基于多芳環(huán)多吡啶配體的單功能鉑配合物DNA結合研究

陳司漢,周炳榮

(1.樂山職業(yè)技術學院，四川 樂山 614000； 2.南京醫(yī)科大學 醫(yī)學科學部，江蘇 南京 210029)

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基于多芳環(huán)多吡啶配體的單功能鉑配合物DNA結合研究

陳司漢1,周炳榮2

(1.樂山職業(yè)技術學院，四川 樂山 614000； 2.南京醫(yī)科大學 醫(yī)學科學部，江蘇 南京 210029)

目的 驗證配體2,4,6-三[二(2-吡啶甲基)-氨甲基苯基]-1,3,5-三嗪(L4)配合物的DNA結合能力。方法 合成一個多芳環(huán)多吡啶配體2,4,6-三[二(2-吡啶甲基)-氨甲基苯基]-1,3,5-三嗪(L4)。配體(L4)與Pt(DMSO)2Cl2反應得到配合物4，表征配合物，通過紫外、熒光和凝膠電泳的方法研究了配合物4的DNA結合能力。結果 紫外和熒光實驗表明該配合物均可與DNA嵌入結合，結合常數(shù)分別為2.1×104M-1、 2.78×107M-1。凝膠電泳實驗表明配合物可使 DNA 超螺旋形式完全解旋，有效擾亂 DNA 的二級結構。結論 配體2,4,6-三[二(2-吡啶甲基)-氨甲基苯基]-1,3,5-三嗪(L4)配合物與 DNA 具有較強的結合能力，可以緩慢結合形成 DNA 的加合物，并且能夠有效擾亂DNA構象。

鉑配體；DNA結合；合成

癌癥一直是困擾人類健康和生命的殺手。鉑類抗癌劑對睪丸腫瘤和卵巢癌有特效外，對子宮頸癌、淋巴瘤、膀胱癌等也有治療作用[1]，其中順鉑(cisplatin，DDP) 是一種臨床應用極為廣泛的含鉑類化療藥物，其主要作用靶點是DNA。順鉑對RNA和蛋白質合成的抑制作用較弱，屬周期非特異性藥物。順鉑雖用于治療一些癌癥，但抗腫瘤譜仍相對狹窄，有些腫瘤細胞系天然抗藥性，有些在接受初始治療后產生抗藥性[2-3]。順鉑水溶性不高，需要采取靜脈注射給藥，這給患者帶來了極大的不便[4]。為了克服順鉑的上述缺點，鉑類抗腫瘤藥物進入了一個快速發(fā)展時期，先后出現(xiàn)了5類順鉑類似物(卡鉑、奧沙利鉑、奈達鉑、洛鉑、庚鉑)[5]，但由于結構與順鉑相似，并沒有從根本上解決順鉑存在的缺陷[2]。

毒性和抗藥性是鉑類抗癌藥物需要解決的主要問題。在最近的幾年中，人類又設計出單功能鉑和多核鉑，這些鉑類配合物與順鉑及其類似物有著完全不同的結構特征[6-8]，因而它們與DNA的作用方式也有可能完全不同于順鉑。鑒于迄今為止，有關多核螯合鉑類配合物的研究報道的極少，該類配合物的構效關系也還未曾被探討過[9-10]。本實驗中以2，4，6-三(4-亞甲基苯基)-1，3，5-三嗪橋連了3個二(2-吡啶甲基)胺，得到配體2，4，6-三[二(2-吡啶甲基)-氨甲基苯基]-1，3，5-三嗪(L4)。該配體與Pt(DMSO)2Cl2反應得到1個多芳環(huán)三核三氮螯合鉑配合物(4)，研究了配合物4的DNA結合能力。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 對甲基苯腈購自 TCI；K2[PtCl4]、2-氯甲基吡啶、2-氨甲基吡啶和二異丙基乙基胺均購自阿拉??；甲醇、丙酮、氯仿、NBS、偶氮二異丁腈(AIBN)和三氟甲環(huán)酸購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。pUC19 質粒 DNA購自大連寶生物有限公司；小牛胸腺DNA(CT-DNA)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)和溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓(EB)購自Sigma。

