響應(yīng)面法優(yōu)化小球藻葉綠素提取工藝及其穩(wěn)定性研究

鄧祥元，成婕，劉孟姣，高坤，崔思宇

響應(yīng)面法優(yōu)化小球藻葉綠素提取工藝及其穩(wěn)定性研究

鄧祥元1,2，成婕1，劉孟姣1，高坤1，崔思宇1

（1.江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212018；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京210095）

采用響應(yīng)面法優(yōu)化蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidesa）葉綠素提取工藝，研究影響其穩(wěn)定性的相關(guān)因素。結(jié)果表明，小球藻葉綠素最優(yōu)提取條件為：固液比5 g·L-1，超聲溫度62℃，超聲時(shí)間2 h；在此條件下，模型預(yù)測(cè)提取量為11.24 mg·g-1，驗(yàn)證試驗(yàn)提取量為10.99 mg·g-1。室內(nèi)自然光、人工光、UV輻射、高溫、酸、堿、檸檬酸、高濃度麥芽糖、金屬離子Al3+、Fe2+和Fe3+等對(duì)小球藻葉綠素穩(wěn)定性有不同程度破壞作用；而氧化還原劑、葡萄糖、蔗糖、低濃度麥芽糖、VC、食鹽、金屬離子Mg2+、Ca2+、K+、Zn2+和Na+等對(duì)葉綠素穩(wěn)定性影響不顯著；Cu2+可增強(qiáng)小球藻葉綠素穩(wěn)定性。

蛋白核小球藻；葉綠素；提取工藝；響應(yīng)面分析法；穩(wěn)定性

小球藻（Chlorella sp.）是球形普生性單細(xì)胞藻類，富含色素、多糖、蛋白質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分，是可人工大規(guī)模培養(yǎng)的微藻種類之一[1-2]，其葉綠素含量為4%～6%，高于已商業(yè)化脫水苜蓿的葉綠素含量[3]。葉綠素屬于卟啉類化合物，無毒，可食用，有造血、提供維生素、解毒、抗病、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、脫臭等多種用途[4]，被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等行業(yè)[5-7]。但葉綠素易受光照、溫度、酸、堿等因素影響而發(fā)生脫鎂、脫植醇反應(yīng)，使其色澤發(fā)生變化而影響品質(zhì)。

目前，常見葉綠素提取方法主要有超臨界CO2法，吸附樹脂法和有機(jī)溶劑浸提法[8-10]。超臨界CO2法能縮短提取時(shí)間，減少提取劑使用量，受到關(guān)注[11]，但是該方法受操作復(fù)雜、設(shè)備昂貴、成本較高等因素困擾，應(yīng)用領(lǐng)域受到限制。因此，采用有機(jī)溶劑浸提法提取葉綠素，選用合適有機(jī)溶劑即可進(jìn)行提取，并輔助微波、超聲波或離子交換分離等手段提高提取效率和純度[12]。其中超聲波輔助法是利用超聲波在溶劑中傳播產(chǎn)生“空化效應(yīng)”，使物料進(jìn)一步破裂并將目標(biāo)產(chǎn)物釋放到提取溶劑中，可縮短提取時(shí)間，減少溶劑使用量，降低生產(chǎn)成本[13-14]。在前期工作中，利用超聲波輔助法對(duì)提取小球藻葉綠素工藝中的固液比、超聲溫度和超聲時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，本研究在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用響應(yīng)面法[15-17]優(yōu)化上述3個(gè)工藝參數(shù)對(duì)小球藻葉綠素提取影響，探索最優(yōu)提取工藝條件，同時(shí)根據(jù)不同條件下葉綠素含量變化情況，對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行研究，為利用藻類資源生產(chǎn)葉綠素提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidesa）藻粉購(gòu)自江蘇省東臺(tái)市賜百年生物工程有限公司；無水乙醇、甲醇等試劑均為分析純（上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品）。

UV-1800PC型紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；TEA-1004型臺(tái)姆超聲波（200 W，上海臺(tái)姆超聲波設(shè)備有限公司）；FA114型電子天平（上海?？惦娮觾x器廠）；Spectrafuge 6C型離心機(jī)（美國(guó)萊伯特（Labnet）儀器有限公司）；光照度計(jì)（浙江托普儀器有限公司）；紫外輻照計(jì)（北京師范大學(xué)光電儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 小球藻葉綠素的測(cè)定

