多聚賴氨酸在大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)中工作濃度的研究

韓璐，肖鳳，張岫美

(1.天津生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物技術(shù)系，天津 300461；2.河北省圍場縣醫(yī)院 消化內(nèi)分泌科，河北 圍場 068450；3.山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)系，山東 濟(jì)南 250012)

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多聚賴氨酸在大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)中工作濃度的研究

韓璐1，肖鳳2，張岫美3Δ

(1.天津生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物技術(shù)系，天津 300461；2.河北省圍場縣醫(yī)院 消化內(nèi)分泌科，河北 圍場 068450；3.山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)系，山東 濟(jì)南 250012)

目的 優(yōu)選多聚賴氨酸(poly-D-lysine，PDL)在大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)中的最佳工作濃度。方法 頸椎脫臼處死孕18 d的Wistar大鼠3只，取出胚胎并分離腦組織。迅速分離海馬組織，胰酶消化，吹打并以合適濃度(30萬/3.5 cm皿)接種于0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、2 mg/mL的PDL工作濃度包被的培養(yǎng)皿中，采用相差顯微鏡觀察神經(jīng)元形態(tài)，同時采用CCK-8試劑盒進(jìn)行神經(jīng)元活性檢測。結(jié)果 神經(jīng)元接種4 h后貼壁，1 d后突起發(fā)生，4 d后與周圍神經(jīng)元形成聯(lián)系，7 d后成熟并形成網(wǎng)狀聯(lián)系。PDL最佳工作濃度范圍位于0.25～0.75 mg/mL，神經(jīng)元在此濃度范圍內(nèi)生長狀態(tài)及活性最佳。結(jié)論 通過實驗確定了PDL最佳工作濃度，對于神經(jīng)元培養(yǎng)有重要意義。

海馬神經(jīng)元；原代培養(yǎng)；PDL工作濃度

海馬屬于大腦皮層邊緣系統(tǒng)，參與眾多高級精神活動，例如學(xué)習(xí)、記憶、情緒等。因此，海馬神經(jīng)元在高級神經(jīng)功能中發(fā)揮著重要的作用[1-3]。在1977年，Banker等[4]率先成功在體外分離并培養(yǎng)了海馬神經(jīng)元，為細(xì)胞層次的神經(jīng)科學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。此后，神經(jīng)元培養(yǎng)技術(shù)得到了進(jìn)一步完善及發(fā)展[5-6]。在海馬神經(jīng)元分離培養(yǎng)過程中，步驟復(fù)雜，可變性大，關(guān)鍵步驟條件的優(yōu)化對于成功培養(yǎng)海馬神經(jīng)元至關(guān)重要。本實驗通過比對不同條件下神經(jīng)元生長存活狀態(tài)，優(yōu)化分離培養(yǎng)條件，從而為后續(xù)相關(guān)研究提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 孕18 d的雌性Wistar大鼠3只，購自北京維通利華實驗動物中心，動物合格證號：SCXK京2014-2015，許可證號：SCXK京20110011-001。本實驗遵循《實驗動物保護(hù)條例》。

1.2 主要試劑 杜氏改良培養(yǎng)液(Dulbecco’s modified eagle medium, DMEM-F12)、神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基(neurobasal medium)、0.05%胰酶+EDTA、B-27無血清添加劑、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco公司；多聚賴氨酸(poly-D-lysine, PDL)、青霉素/鏈霉素(penicillin and streptomycin, P/S)、L型谷氨酰胺購自sigma公司；Hank’s 平衡鹽溶液(Hank’s Balanced salt solution， HBSS) 自制：8 g/L NaCl，0.4 g/L KCl，1 g/L葡萄糖，60 mg/L KH2PO4，47.5 mg/L Na2HPO4，0.35 g/L NaHCO3，調(diào)pH至7.2。

1.3 主要儀器 解剖顯微鏡(Nikon SMZ445，尼康公司)；超凈工作臺(SCB-1360 北京東聯(lián)哈爾有限公司)；倒置相差顯微鏡(Nikon TS100，尼康公司)；CCK-8試劑盒(A311-01，Vazyme公司)；酶標(biāo)儀(MK3，Thermo公司)。