1.2 儀器 Bruker Advance/AV 500 MHz核磁共振儀(瑞士布魯克公司)； LCQ電噴霧質譜儀，Isopro3.0軟件(美國ThermoFinnigan公司)； Shimadzu RF-5310熒光光譜儀(日本島津公司)；TU-1900紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)； BIO-RAD電泳儀(上海伯樂生命醫(yī)學產品有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc XR(美國BioRad公司)；DigiDoc-ItTM系統(tǒng)(美國UVP公司)。

1.3 方法

1.3.1 配體及配合物的合成：①合成溴甲基苯腈[11]：向50 mL的茄形瓶中加入對甲基苯2.1 g(18 mmol)，NBS 3.846 g(21.6 mmol)，AIBN 0.2952 mg(1.8 mmol)，氮氣保護，將該混合物攪拌2 min，使其混合均勻。升溫至60 ℃～70 ℃，至原料反應完全，約5 h，瓶內為紅褐色稠狀液體。停止攪拌，降至室溫，紅褐色稠狀液體逐漸固化，加入45 mL乙醚洗滌，為灰黑色懸濁液。將該懸濁液抽濾，取濾液(濾液為黃色液體)。將濾液旋蒸至干。

②合成2，4，6-三(4-溴甲基苯基)-1，3，5-三嗪：往25 mL的茄形瓶中加入10 mL三氟甲磺酸，稱取5 g(42.7 mmol)對溴甲基苯腈，在冰浴上分批次加入茄形瓶中，劇烈攪拌，加完后，在茄形瓶上插上一根干燥管，攪拌 5 d。反應結束后，往瓶中加入大量水，出現(xiàn)大量白色固體，用濃氨水調節(jié)pH至中性。抽濾，固體用水洗滌(3次)。

③ 合成二(2-吡啶甲基)胺[12]： 向250 mL的三口瓶中加入2-氨甲基吡啶(10.3 mL，0.1 mol)，Zn粉(20 g)，冰醋酸(20 mL)，95%乙醇(100 mL)的混合物，60 ℃～70 ℃下劇烈攪拌，氮氣保護。往混合物中加入2-吡啶甲醛(9.5 mL，0.1 mol)，2 h內加完。補加Zn粉(40 g)、冰醋酸(40 mL)，2 h內加完。加完后繼續(xù)保持60 ℃～70 ℃ 5 h。關閉反應，室溫下保持一夜，過濾沉淀，濾液旋蒸。得到淺黃色漿狀物，加入過量的 NaOH 過飽和溶液調節(jié)至堿性。上層為紅油狀，乙醚萃取并用無水硫酸鎂干燥，旋蒸。

④合成2，4，6-三[4-二(2-吡啶甲基)-氨甲基苯基]-1，3，5-三嗪(L4)[13]： 向100 mL的茄形瓶中加入二(2-吡啶甲基)胺(1.2038 g，6 mmol)，40 mL氯仿，劇烈攪拌。加入有機堿(二異丙基乙基胺)(0.78 g，6 mmol)，攪拌一段時間。將稱好的 2，4，6-三(4-溴甲基苯基)-1，3，5-三嗪(1.176 g，2 mmol)倒入茄形瓶中，攪拌4 d，至溶液由黃色變?yōu)榧t褐色，停止攪拌(使用薄層色譜監(jiān)控反應的進度)。用50 mL的水洗滌，并用無水硫酸鎂干燥，旋蒸至干。粗產物用硅膠柱色譜(淋洗液為CHCl3:CH3OH=40:1，氨水少許)進行提純。

