譚燕萍,朱永坤,姚暉
(1.佛山市禪城區(qū)朝陽醫(yī)院 藥劑科,廣東 佛山 528000;2.廣東省東莞市第三人民醫(yī)院 藥學部,廣東 東莞 523326;3.廣東省佛山市第二人民醫(yī)院 藥學部, 廣東 佛山 528000)
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大鼠腦出血后水腫組織中的PN-1、thrombin、PAR-1表達及其作用分析
譚燕萍1Δ,朱永坤2,姚暉3
(1.佛山市禪城區(qū)朝陽醫(yī)院 藥劑科,廣東 佛山 528000;2.廣東省東莞市第三人民醫(yī)院 藥學部,廣東 東莞 523326;3.廣東省佛山市第二人民醫(yī)院 藥學部, 廣東 佛山 528000)
目的 探討腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)實驗大鼠水腫周圍腦組織中蛋白酶連接素-1(protease nexin-1,PN-1)、 凝血酶(thrombin)、蛋白酶激活受體-1(protease activated receptor-1,PAR-1)的表達變化及其作用分析。方法 選取成年健康雄性SD大鼠80只,編號后隨機分為假手術組、ICH組,各40只。ICH組于右側尾狀核部注射自體動脈血方法制作ICH實驗大鼠模型,分別于術后第12、24、120 h對2組大鼠的神經功能障礙程度進行評價;HE染色觀察腦組織細胞中形態(tài);Western blot分別于造模后第3、6、10、12、24、48及120 h檢測2組大鼠腦組織中PN-1、thrombin、PAR-1實驗指標的變化情況。結果 ICH組大鼠的神經功能障礙評分在造模后第12、48、120 h均顯著的低于假手術組(P<0.05);ICH組大鼠在造模后第3、6、10、12、24、48及120 h的腦組織中PN-1、thrombin、PAR-1較假手術組均顯著的增高(P<0.05);ICH組大鼠的腦組織中PN-1、thrombin、PAR-1在造模后12 h或24 h出現(xiàn)逐漸下降的趨勢較造模后10 h或12 h(P<0.05)。結論 ICH實驗大鼠血腫周圍腦組織中PN-1有抑制thrombin及PAR-1過表達,引起神經損傷的作用。
腦出血;大鼠;腦組織;凝血酶抑制劑
腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是指非外傷性腦實質內血管破裂引起的出血,占全部腦卒中的20%~30%,相關臨床統(tǒng)計分析可見腦出血的發(fā)病率呈逐年上升趨勢,腦出血可引起患者出現(xiàn)認知功能、語言功能以及中樞神經系統(tǒng)功能障礙,嚴重降低了腦出血患者的生存質量[1]。目前臨床上對于腦出血的內科治療尚無特效,主要通過脫水等對癥處理。但外科治療的方法和作用仍存在爭議[2]。腦出血患者急性期主要表現(xiàn)為腦組織水腫,而出血部分腦組織的水腫程度對于內、外科治療效果具有極為重要的意義。有研究發(fā)現(xiàn)在腦水腫組織周邊存在凝血酶的異常表達[3]。本研究重在探討凝血酶、凝血酶受體以及凝血酶抑制劑在腦出血周邊水腫組織內的表達情況,進而揭示凝血酶對于腦出血的診治意義。
1.1 材料
1.1.1 實驗動物:選取成年健康雄性SD大鼠80只(8~9周齡),編號后隨機分為假手術組、ICH組,各40只,體質量260~300 g,平均體質量(272.4±13.9)g,購自廣東中山醫(yī)科大學動物實驗研究中心(許可證號:201500002),飼養(yǎng)于23 ℃~25 ℃、濕度40%~60%、光照12 h、自由進食、進水的環(huán)境中。
1.1.2 藥品與試劑:Trizol 試劑(Sigma 公司);dNTP、 AMV、0. 22 μm硝酸纖維素膜(鄭州寶賽生物科技公司);焦炭酸二已酯、瓊脂糖(INVITROGEN 公司);Whaterman 3mm 濾紙、兔多克隆抗 iNOS 抗體(上海生物工程技術服務有限公司);乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(上海政祥化學試劑有限公司);三羥甲基氨基甲烷,二硫蘇糖醇(Solarbio公司);甘氨酸、十二烷基磺酸鈉、考馬斯亮藍 R250、丙烯酰胺、過硫酸銨、溴酚藍、Tween 20 TEMED(Sigma 公司);DAB試劑盒(濃縮型)(北京中杉金橋生物技術有限公司)。
1.1.3 儀器:電熱恒溫培養(yǎng)箱JC303A-T型(成都一恒科技有限公司);生物組織包埋機BMJ-1(天津航空機電有限公司);電熱恒溫水浴箱(杭州藍天化驗儀器廠);大鼠腦立體定位儀(美國STOELTING公司);CUT5062型組織切片機(德國施利精密技術公司);圖像分析系統(tǒng)(美國Image-Pro P1us);PV-6000免疫組化二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。 OLYMPUS IX71倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。