1.4 方法

1.4.1 準(zhǔn)備工作：PDL包被培養(yǎng)皿或者爬片：研究設(shè)計了0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、2 mg/mL的PDL包被組，觀察最佳包被濃度。將培養(yǎng)皿加入PDL工作液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育40 min，回收PDL工作液，將培養(yǎng)皿置于超凈工作臺中晾干。晾干后用無菌的去離子水洗3次，去除為包被于皿底的PDL，然后將培養(yǎng)皿晾干備用。

1.4.2 神經(jīng)元分離培養(yǎng)過程：①取材：頸椎脫臼處死孕18 d Wistar大鼠，將大鼠全身浸泡于75%消毒酒精中10～20 s。然后移至超凈工作臺，使用無菌器械剪開皮膚，更換無菌器械剪開腹肌及腹膜，暴露腹腔。連同子宮一起取出所有胎鼠至無菌的冷的HBSS中浸泡。用眼科剪取頭，用顯微解剖鑷分別剝離頭皮、顱骨、硬腦膜，暴露腦組織。用眼科鑷小心完整地取出大腦、小腦及中腦，置于無菌的冷的HBSS中。在解剖顯微鏡下放置盛有少量無菌HBSS的皿，將剝離好的腦組織置于鏡下，用顯微解剖鑷小心剝離腦組織表面的血管等結(jié)締組織，其中海馬處的結(jié)締組織可由左右向中間剝離，動作輕柔，一般可完整剝下所有結(jié)締組織。然后用維納斯剪將海馬部分小心剪下，置于冷的HBSS中。

② 消化：用維納斯剪將上一步的海馬組織剪碎，用無菌移液器移至無菌離心管中，靜置，待海馬組織下沉至管底后，小心地移除上清，加入5 mL預(yù)熱至37 ℃的0.05%的胰酶消化液。置于37 ℃水浴消化10 min，期間每隔2～3 min輕柔晃動管子，使組織懸浮起來，利于消化。10 min后，加入含有10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，靜置，待組織沉淀后移除上清，加入5 mL DMEM/F12(含10% BS)培養(yǎng)基，輕柔吹起組織，以洗去殘留的胰酶，重復(fù)洗3～4次。最后加入3～5 mL(根據(jù)組織量而定)DMEM/F12(含10% FBS)，用力吹打10～20下使消化完的組織分散為單細(xì)胞。使用200目篩網(wǎng)過濾后取細(xì)胞懸浮液進(jìn)行稀釋。

③ 細(xì)胞計數(shù)：稀釋后的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，取干凈的細(xì)胞計數(shù)板，加入細(xì)胞懸浮液，靜置2 min后開始計數(shù)：將細(xì)胞計數(shù)板洗凈擦干，將細(xì)胞懸浮液滴入細(xì)胞計數(shù)板上，置于顯微鏡下靜置2 min后計數(shù)。公式如下：細(xì)胞數(shù)/L=4大格細(xì)胞數(shù)/4×稀釋倍數(shù)×107。

④ 細(xì)胞接種：預(yù)熱好神經(jīng)元培養(yǎng)液(1%glutamate+2%B27+97%neurobasal medium)加入培養(yǎng)皿中，6孔板每孔接種30萬神經(jīng)元。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后神經(jīng)元貼壁，可予以更換全部培養(yǎng)液，以后每3 d換1/3～1/2的培養(yǎng)液。

1.4.3 神經(jīng)元形態(tài)觀察及檢測： ①形態(tài)觀察：用相差顯微鏡觀察不同處理組神經(jīng)元生長狀態(tài)并拍照。②神經(jīng)元活性檢測：用CCK-8試劑盒檢測不同時間不同處理組神經(jīng)元活性，以反映神經(jīng)元存活情況。