⑤合成Pt(DMSO)2Cl2[14]： Pt(DMSO)2Cl2按照文獻方法合成：稱取K2[PtCl4] 1.245 g(0.003 mol)，溶于10 mL二次蒸餾水中，加入DMSO(0.009 mol)，室溫下靜置1 d，析出黃色針狀晶體。過濾，用水、乙醇、乙醚。

⑥合成配合物(4)：配體L4(63.6 mg，0.0675 mmol)溶于12 mL甲醇，攪拌。Pt(DMSO)2Cl2(85.5 mg，0.203 mmol)用60 mL的甲醇超聲溶解，加入上述溶液中，攪拌5 d，溶液由清變渾。抽濾得到黃色固體33 mg，濾液濃縮至2 mL，加入乙醚，有固體出現(xiàn)，繼續(xù)抽濾得到固體3 mg。

1.3.2 與DNA結合能力：CT-DNA 的儲備液配制在5 mmol/L Tris-HCl/50 mmol/L NaCl的水溶液中(pH=7.4)，EB也在該緩沖溶液中配制，濃度為2×10-3mol/L，DNA濃度通過測定其 260 nm 處的吸光度來確定(DNA 在 260 nm 處的摩爾消光系數(shù)為 6600 M-1cm-1)，且在260 nm和280 nm處的吸收強度之比為1.8～1.9，表明該DNA樣品不含蛋白質。

① 紫外可見光譜

配合物濃度為2×10-5mol/L，測定前將溶液放在(25±0.1) ℃的恒溫水浴中。取石英杯2只，分別加入TE緩沖液2990 μL。在對照杯中加入10 μL TE buffer，在樣品杯加入10 μL樣品。實驗組中加入測試液，其中CT-DNA與配合物(2×10-5mol/L)的摩爾濃度比例為 0.5(DNA/[配合物])，蓋上蓋子，上下幾次搖勻。放入751型分光光度計的比色槽中，使用氫燈，分別測出OD240～OD400的之間的吸收光譜值。記錄溶液隨時間變化的紫外曲線；按計算公式算出你所制備的DNA的純度和濃度。

② 熒光光譜

于1批 5 mL刻度試管中加入 110 mL Tris - HCl緩沖溶液，加入 0.4 mL DNA 溶液， 1.0 mL BR溶液，不同量的 MTX溶液，以蒸餾水定容并且搖勻， 避光放置1 h，熒光光譜的測定中激發(fā)波長為 525 nm，發(fā)射波長為 600 nm。EB-CT-DNA體系的Tris-HCl/NaCl緩沖液(pH=7.4)3 mL，濃度為5×10-5mol/L，向該體系中每次滴加 3 mmol/L 的配合物溶液(用 DMSO 配制)3 μL，在室溫下測定每次滴加樣品后的熒光光譜，掃描熒光光譜或測定 525 nm 處的熒光強度

③ 瓊脂糖凝膠電泳

器具清洗：將配膠、電泳、染膠所需要的器具清洗干凈；根據基因組片段大小，配置瓊脂糖凝膠。首先將錐形瓶加入少量純水煮沸，西班牙瓊脂糖倒入錐形瓶中，搖勻并用錫紙封口，將煮好的凝膠放入65 ℃的水浴鍋中，待凝膠冷卻至65 ℃時，及時將凝膠倒入干凈模具中。待凝膠完全凝固后電泳檢測；先將干凈的電泳槽排放整齊并做好標記，然后把凝膠連同膠托一起放入電泳槽正中央，膠孔的方向朝向負極；用2 μL×6溴酚黃加入到每一個膠孔中，檢測凝膠膠孔是否漏孔。若不漏孔，則可在凝膠孔底部看到一條黃色條帶；若漏孔，則看不到條帶；.將樣品pUC19質粒DNA、6×溴酚黃按3︰1的比例混勻，輕甩后按照規(guī)定的順序上樣，上樣順序應與電泳槽上的標記一致，最后點上一定量的Ladder；確認已經正確上樣后，雙手蓋上電泳槽蓋，接通電泳儀和電泳槽，最后按鍵開始電泳；電泳結束之后，帶上PE手套，小心滑出凝膠，把凝膠轉移到干凈的PE手套上，小心 地 將 凝 膠 放 入相 應 標 記的EB染膠盤中，蓋 上 蓋 子 染30 min。凝膠成像：帶上PE手套，將凝膠從染膠盤中撈出，放在染膠時的PE手套上，將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中，按照凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc XR(BioRad公司)拍照。