1. 2 方法
1.2.1 造模方法[4]:大鼠以10%水合氯醛(330 mg/kg)腹腔麻醉后,剪尾取50 μL自體新鮮不凝血,于前囟前0.22 mm、中線向左旁開3 mm處鉆孔,在立體定向儀引導下緩慢進針注血。進針深約5 mm(此為左側尾狀核位置),進針時間3 min,留針時間10 min,之后緩慢退針。實驗前后各組大鼠均可自由進食水。假手術組除腦內不注入血液外,其余操作同ICH模型組。模型成功的判定標準為術后見明顯肢體癱瘓,沿針道冠狀面切開腦組織可見血腫形成[5]。實驗中2組各有4只大鼠死亡。造模成功率為90%。
1.2.2 觀察指標:分別于術后第12、24、120 h對2組大鼠的神經功能障礙程度進行評價(采用Carica等制定的大鼠神經功能障礙評分標準,最高18分、最低分3分,分數(shù)越低表示神經功能障礙越嚴重);分別于造模后第3、6、10、12、24、48及120 h檢測2組大鼠腦組織中PN-1、凝血酶(thrombin)、蛋白酶激活受體-1(PAR-1)的變化情況。
1.2.3 HE染色:切片在二甲苯中脫蠟5~10 min。移入二甲苯和純酒精(1:1)混合液中5 min左右(如經2次二甲苯脫蠟,此步可略)。加入100%、95%、85%、70%酒精,各級為2~5 min。最后經蒸餾水轉入染液。蘇木精染液染色5~15 min。水洗玻片上多余染液,0.5%~1%鹽酸酒精(70%酒精配制)分色片刻。鏡檢控制,直至細胞核及核內染色質清晰為止,約數(shù)10 s。流水沖洗15~30 min,或者在碳酸鋰飽和液中短時間堿化或藍化,即細胞核呈藍色。蒸餾水短洗。0.1%~0.5%伊紅染液染色1~5 min,若著色困難,可在每100 mL染液中加入1~2滴冰醋酸,使易著色且不易脫色。依次經70%、85%、95%、100%酒精脫水,各級為2~3 min,在95%以下濃度的酒精中伊紅易脫色,應適當縮短時間。二甲苯透明(2次),共約10 min。封片:擦去切片周圍多余二甲苯,切勿干涸,迅速滴加適量中性樹膠,再加蓋玻片封固
1.2.4 Western blot法:冰上分離出血腫周邊腦組織(假手術組為左側尾狀核),置于預冷的研缽中液氮研磨至粉末狀。冰上靜置1 h,4 ℃下14000 r/min離心30 min,去沉淀組織留上清液.考馬斯亮藍顯色法測定蛋白濃度,分裝。-70 ℃凍存。按總蛋白80 g計算上樣體積,4:1的比例加上樣緩沖液,每條泳道加20 μL樣品緩沖液,于60 V電壓下跑膠,脫脂蛋白封閉2 h,羊抗PN一抗體(1:200)、羊抗凝血酶抗體(1:500)、鼠抗PAR.1抗體(1:150),2 h后加入二抗(兔多克隆抗iNOS 抗體,稀釋:1:10)。Image proplus 4.01版本的專業(yè)圖像分析軟件進行圖像分析。
2.1 2組大鼠不同時間點的神經功能障礙評價 ICH組大鼠的神經功能障礙評分在造模后第12、48、120 h均顯著低于假手術組(P<0.05)。見表1。
表1 2組大鼠不同時間點的神經功能障礙評分比較分)Tab.1 Comparison of Neurological disorders scores between two groups rats at different time points(±s,scores)
*P<0.05,與假手術組比較,compared with sham operation
2.2 HE染色結果 倒置顯微鏡下可見假手術組大鼠腦組織結構清晰完整,神經細胞排列整齊,未發(fā)現(xiàn)明顯的細胞腫脹、細胞核固縮及溶解;ICH組大鼠在造模第12、48、120 h可見明顯的細胞排列紊亂、核溶解、固縮,炎癥細胞浸潤,可見部分腦組織出現(xiàn)液化壞死、呈空腔隙狀。見圖1。
圖1 假手術組和ICH組腦出血周圍組織病理變化(HE,×400)Fig.1 Sham group and ICH groups around the pathological changes of brain hemorrhage(HE,×400)
2.3 2組大鼠不同時間點的腦組織中PN-1、thrombin、PAR-1變化情況 2組大鼠不同時間點的腦組織中PN-1、Thrombin和PAR蛋白表達見圖2。ICH組大鼠在造模后第3 h、6 h、10 h、12 h、24 h、48 h及120 h的腦組織中PN-1、thrombin、PAR-1表達量均較假手術組明顯增高(P<0.05);ICH組大鼠的腦組織中PN-1、thrombin、PAR-1在造模后12 h出現(xiàn)逐漸下降的趨勢(P<0.05)。見表2、3、4。