稱取小球藻藻粉于離心管中，加入10 mL甲醇乙醇混合液（甲醇∶乙醇體積比為1∶3），搖勻并置于超聲波內(nèi)，超聲波作用一定時(shí)間后；將提取液在5 000 r min-1下離心5 min，取上清液于比色皿中，以所用提取溶劑為參比，在波長(zhǎng)645和663 nm下測(cè)其吸光值。利用以下公式計(jì)算葉綠素a（Ca）、葉綠素b（Cb）及總?cè)~綠素（CT）的提取量[18-19]：

式中，V-提取液體積（L）；W-藻粉質(zhì)量（g）。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

按照1.2.1方法，研究固液比（2、3、4、5、6、7、8、10、20、25 g·L-1）、超聲溫度（40、50、60、70℃）和超聲時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5、3 h）對(duì)小球藻葉綠素提取量的影響。

1.2.3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化影響小球藻葉綠素提取量的3個(gè)因素，即固液比（X1），超聲溫度（X2）和超聲時(shí)間（X3），并以-1、0、+1代表其水平（見表1）。

表1 小球藻葉綠素提取工藝Box-Behnken試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1Factor levels design of Box-Behnken experiments for optimizing extraction process of chlorophyll from C.pyrenoidesa

采用Design Expert 7.1.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，獲得各因素一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及其交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)方程，并對(duì)小球藻葉綠素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 光對(duì)小球藻葉綠素穩(wěn)定性的影響

取小球藻葉綠素提取液置于不同光環(huán)境條件下，設(shè)置避光處理組（DL）、室內(nèi)自然光照組（NL）、人工光照組（AL）和紫外線輻射組（UV）；其中人工光照組設(shè)3種光強(qiáng)度，分別為1 000 lx（AL1）、3 000 lx（AL2）和5 000 lx（AL3）；紫外線輻射組設(shè)3種輻射強(qiáng)度，分別為2 μw·cm-2（UV1）、7 μw·cm-2（UV2）和20 μw·cm-2（UV3）。

1.2.5 溫度及pH對(duì)小球藻葉綠素穩(wěn)定性的影響

設(shè)置不同溫度梯度[4℃、室溫（約30℃）、40、50和60℃]和pH（2、4、6、8、10、12），研究不同溫度及pH對(duì)小球藻葉綠素穩(wěn)定性的影響。

1.2.6 金屬離子對(duì)小球藻葉綠素穩(wěn)定性的影響

向葉綠素提取液中加入常見金屬離子Mg2+（Mg?SO4）、Ca2+（CaCl2）、K+（KCl）、Cu2+（CuSO4）、Zn2+（ZnCl2）、Na+（NaCl）、Al3+（Al2（SO4）3）、Fe2+（Fe?SO4）、Fe3+（FeCl3），濃度為10 mmol·L-1；于室溫黑暗條件下處理10 d后測(cè)量各組葉綠素含量，并計(jì)算葉綠素殘存率。

1.2.7 常見食品添加劑對(duì)小球藻葉綠素穩(wěn)定性的影響

在葉綠素提取液中加入常見食品添加劑，蔗糖、食鹽、葡萄糖、維生素C（VC）、檸檬酸，其濃度分別為10%、3%、2%、0.5%和1.6%，在室溫黑暗條件下，每24 h測(cè)定葉綠素含量。

1.2.8 小球藻葉綠素耐氧化還原性試驗(yàn)

向葉綠素提取液中分別加入不同濃度Na2SO3（25、50、100、200 mmol·L-1）和H2O2（12.5、25、50、100 mmol·L-1），置于室溫黑暗條件下分別處理1和2 h后依次測(cè)定各組中葉綠素含量，并計(jì)算殘存率。

1.2.9 小球藻葉綠素耐糖性試驗(yàn)

向葉綠素提取液中加入蔗糖、葡萄糖、麥芽糖，并設(shè)定不同濃度梯度（5%、10%、20%、40%），在室溫黑暗條件下分別處理2.5和5 h后測(cè)定各組葉綠素含量，并計(jì)算殘存率。