2 結果

2.1 合成產物結果

合成的溴甲基苯腈為黃色固體。正己烷重結晶，得到1.54 g白色固體(產率為43.8%)。1H NMR(CDCl3)：δ=4.41 ppm(s，2H)，δ=7.58 ppm(d，2H)，δ=7.44 ppm(d，2H)；

合成2，4，6-三(4-溴甲基苯基)-1，3，5-三嗪，得到4.7586 g白色粗產物。甲苯重結晶得到3.6518 g白色產品(產率為73.4%)，1H NMR(CDCl3)：δ=4.58 ppm(s，6H )，δ=7.58 ppm(d，6H)，δ=8.70 ppm(d，6H)；

合成二(2-吡啶甲基)胺，得到黃色油狀物9.5411 g(產率為47.95%)。1H NMR(CDCl3)：δ=3.96 ppm(s，4H)，δ=7.13 ppm(m，2H)，δ=7.33 ppm(d，2H)，δ=7.62 ppm(m，2H)，δ=8.54 ppm(m，2H)；

合成2，4，6-三[4-二(2-吡啶甲基)-氨甲基苯基]-1，3，5-三嗪(L4)。得到0.318 g純品(產率為16.88%)。1H NMR(CDCl3)：δ=3.82 ppm(s，6H)，δ=3.88 ppm(s，12H)，δ=7.17 ppm(m，6H)，δ=7.62 ppm(q，12H)，δ=7.69 ppm(m，6H)，δ=8.54 ppm(t，6H)，δ=8.70 ppm(d，6H)；ESI—MS(+)：943.75，[C60H55N12]+；

合成Pt(DMSO)2Cl2，真空干燥得到產品0.9453 g，產率為74.67%；

合成配合物(4)，2個固體核磁相同(產率約為58%)。1H NMR(d6-DMSO)：δ=4.51 ppm(s，6H)，δ=5.05 ppm(d，6H)，δ=5.47 ppm(d，6H)，δ=7.50 ppm(t，6H)，δ=7.71 ppm(d，6H)，δ=8.04 ppm(d，6H)，δ=8.21 ppm(m，6H)，δ=8.41 ppm(d，6H)，δ=8.67 ppm(d，6H)；ESI-MS(+)：545.08，[C60H54N12Pt3Cl3]3+，834.75，[C60H54N12Pt3Cl4]2+。

2.2 與DNA結合能力結果 通過紫外、熒光、和凝膠電泳的方法研究了配合物 4 的 DNA 結合能力。計算得到DNA濃度為5.9015×10-4mol/L。

2.2.1 紫外可見光譜:依賴時間的配合物 4 與 CT-DNA 的紫外吸收光譜研究顯示配合物在285 nm處的最大吸收峰強度在反應15 h后產生了50%的減色效應，見圖1。此結果表明配合物4是一個較強的DNA結合試劑，作用方式可能為嵌入結合，然而也不排除靜電和氫鍵作用。

圖1 r=0.5時配合物4在室溫下隨時間變化的紫外光譜Fig.1 UV spectrum of complexes 4(r=0.5) change with time at room temperature

滴定表明隨著DNA濃度的增加，配合物在285 nm處的吸光度不斷降低，見圖2，在滴定結束后，盛放配合物的比色皿中出現(xiàn)白色的絲狀物質。

圖2 配合物4濃度為2×10-5 mol/L，加入不同濃度比r時的紫外光譜Fig.2 UV spectrum of complexes 4 at concentration of 2×10-5 mol/L, adding r at different concentrations