圖2 PN-1、Thrombin和PAR蛋白表達的Western blot圖1:假手術組;2-8:分別為ICH組造模后第3、6、10、12、24、48及120 h Fig.2 PN-1, Thrombin and PAR protein expression by Western blot1:sham operation group; 2-8: corresponding to 3,6,10,12,24,48 and 120 h of ICH group after modeling
組別只數(shù)造模后3h造模后6h造模后10h造模后12h造模后24h造模后48h造模后120h假手術組360.45±0.050.46±0.100.47±0.080.51±0.130.42±0.090.41±0.050.40±0.07ICH組360.88±0.11△0.97±0.09Δ1.29±0.06△1.47±0.12△0.94±0.08△▲0.87±0.06△▲0.82±0.05△▲
△P<0.05,與假手術組比較,compared with sham operation group;▲P<0.05,與造模后第12h比較,compared with 12h after establishment of models
表3 2組間PN-1表達相對量比較
△P<0.05,與假手術組比較,compared with sham operation;▲P<0.05,與造模后第12h比較,compared with 12h after establishment of models
表4 2組間PAR-1表達相對量比較
△P<0.05,與假手術組比較,compared with sham operation;▲P<0.05,與造模后 12h 比較,compared with 12h after establishment of models
腦出血患者經內科治療或者外科清除血腫后,部分會出現(xiàn)合并不同的神經系統(tǒng)功能損傷,言語、聽寫以及運動功能損傷較為突出[6]。除了顱內血管出血部位及出血程度的影響,對于腦出血患者腦組織周邊水腫程度的分析也利于揭示患者術后出現(xiàn)不同并發(fā)癥的原因,并有利于預后判斷。凝血酶為內源性以及外源性凝血途徑的共同作用通路,凝血酶活性或者量的異常對于維持血管內凝血機制具有重要意義。凝血酶的異常表達可能預示彌漫性血管內凝血的凝血狀態(tài)、疾病轉歸以及病情程度,而其在腦出血中的研究較少。近年來部分學者發(fā)現(xiàn),在基底節(jié)腦出血周邊組織中存在凝血酶的異常激活和上調,其受體PAR-1表達也異常增高[7]。正常腦組織中,中樞神經系統(tǒng)的神經元包括大腦皮層扣帶回、皮質、下丘腦核團、丘腦腹側、中腦、海馬和小腦的神經元,均存在一定程度的PAR-1的表達,但HE染色多數(shù)較弱,蛋白水平表達程度較低,而血管內皮細胞中PAR-1的表達不清[8]。Thrombin抑制劑PN-1通過阻斷凝血酶與細胞膜表面的PAR-1的結合,進而降低細胞內三磷酸尿苷以及絡氨酸激酶的活性,下調在Xa因子(FXa)因子的作用下通過蛋白裂解的方式產生的凝血活酶,抑制凝血酶對于腦水腫組織的損傷作用[9]。本次研究重在探討凝血酶、凝血酶抑制劑以及凝血酶受體在大鼠腦出血模型中的表達差異。
2組大鼠造模后可見ICH組的神經系統(tǒng)功能評分明顯降低,HE染色可以發(fā)現(xiàn)假手術組大鼠腦組織結構清晰完整,神經細胞排列整齊,而ICH組大鼠腦細胞水腫以及壞死較為嚴重,細胞核崩解、碎裂,周邊神經膠質細胞可見部分腔隙樣以及液化性壞死,提示了本次造模的成功。本研究發(fā)現(xiàn),PN-1、Thrombin、PAR-1在腦出血大鼠腦組織中異常表達,其表達水平明顯高于假手術組,考慮腦出血對于腦組織的損傷不僅通過局部壓迫、血液凝固機化的損傷以及牽拉等作用,同時腦出血大鼠中凝血酶以及凝血酶作用受體的表達異常上升,促進神經纖維的細胞毒性損傷作用,而凝血酶抑制劑PN-1也繼發(fā)性顯著表達。時間特異度分析可見,在腦出血大鼠水腫吸收恢復期,凝血酶以及PAR-1、PN-1等呈現(xiàn)了下降的趨勢,腦出血后12h內,凝血酶對于出血腦血管通透性的改變促進了PAR-1對于水腫部位腦組織的損傷,而造模后12h,由于腦水腫部分水通道的關閉,凝血酶以及PAR-1對于受損部位神經纖維的水通道開放作用減弱,表達水平降低。凝血酶抑制劑PN-1通過特異性抑制凝血酶對于炎癥因子以及小膠質細胞富集作用,進而降低腦水腫程度[10]。本研究中并未發(fā)現(xiàn)PN-1與腦組織的水腫程度或者病情的恢復具有顯著的相關關系,考慮PN-1作為神經系統(tǒng)內存在的特異性較高的凝血酶抑制劑,可以與凝血酶的非催化中心位點結合,形成十二烷基磺酸鹽復合物,與損傷的神經纖維表面糖蛋白結合[11],通過低密度脂蛋白受體相關蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein,LRP)或者細胞膜的胞飲作用進入細胞內被降解或清除,減輕了凝血酶以及PAR-1對于腦水腫細胞的損傷[12]。