1.2.10 葉綠素含量及其殘存率的計(jì)算

以提取溶劑為空白對(duì)照，用分光光度計(jì)測(cè)定葉綠素提取液在645和663 nm波長(zhǎng)下吸光值，利用以下公式計(jì)算葉綠素含量和殘存率[18-19]：

C（mg·g-1）=8.04×OD663+20.29×OD645×V/W；

殘存率（%）=（C/C0）×100%；

式中，C0和C分別為處理前后葉綠素含量（mg·g-1）；OD663和OD645為葉綠素提取液在663和645 nm下吸光值。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

固液比、超聲溫度及超聲時(shí)間對(duì)小球藻葉綠素提取量的影響如圖1所示。

圖1 固液比、超聲溫度、超聲時(shí)間對(duì)小球藻葉綠素提取量的影響Fig.1Effects of solid-to-solvent ratio,ultrasonic temperature and time on extraction amount of chlorophyll from C.pyrenoidesa

由圖1A可知，小球藻葉綠素提取量隨固液比增加而下降，這主要是隨固液比增大，兩相間濃度差變小，導(dǎo)致傳質(zhì)推動(dòng)力小；相反，降低固液比會(huì)較大程度提高傳質(zhì)推動(dòng)力，但也增加生產(chǎn)成本及后續(xù)處理難度，因而固液比的選擇應(yīng)兼顧過程的經(jīng)濟(jì)性與簡(jiǎn)便性[20]。從降低成本、方便操作、易于放大等方面考慮，選擇5、6、7 g·L-1為響應(yīng)面分析時(shí)固液比的3個(gè)水平。

由圖1B可知，隨超聲溫度升高，小球藻葉綠素提取量先增加后基本不變；這是由于隨溫度升高，溶劑分子運(yùn)動(dòng)加快，使葉綠素與提取溶劑間相互作用隨溫度升高而增強(qiáng)；但溫度越高，提取劑揮發(fā)越快，對(duì)葉綠素破壞作用也越大[21]。因此，綜合考慮各因素，響應(yīng)面分析時(shí)超聲溫度選擇50、60和70℃3個(gè)水平。

圖1C表示超聲時(shí)間對(duì)小球藻葉綠素提取量的影響，提取量隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)先增加后基本不變。這是由于在提取初始，原料與提取劑兩相間的濃度差較大，促進(jìn)葉綠素快速溶解并擴(kuò)散至提取劑，但隨著時(shí)間推移，葉綠素在溶劑中的濃度不斷增大，濃度差逐漸變小，擴(kuò)散速度變慢，提取一定時(shí)間后，兩相間濃度達(dá)到平衡，提取過程基本完成，這時(shí)繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間不能提高提取效率，反而會(huì)由于超聲時(shí)間過長(zhǎng)造成葉綠素?fù)p失、雜質(zhì)溶出和溶劑揮發(fā)等[9]。因此，在進(jìn)行響應(yīng)面分析時(shí)超聲時(shí)間選取的3水平為1、1.5和2 h。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 小球藻葉綠素提取工藝的響應(yīng)面分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用3因素3水平的響應(yīng)面法優(yōu)化小球藻葉綠素提取工藝，結(jié)果見表2。

此次Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案共有17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為析因試驗(yàn)，其余5個(gè)為中心試驗(yàn)。析因點(diǎn)為自變量取值在X1、X2、X3構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)區(qū)域?yàn)橹行狞c(diǎn)，零點(diǎn)區(qū)域重復(fù)5次，用于估計(jì)試驗(yàn)誤差。

2.2.2 回歸方程的建立與檢驗(yàn)

利用Design Expert 7.1.6分析軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到小球藻葉綠素提取量對(duì)固液比（X1）、超聲溫度（X2）和超聲時(shí)間（X3）3個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程：

表2 小球藻葉綠素提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2Experimental design and corresponding results of response surface experiments for optimizing extraction process of chlorophyll from C.pyrenoidesa

以上二次多項(xiàng)回歸方程的方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，回歸模型高度顯著（P=0.0071＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.7715＞0.05），以及Adjusted R2=0.7871和Adep precision= 9.428遠(yuǎn)大于4，可知回歸方程擬合度和可信度均較高。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，方程一次項(xiàng)X1和X2對(duì)小球藻葉綠素提取量的線性效應(yīng)極顯著，而X3對(duì)小球藻葉綠素提取量無顯著影響（P=0.0848＞0.05），各因素對(duì)小球藻葉綠素提取量的影響大小分別為X1＞X2＞X3；二次項(xiàng)中X22對(duì)小球藻葉綠素提取量的影響顯著；交互作用項(xiàng)中X2X3對(duì)小球藻葉綠素提取量有顯著影響。