2.2.2 熒光光譜：以配合物 4 與 CT-DNA 作用的熒光滴定光譜中，每次加入配合物的濃度為3 μM，體系中600 nm的發(fā)射強度隨著配合物4的滴加顯著地降低了(熒光強度進行了歸一化)，見圖3。

圖3 配合物4與EB-CT-DNA體系熒光作用曲線Fig.3 Curve of action between complexes 4 and EB-CT-DNA fluorescence system

EB-CT-DNA(50 mmol/L EB， 50 mmol/L DNA)體系熒光隨加入的配合物4濃度增加而降低的變化曲線。計算結果Kapp為2.78×107M-1。

2.2.3 凝膠電泳研究：配合物4與pUC19質粒DNA在37 ℃溫育24 h的凝膠電泳圖見圖4。此時DNA為大量超螺旋DNA[Form Ⅰ和少量開環(huán)DNA(Form Ⅱ)]的混合物。實驗中ri(c)為0.66，說明配合物可以有效擾亂DNA構象，見圖4。

圖4 配合物4與pUC19質粒DNA在37 ℃溫育24 h的凝膠電泳圖1:DNA空白；2-9：ri 值分別為0.33，0.4125，0.495，0.5775，0.66，0.7425，0.825，0.9075Fig.4 The gel electrophoresis of complexes 4 and pUC19 plasmid DNA incubated at 37 ℃ 24 h 1: DNA blank；2-9：ri=0.33，0.4125，0.495，0.5775，0.66，0.7425，0.825，0.9075

3 討論

本文合成了一個多芳環(huán)多吡啶配體三[4-二(2-吡啶甲基)-氨甲基苯基]-1，3，5-三嗪(L4)，通過紫外、熒光、和凝膠電泳的方法研究了配合物4的DNA結合能力，結果表明配合物與 DNA 具有較強的結合能力，可以緩慢結合形成 DNA 的加合物，并且能夠有效擾亂DNA構象。對于配合物細胞毒活性的研究仍在測試中，配合物4為一個多核的單功能鉑配合物，機理明顯不同于順鉑，它可為今后不同于順鉑的抗癌藥物的研究起一定的指導作用。

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(編校：王冬梅)

Research on single function of platinum complexes of polyaromatic polypyridine ligands on DNA interactions

CHEN Si-han1,ZHOU Bing-rong2

(1.Leshan Vocational and Technical College, Leshan 614000, China; 2.Department of Medical Sciences, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)

ObjectiveTo verify the ability of ligand 2,4,6- three [two (2- pyridyl methyl) - aminomethyl phenyl]-1,3,5- triazine (L4) combined with DNA.MethodsSynthesis of an aromatic polypyridyl ligand 2,4,6- three [two (2- pyridyl methyl)-aminomethyl phenyl]-1,3,5-triazine (L4).Complex 4 was obtained by the reaction of ligand(L4) and Pt(DMSO)2Cl2,the complex 4 was characterized, electrospray mass spectroscopy.Methodsby UV, fluorescence, and gel electrophoresis study of the binding ability of complex 4 and DNA.ResultsUV-vis experiments showed that the complexes could be combined with the embedded DNA, the binding constant was 2.1×104M-1, EB-DNA binding experiments also showed that the complexes could be combined with embedded DNA, the calculated Kapp was 2.78×107M-1.Gel electrophoresis experiments showed that the complexes could make DNA from the supercoiled form to complete unwinding, and two level structure effectively disrupt DNA. ConclusionThe ligand of 2,4,6- three [two (2- pyridyl methyl) - aminomethyl phenyl]-1,3,5- triazine (L4) complexes combine with stronger binding ability with DNA, can combine to form DNA complexes, and can effectively disrupt the conformation of DNA.

platinum ligand; DNA binding; synthesis

國家自然科學基金(81000700)

陳司漢，女，碩士，中級講師，研究方向：生物化學，E-mail：30661641@qq.com。

R979.1

A

1005-1678(2015)02-0035-04