1.4.4 驗證試驗：用酶標(biāo)儀檢測不同處理組神經(jīng)元第8天的培養(yǎng)液在450 nm處的吸光度值，進(jìn)行3次獨立重復(fù)試驗。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察 倒置相差顯微鏡下觀察，接種4 h后大部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁(90%以上)，此時神經(jīng)元沒有突起生長，呈圓形或略橢圓形。1 d后神經(jīng)元開始長突起，約3～4 d后突起明顯增長，相鄰神經(jīng)元突起相互交織，胞體增大，呈圓形或紡錘形，6～8 d逐漸成熟，胞體圓潤飽滿，光暈顯著。實驗選取第7天的神經(jīng)元觀察對比不同組之間的差異，發(fā)現(xiàn)PDL濃度為0.1～0.5 mg/mL時神經(jīng)元形態(tài)最佳，見圖1。反應(yīng)神經(jīng)元狀態(tài)較好，而過高濃度和過低濃度時神經(jīng)元突起均僵硬、變直且飄起、未貼壁，胞體出現(xiàn)類似凋亡小泡的空泡結(jié)構(gòu)。繼續(xù)觀察至10 d后此組神經(jīng)元大部分死亡。

圖1 第7天不同處理組神經(jīng)元形態(tài)(×200)Fig.1 Morphology of neurons in different groups in day 7(×200)

2.2 神經(jīng)元存活活力檢測 用CCK-8試劑盒檢測神經(jīng)元活力狀態(tài)，活力與吸光度成正比，可以反映存活情況。見圖2，結(jié)果表明：0.01～2 mg/mL各組450 nm的吸光度OD值平均值分別為0.15896、0.2568、0.32158、0.4122、0.41369、0.3658、0.20235、0.10235，PDL在(0.01～0.5 mg/mL)工作濃度范圍內(nèi)，海馬神經(jīng)元存活隨PDL濃度升高而增強，且高于一定范圍即產(chǎn)生明顯的毒性作用。

圖2 不同處理組吸光度值(n=3)Fig.2 Absorbance value of different treatment groups(n=3)

2.3 驗證試驗結(jié)果 圖1和圖2均經(jīng)過3次獨立重復(fù)試驗。由于神經(jīng)元為高度分化的細(xì)胞，不會增殖，因此CCK-8吸光度反映存活神經(jīng)元數(shù)。由圖2可以看出在0.25～0.75 mg/mL的PDL濃度時，神經(jīng)元形態(tài)最佳且活力最高，提示神經(jīng)元在0.25～0.75 mg/mL的PDL工作濃度時有最佳的存活狀態(tài)。

3 討論

神經(jīng)元培養(yǎng)技術(shù)對于神經(jīng)生物學(xué)的科學(xué)研究非常重要，特別是在細(xì)胞水平上進(jìn)行相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)化等研究中，能夠提供穩(wěn)定的、易于重復(fù)的，同時又便于實驗控制及干預(yù)的模型[5],例如研究馬達(dá)蛋白在神經(jīng)元中的作用過程中，需要體外培養(yǎng)神經(jīng)元[6], 在某些疾病模型中，體外神經(jīng)元培養(yǎng)也是重要的研究方法，例如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)先天性基因突變導(dǎo)致其不能調(diào)節(jié)型分泌[7]。因此，神經(jīng)元體外培養(yǎng)對于神經(jīng)科學(xué)工作人員來說是必備的基本的技能。

神經(jīng)元的體外培養(yǎng)技術(shù)的基本過程在國內(nèi)外已經(jīng)基本成熟[8-10]。由于取材過程中不可能完全分離膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元，同時由于操作誤差也容易污染成纖維細(xì)胞。膠質(zhì)細(xì)胞及成纖維細(xì)胞在血清的刺激下均有顯著的增殖，時間久了以后在培養(yǎng)過程中會明顯妨礙神經(jīng)元的觀察及實驗。因此采用血清替代物B27來提供神經(jīng)元生長必需的營養(yǎng)物質(zhì)，同時對于膠質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的生長有顯著的抑制作用。總的來說，神經(jīng)元在無血清培養(yǎng)基中生長情況良好，目前與在含有血清的培養(yǎng)環(huán)境中相比，生長狀態(tài)無異。