2.2.3 因素間的交互作用分析

用Design Expert 7.1.6軟件根據(jù)回歸方程進(jìn)行繪圖分析，得到響應(yīng)面圖2。

表3 小球藻葉綠素提取工藝優(yōu)化的回歸方程的方差分析及其系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 3Variance analysis and significance test of the regression equation of response surface experiments for optimizing extraction process of chlorophyll from C.pyrenoidesa

圖2各因素交互作用對(duì)小球藻葉綠素提取量的影響Fig.2Interaction effects of every two factors on extraction amount of chlorophyll from C.pyrenoidesa

圖2 A顯示當(dāng)超聲時(shí)間為1.5 h時(shí)，超聲溫度與固液比間的交互作用對(duì)小球藻葉綠素提取量的影響，這兩個(gè)因素的交互作用不顯著；隨超聲溫度和固液比增加，葉綠素提取量先緩慢提高，然后緩慢降低，表明葉綠素提取量可以承受超聲溫度和固液比的微小變化；同時(shí)適當(dāng)?shù)某暅囟群凸桃罕瓤稍谝欢ǔ潭壬咸岣呷~綠素提取量。由圖2B可知，當(dāng)固液比為6 g·L-1時(shí)，超聲時(shí)間與超聲溫度對(duì)小球藻葉綠素提取量的交互作用表現(xiàn)為顯著水平，當(dāng)超聲溫度在低水平時(shí)，超聲時(shí)間的響應(yīng)面拋物曲線最高點(diǎn)在高水平；當(dāng)超聲溫度在高水平時(shí)，超聲時(shí)間的響應(yīng)面拋物曲線最高點(diǎn)在低水平，選取最優(yōu)組合的超聲時(shí)間和超聲溫度可使小球藻葉綠素提取量最高。圖2C顯示當(dāng)超聲溫度為60℃時(shí)，超聲時(shí)間與固液比的交互作用對(duì)小球藻葉綠素提取量的影響，這兩個(gè)因素的交互作用不顯著；超聲時(shí)間一定時(shí)，葉綠素提取量隨固液比增加而降低；固液比一定時(shí)，隨超聲時(shí)間增加葉綠素提取量先增加后減少；高水平超聲時(shí)間和低水平固液比可使小球藻葉綠素提取量處于高水平。

2.2.4 最佳工藝條件確定

根據(jù)Box-Behnken分析模型得知，小球藻葉綠素最優(yōu)提取工藝條件為：固液比5 g·L-1，提取溫度61.91℃，提取時(shí)間2 h。在此工藝條件下，所得小球藻葉綠素提取量理論值為11.24 mg·g-1。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得最優(yōu)工藝的可靠性，同時(shí)考慮實(shí)際操作情況，將小球藻葉綠素提取工藝條件修正為固液比5 g·L-1，超聲溫度62℃，超聲時(shí)間2 h，實(shí)際測(cè)得小球藻葉綠素提取量為10.99 mg·g-1，與理論預(yù)測(cè)值間誤差為2.19%（＜5%）。