綜上所述,ICH實驗證實大鼠水腫周圍腦組織中PN-1與Thrombin、PAR-1異常表達,其中Thrombin、PAR-1與腦水腫損傷有關,而PN--1可減輕凝血酶對于腦出血周邊神經細胞的損傷作用,PN-1的這一作用揭示其可以作為腦出血患者內科治療的新途徑,通過在腦出血急性期外源性注射PN-1細胞因子,進而減輕腦出血水腫細胞損傷,改善臨床預后。
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(編校:王冬梅)
Expression and role of PN-1, thrombin and PAR-1 in rats brain edema tissue after intracerebral hemorrhage
TAN Yan-ping1Δ, ZHU Yong-kun2, YAO Hui3
(1. Department of Pharmacy, Foshan Chancheng Chaoyang Hospital, Foshan 528000, China; 2. Department of Pharmacy, Dongguan the Third People’s Hospital of Guangdong Province, Dongguan 523326, China; 3. Department of Pharmacy, Foshan People’s Hospital of Guangdong Province,Foshan 528000,China)
ObjectiveTo investigate expression and role of protease catenin-1(PN-1), thrombin(thrombin), protease activated receptor-1(PAR-1) in rats brain edema tissue after intracerebral hemorrhage(ICH).MethodsAdult male SD rats 80 were randomly divided into sham group,ICH group after number, 40 in each group, ICH group autologous arterial method of making a rat model of experimental ICH in the right caudate nucleus unit injection. The degree of neurological dysfunction between 2 groups was evaluated at 12 h,24 h and 120 h after post-operation. Observed the morphology of brain cells by HE staining. Changes of PN-1,thrombin, PAR-1 index in rat brain tissue at 3,6,10,12,24,48 and 120 h were detected by Western blot.ResultsNeurological dysfunction score ICH rats after modeling 12,48,120 h were significantly lower than the sham group(P<0.05); ICH in rats after modeling 3,6,10,12,24,48 and 120 h of brain tissue PN-1, thrombin, PAR-1 compared with sham-operated group were significantly increased(P<0.05); ICH rat brain tissue PN-1, thrombin, PAR-1 appeared in 12 h after modeling shwed a gradual downward trend(P<0.05).ConclusionICH hematoma surrounding brain tissue in rats PN-1 has the effect of inhibiting thrombin and PAR-1 overexpression, cause nerve damage.
intracerebral hemorrhage; rat; brain; thrombin inhibitors
廣東省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥強省課題(20121088)
譚燕萍,通信作者,女,碩士,副主任中藥師,研究方向:中藥藥學及臨床研究,E-mail:15212782883@qq.com。
R743.34
A
1005-1678(2015)11-0022-04