍銳，張駿，等.苦參堿及吡蟲(chóng)啉對(duì)南方小花蝽的影響[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2013，40(2)：160-164.

[13] Hamada T,Anti-apoptotic Effects of PCP4/PEP19 in Human Breast Caner Cell Lines: A Novel Oncotarget.Oncotarget.2014 Aug 15;5(15):6076-6086.

(編校：譚玲,王冬梅)

Analysis of induced apoptosis effect of matrine on human breast cancer MCF-7 cell and its effect on mitochondrial transmembrane potential

GU Mu-ren1,LI Jun-bai1,ZHANG Xiao-hua2Δ,YIN Yong-mei3

(1.Department of Tumor Oncology, Theorem Clinical Medical College, Wenzhou City Hospital, Wenzhou 325000, China; 2.Department of Tumor Surgery, First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical, Wenzhou 325000, China; 3.Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)

ObjectiveTo study the effect and the analysis of matrine for induced apoptosis in breast cancer MCF-7 cells and mitochondrial transmembrane potential.MethodsBreast cancer MCF-7 cells were cultured in vitro,then they were divided according to the random number to observation goup and control group.The observation goup were treated by different concentrations of matrine solution, and control group were added an equal amount of broth.Apoptosis and mitochondrial membrane potential of MCF-7 cells were detected by flow cytometry (FCM) detection, the inhibition rate of MCF-7 cells was detected by MTT.ResultsMCF-7 cell apoptosis rate in observation goup was significantly higher than that in control group after 24h, and there were statistically significant (P<0.05), it increased as the concentration had increased; inhibition rate of matrine for MGF-7 cell showed that inhibition rate had increased with time and concentration of matrine, and there was a statistically significant (P<0.05); Rhodamine staining positive number in observation group was less than the control group, and there were statistically significant (P<0.05), and the number of positive Rhodamine staining increased as the concentration had increased. ConclusionMatrine can promote apoptosis for human breast cancer MCF-7 cells, the effect may be caused by reducing mitochondrial transmembrane potential and leaving the MMP channel open.

matrine; breast cancer; mitochondrial transmembrane potential

國(guó)家自然科學(xué)基金(81172503)

谷牧人，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤內(nèi)科，E-mail：qch1821460067@163.com；張?bào)泸?，通訊作者，男，本科，主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤外科，E-mail：qch1821460068@163.com。

R248.2

A

1005-1678(2015)02-0039-03