2.3 小球藻葉綠素穩(wěn)定性分析

2.3.1 光照對(duì)小球藻葉綠素穩(wěn)定性的影響

不同光照條件對(duì)小球藻葉綠素穩(wěn)定性的影響如圖3所示。由圖3A可知，室內(nèi)自然光與人工光對(duì)小球藻葉綠素穩(wěn)定性影響很大，其中人工光源光照強(qiáng)度越大對(duì)葉綠素破壞作用越顯著，室內(nèi)自然光對(duì)葉綠素也有較強(qiáng)破壞作用，放置在黑暗處的葉綠素濃度變化很小。這可能是因?yàn)槿~綠素中多不飽和雙鍵很不穩(wěn)定，在光照下，活性氧往往可激活碳環(huán)的多不飽和雙鍵而引起葉綠素環(huán)降解；而且人工光和自然光中可見光及紅外線可以產(chǎn)生熱量，提高溫度，從而加速自由基等氧化性強(qiáng)的物質(zhì)對(duì)葉綠素的破壞作用；同時(shí)長(zhǎng)時(shí)間光照也會(huì)導(dǎo)致葉綠素光敏氧化，降解為無色產(chǎn)物，從而使葉綠素含量大幅度降低[22-24]。圖3B表明紫外光對(duì)小球藻葉綠素穩(wěn)定性有一定影響，而且紫外光強(qiáng)度越大對(duì)葉綠素的破壞作用越強(qiáng)，但＜7 μw·cm-2的低強(qiáng)度紫外光比室內(nèi)自然光照對(duì)葉綠素破壞作用小，而高強(qiáng)度紫外光比室內(nèi)自然光照對(duì)葉綠素破壞作用大。這可能是由于紫外光照射具有產(chǎn)生自由基的作用[22]，不同紫外照射強(qiáng)度可能不同程度破壞葉綠素結(jié)構(gòu)，使葉綠素含量呈下降趨勢(shì)[25-26]。

圖3 光照對(duì)小球藻葉綠素穩(wěn)定性的影響Fig.3Effects of light on stability of chlorophyll from C.pyrenoidesa

2.3.2 溫度對(duì)小球藻葉綠素穩(wěn)定性的影響

由圖4可以看出，小球藻葉綠素在低溫條件下較穩(wěn)定，如在4℃、室溫、40℃水浴下葉綠素含量變化不明顯；50℃水浴下葉綠素含量有所增加；而當(dāng)溫度過高時(shí)葉綠素穩(wěn)定性降低，如在60℃水浴下葉綠素含量明顯下降，這與曾家豫等對(duì)紫堇葉綠素穩(wěn)定性研究結(jié)果[27]一致。這可能是由于低溫可抑制細(xì)菌及葉綠素內(nèi)部酶對(duì)葉綠素的破壞作用，使葉綠素穩(wěn)定性相對(duì)增加；但高溫條件下，葉綠素分解產(chǎn)生自由基，在高溫及氧作用下，葉綠素被迅速降解，同時(shí)在高溫條件下，葉綠素卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)中心Mg2+脫落而引起脫色[27]，使葉綠素含量降低。由此可見，低溫是保證葉綠素質(zhì)量重要條件，應(yīng)避免高溫長(zhǎng)時(shí)間加熱，葉綠素產(chǎn)品最好在室溫下避光保存。

2.3.3 pH對(duì)小球藻葉綠素穩(wěn)定性的影響

pH對(duì)小球藻葉綠素穩(wěn)定性的影響見圖5。

圖4 溫度對(duì)小球藻葉綠素穩(wěn)定性的影響Fig.4Effects of temperature on stability of chlorophyll from C.pyrenoidesa

圖5 pH對(duì)小球藻葉綠素穩(wěn)定性的影響Fig.5Effects of pH on stability of chlorophyll from C.pyrenoidesa

由圖5可知，小球藻葉綠素在酸性或堿性條件下均不穩(wěn)定，pH為2、4、6的試驗(yàn)管葉綠素變?yōu)榛疑?；弱堿性條件下，葉綠素相對(duì)穩(wěn)定，pH為8時(shí)葉綠素最穩(wěn)定；強(qiáng)堿條件下葉綠素變?yōu)辄S綠色且pH越大綠色越淺，葉綠素含量越少。這可能是由于葉綠素是雙羧酸酯，一定濃度酸堿介質(zhì)均會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響，葉綠素中心Mg2+極不穩(wěn)定，在酸性條件下易被H+取代，導(dǎo)致葉綠素脫鎂降解生成葉綠酸；堿性過強(qiáng)則會(huì)加速脫酯反應(yīng)使葉綠素分解，在堿性條件下，葉綠素不發(fā)生脫鎂和碳環(huán)裂解反應(yīng)，色澤相對(duì)穩(wěn)定[28]。由此可知，葉綠素在偏堿性條件下穩(wěn)定性最好，與孫鶴等對(duì)綠色蔬菜汁中葉綠素穩(wěn)定性研究結(jié)果[29]一致。因此，將此類葉綠素儲(chǔ)存在微堿性或者中性環(huán)境下可增強(qiáng)穩(wěn)定性。