神經(jīng)元是高度分化的細(xì)胞，沒有分裂增殖，只能原代貼壁培養(yǎng)，因此其接種后的貼壁對于其存活來說至關(guān)重要。由于腦組織特殊的結(jié)構(gòu)，神經(jīng)元“天生”不具有較好的貼壁能力，因此需要事先于培養(yǎng)皿表面包被一層PDL以改變皿上的電荷，使細(xì)胞更易于結(jié)合貼附[11]。但是PDL對于細(xì)胞具有一定的毒性作用，因此其皿中剩余的PDL量對于神經(jīng)元的存活就尤為重要。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)PDL的包被效果對于神經(jīng)元的存活有重大影響，37 ℃包被40 min時，在0.25～0.75 mg/mL的工作濃度下神經(jīng)元存活最好，過高或者過低均對神經(jīng)元形態(tài)及活性有顯著抑制作用。因此實驗建議PDL包被條件為：0.25～0.75 mg/mL于37 ℃孵育40 min后，吸出PDL，晾干培養(yǎng)皿后用去離子水洗3遍后晾干備用。

神經(jīng)元取材過程中其他的關(guān)鍵步驟：①剝離結(jié)締組織膜的時候一定要剝離徹底，否則極易污染成纖維細(xì)胞；②盡量不要使用阿糖胞苷等分裂抑制劑，避免其對神經(jīng)元產(chǎn)生損傷作用，阿糖胞苷會極大影響神經(jīng)元的狀態(tài)；③胰酶消化的時間需要把握好，一般在10 min左右較好。時間過短會消化不充分，導(dǎo)致后續(xù)的吹打過程劇烈從而損傷細(xì)胞，消化時間過長會導(dǎo)致細(xì)胞損傷，同樣減少神經(jīng)元得量；④神經(jīng)元換半液對于神經(jīng)元狀態(tài)有重要作用，神經(jīng)元自身會分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子類物質(zhì)，如：BDNF、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)等。從而促進(jìn)神經(jīng)元的存活、生長等進(jìn)程[12]，換半液有助于保留神經(jīng)營養(yǎng)因子等營養(yǎng)物質(zhì)；⑤吹打細(xì)胞時要輕柔，盡量減少物理損傷；⑥離心對細(xì)胞也是一種損傷，所以應(yīng)盡量減少離心時間及離心次數(shù)。

綜上所述，PDL工作濃度及工作時間對于神經(jīng)元的存活至關(guān)重要。神經(jīng)元體外培養(yǎng)過程中各個細(xì)節(jié)均需要注意。本實驗中篩選的PDL工作濃度下神經(jīng)元生長良好，存活多。其他列舉的注意事項對于優(yōu)化神經(jīng)元體外培養(yǎng)技術(shù)均有很大幫助。

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(編校：王冬梅)

Study on working concentration of PDL in primary culture of rat hippocampal neuron

HAN Lu1, XIAO Feng2, ZHANG Xiu-mei3Δ

(1.Department of Biotechnology, Tianjin Vocational College of Bioengineering, Tianjin 300461, China; 2.Department of Gastroenterology and Endocrinology, Hebei Weichang County Hospital, Weichang 068450, China; 3.Department of Pharmacology, School of Medicine, Shandong University, Ji’nan 250012, China)

ObjectiveTo explore working of concentration of PDL used in primary culture of rat hippocampal neurons.Methods3 pregnant wistar rats were executed by cervical dislocation, the embryos were taken out and the hippocampal tissue was dissected quickly.Then the tissue was digested by trypsin and planted into dishes with proper concentration(300000/3.5cm vessle)which were coated by different PDL solution in different concentration (0.01,0.05,0.1,0.25,0.5,0.75,1,2 mg/mL).The state of the cultured neurons was observed to determine the most suitable concentration of PDL solution in coating dishes.Neurons activity was observed by CCK-8 Kit.ResultsMost neurons had adhered in 4 h.Protrusion of neurons began to grow in 1 d.The connection between neurons appeared in 4 d.Neurons matured and the network-connection was set up in 7 d.The best working concentration of PDL is between 0.25 and 0.75 mg/mL, neurons grew well and activity was optimum during this concentration.ConclusionThe working concentration of PDL is important for the hippocampal neuron culture and this work is worth being applied.

hippocampal neurons; primary culture;working concentration of PDL

韓璐，女，碩士，講師，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)，E-mail：luhan2010@126.com；張岫美，通訊作者，男，博士，教授，研究方向：中樞神經(jīng)損傷與修復(fù)的藥物干預(yù)及細(xì)胞分子機制，E-mail：zhangxm@sdu.edu.cn 。

R331

A

1005-1678(2015)05-0037-03