2.3.4 金屬離子對(duì)小球藻葉綠素穩(wěn)定性的影響

由表4可以看出，Al3+和Fe3+與葉綠素反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，顏色變?yōu)辄S綠色；Fe2+與葉綠素反應(yīng)產(chǎn)生少量沉淀，顏色變?yōu)椴菥G色；Cu2+與葉綠素反應(yīng)，顏色基本沒變，葉綠素含量提高；其他金屬離子Mg2+、Ca2+、K+、Zn2+和Na+與葉綠素反應(yīng)顏色基本不變，對(duì)葉綠素穩(wěn)定性無影響。葉綠素多不飽和雙鍵很不穩(wěn)定，易被氧化降解，Al3+和Fe3+均具有氧化性，均對(duì)葉綠素有氧化破壞作用，使葉綠素含量降低；Fe2+使葉綠素變色降解，可能是因?yàn)椴糠諪e2+被氧化生成Fe3+而使葉綠素降解變色；Cu2+使葉綠素含量增加的原因可能是葉綠素中Mg2+易被H+取代形成去鎂葉綠素，并與Cu2+結(jié)合生成綠色銅代葉綠素使其穩(wěn)定性增加[30]，這與馮愛青等關(guān)于金屬離子對(duì)大葉黃楊葉綠素的研究結(jié)果[4]一致。因此，小球藻葉綠素在生產(chǎn)儲(chǔ)存過程中應(yīng)避免與Al3+、Fe3+、Fe2+等金屬離子接觸。

2.3.5 食品添加劑對(duì)小球藻穩(wěn)定性的影響

由圖6可以看出，食品添加劑蔗糖、食鹽、葡萄糖和VC對(duì)小球藻葉綠素穩(wěn)定性基本無影響，檸檬酸使葉綠素含量降低。這可能是因?yàn)闄幟仕岢嗜跛嵝砸资谷~綠素失去卟啉環(huán)中的鎂成為去鎂葉綠素，使葉綠素降解變?yōu)榛揖G色，穩(wěn)定性降低。

表4 金屬離子對(duì)小球藻葉綠素穩(wěn)定性的影響Table 4Effects of metallic ions on stability of chlorophyll from C.pyrenoidesa

圖6 食品添加劑對(duì)小球藻葉綠素穩(wěn)定性的影響Fig.6Effects of food additives on stability of chlorophyll from C.pyrenoidesa

2.3.6 耐氧化還原性

由表5可以看出，小球藻葉綠素在試驗(yàn)條件下耐氧化還原性較強(qiáng)，色調(diào)不變，殘存率在99%以上，與吳榮金等對(duì)鳳眼蓮葉葉綠素穩(wěn)定性研究結(jié)果基本一致[28]，但與張亮等研究大葉黃楊葉綠素穩(wěn)定性結(jié)果有所不同[30]?；诒狙芯拷Y(jié)果，小球藻葉綠素穩(wěn)定性較強(qiáng)，可耐受較高濃度氧化劑、還原劑的長(zhǎng)時(shí)間作用，應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⑦M(jìn)一步擴(kuò)大。

2.3.7 耐糖性試驗(yàn)

結(jié)果見表6。小球藻葉綠素對(duì)蔗糖和葡萄糖具有較好的耐性，因此該葉綠素可用于含蔗糖及葡萄糖較高的食品和飲料中，具有較大開發(fā)利用價(jià)值。但小球藻葉綠素對(duì)高濃度麥芽糖耐性較差，在含麥芽糖較高的食品中應(yīng)限制使用，但其色調(diào)基本為綠色，表明小球藻葉綠素具有耐糖性。

表5 H2O2和Na2SO3對(duì)小球藻葉綠素穩(wěn)定性的影響Table 5Effects of H2O2and Na2SO3on stability of chlorophyll from C.pyrenoidesa

表6 不同糖類對(duì)小球藻葉綠素穩(wěn)定性的影響Table 6Effects of different sugar concentrations on stability of chlorophyll from C.pyrenoidesa

3 討論與結(jié)論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化蛋白核小球藻葉綠素提取工藝，得到最優(yōu)提取工藝條件為：固液比5 g·L-1，提取溫度62℃，提取時(shí)間2 h。在此工藝條件下，小球藻葉綠素提取量為10.99 mg·g-1。影響小球藻葉綠素提取量的因素主次順序?yàn)椋汗桃罕龋境暅囟龋境晻r(shí)間，且超聲溫度和超聲時(shí)間交互作用顯著。

本研究結(jié)果表明，自然光照、人工光照、UV輻射、高溫、酸、堿、檸檬酸、高濃度麥芽糖、Al3+、Fe2+和Fe3+等對(duì)小球藻葉綠素穩(wěn)定性均有影響；其中光照對(duì)葉綠素穩(wěn)定性影響極顯著，隨著光照強(qiáng)度增加小球藻葉綠素降解加快；但葉綠素能耐受一定溫度，當(dāng)溫度超過60℃后小球藻葉綠素才會(huì)降解；酸性條件下葉綠素溶液變?yōu)榛疑粔A性條件下葉綠素降解溶液變?yōu)辄S綠色，堿性越強(qiáng)葉綠素降解越快，顏色越淺；檸檬酸可使葉綠素降解，溶液變?yōu)榛揖G色；小球藻葉綠素能耐受蔗糖、葡萄糖和低濃度麥芽糖，但麥芽糖濃度過高時(shí)小球藻葉綠素含量降低；金屬離子Al3+、Fe3+和Fe2+與葉綠素接觸產(chǎn)生沉淀且使葉綠素降解溶液分別變?yōu)辄S綠色、灰綠色和黃綠色；此外，小球藻葉綠素具有較強(qiáng)的耐氧化還原性。因此，小球藻葉綠素及其產(chǎn)品在生產(chǎn)加工儲(chǔ)存過程中應(yīng)盡量采取避光處理，pH控制在微堿性或中性范圍內(nèi)，避免加入檸檬酸等酸性食品添加劑，避免接觸含鐵、鋁制品。

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Study on optimization of chlorophyll extraction fromChlorella pyrenoi?desaand its stability evaluation by response surface methodology/

DENG Xiangyuan1,2,CHENG Jie1,LIU Mengjiao1,GAO Kun1,CUI Siyu1（1.School of Biotechnology, Jiangsu University of Science and Technology,Zhenjiang Jiangsu 212018,China;2.School of Resources and Environmental Sciences,NanjingAgricultural University,Nanjing 210095,China)

Response surface methodology(RSM)was employed to optimize the extraction conditions of chlorophyll fromChlorella pyrenoidesa.And effects of factors on stability of chlorophyll were also studied. Results showed that the optimum extraction conditions were solid-to-solvent ratio 5 g·L-1,ultrasonic temperature 62℃,and ultrasonic time 2 h.Under these conditions,the maximum predicted extraction amount of chlorophyll fromC.pyrenoidesawas 11.24 mg·g-1,which was close to the actual value of 10.99 mg·g-1.In addition,it was showed that these factors,including natural light in room(NL),artificial light(AL),ultraviolet radiation(UV),high temperature,strong acid/base,citric acid,high concentration of maltose,Al3+,Fe2+and Fe3+, had remarkable effects on the stability of chlorophyll.However,other factors,such as oxidant and reductant, glucose,sucrose and low concentration of maltose,vitamin C,salt,and Mg2+,Ca2+,K+,Zn2+and Na+had no effects on the stability of chlorophyll.Cu2+could enhance the stability of chlorophyll in solution.

Chlorella pyrenoidesa;chlorophyll;extraction process;response surface methodology; stability evaluation

TS202.3

A

1005-9369（2015）07-0040-10

時(shí)間2015-7-9 14:42:42[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150709.1442.009.html

鄧祥元,成婕,劉孟姣,等.響應(yīng)面法優(yōu)化小球藻葉綠素提取工藝及其穩(wěn)定性研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,46(7)∶40-49.

Deng Xiangyuan,Cheng Jie,Liu Mengjiao,et al.Study on optimization of chlorophyll extraction fromChlorella pyrenoidesa and its stability evaluation by response surface methodology[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(7)∶40-49.(in Chinese with English abstract)

2015-02-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31200381）；中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（2013M531370，2014T70532）；國(guó)家海洋局近岸海域生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目（201209）

鄧祥元（1982-），男，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槲⒃迳镏破贰-mail:dengxy2009@126.com