江浙滬甜瓜白粉病菌及其生理小種的鑒定

李蘋芳　朱凌麗　羊杏平　徐錦華　劉廣　姚協(xié)豐　牛徐江

摘 要： 為明確江浙滬地區(qū)甜瓜白粉病致病菌種類及優(yōu)勢生理小種，2014年秋季從江浙滬地區(qū)包括江蘇宿遷宿城、淮安、南京六合、南京玄武、蘇州吳中、南通海門，上海嘉定、奉賢，浙江寧波等地大棚甜瓜植株上采集了9份白粉病菌，通過鏡檢白粉孢子、考馬斯亮藍(lán)染色菌絲推斷上述白粉病菌為單囊殼白粉菌Podosphaera xanthii；以南京玄武地區(qū)的白粉病菌DNA為模板擴增克隆其rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列，分析確認(rèn)其為單囊殼白粉菌Podosphaera xanthii；采用國際通用的13個鑒別寄主對上述白粉病菌進(jìn)行噴霧接種鑒定，根據(jù)鑒別寄主抗感反應(yīng)確認(rèn)上述甜瓜白粉病菌為單囊殼白粉菌生理小種1，未發(fā)現(xiàn)其他生理小種。本研究初步明確了江浙滬地區(qū)甜瓜白粉病菌的菌種及優(yōu)勢生理小種，為甜瓜抗白粉病育種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 甜瓜； 白粉菌； 生理小種； 江蘇； 上海； 寧波

Abstract： To identify the species and physiological races of melon powdery mildew fungus from Jiangsu，Zhejiang and Shanghai areas，nine powdery mildew fungus were collected from melon plants grown in plastic tunnels in southeast China inlcuding Sucheng Suqian，Huaian，Luhe Nanjing，Xuanwu Nanjing，Wuzhong Suzhou，Haimen Nantong in Jiangsu province，Jiading and Fengxian in Shanghai and Ningbo in Zhejiang province during autumn in 2014. Microscopic observation of the conidia and Coomassie brilliant blue staining of the hyphae identified them as Podosphaera xanthii. The rDNA internal transcribed space（ITS） sequence analysis of the fungus from Nanjing Xuanwu confirmed it as Podosphaera xanthii. When these pathogens were inoculated onto the 13 international standard differential host，they were classified as P. xanthii Race 1 according to their susceptible/resistant reactions，no other races were found. This study characterized the species and predominate physiological races of melon powdery mildew fungus collected in Jiangsu，Zhejiang and Shanghai areas，which laid fundamental basis for melon powdery mildew resistant breeding.

Key words： Melon； Powdery mildew； Physiological race； Jiangsu； Shanghai； Ningbo

白粉病是一種在全世界瓜類作物上廣泛發(fā)生的真菌性病害，如西瓜、甜瓜、黃瓜、南瓜、葫蘆、苦瓜和絲瓜等作物在不同生育期都可遭受白粉病菌的侵害，其中黃瓜、甜瓜、南瓜和葫蘆最易感病[1]。

近年來，隨著設(shè)施甜瓜種植面積的急劇增加以及種植品種的單一，加上棚室內(nèi)高溫高濕的環(huán)境，白粉病發(fā)生嚴(yán)重，已成為我國甜瓜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要障礙因子。因此開展甜瓜白粉病菌的基礎(chǔ)研究，尤其是明確各地危害甜瓜的白粉病菌菌種及相關(guān)生理小種，對于開展甜瓜抗白粉病育種至關(guān)重要。

白粉病菌屬于高度專化性寄生真菌，侵染植物后在寄主表皮細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生吸器，而菌絲體則匍匐在寄主體表[2]。白粉病菌主要侵染植物葉片，也危害葉柄、莖蔓，在感病嚴(yán)重的時期果實也會受到感染，導(dǎo)致坐果率降低，果實變小，品質(zhì)下降[3]。研究表明甜瓜白粉病主要由單囊殼白粉菌Podosphaera xanthii和二孢白粉菌Golovinomyces cichoracearum這兩種病原菌引起，而僅單囊殼白粉菌P. xanthii已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有11 個生理小種，分別是生理小種0，1，2U.S，2France3，4，5，6，7，N3和N4，而G. cichoracearum又有2個生理小種[4]。

目前我國學(xué)者對新疆[5]、吉林[6]、甘肅[7，8]、上海[9]、海南[10]等甜瓜主產(chǎn)區(qū)白粉病菌的生理小種作了初步鑒定，但江蘇省的甜瓜白粉病菌生理小種尚未見報道。本文從華東江蘇6個地區(qū)、上海2個地區(qū)、浙江寧波地區(qū)采集了9份白粉病菌，采用國際通用的13個鑒別寄主對上述白粉病菌進(jìn)行接種鑒定，以期明確江浙滬地區(qū)，尤其是江蘇省甜瓜白粉病菌致病菌種及生理小種的分化，為甜瓜抗白粉病育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

采用國際通用的甜瓜白粉病生理小種鑒定的一整套鑒別寄主（表1），分別為：‘PM‘R5‘PMR6‘PMR45‘WMR29‘MR 1‘Edisto 47‘Nantais Oblong‘Vedrantais‘Topmark‘Iran H‘PI 1241ll‘PI 124112‘PI 414723，均由程鴻博士（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）提供。所有寄主材料在南京六合基地嚴(yán)格套袋自交擴繁。甜瓜鑒別寄主白粉病的抗感反應(yīng)見表l。

1.2 白粉病菌鑒定方法

1.2.1 白粉病菌孢子形態(tài)觀察 取白粉病菌無性世代分生孢子于載玻片上，加1滴3%的KOH溶液，蓋上蓋玻片，在10×40倍顯微鏡下觀察分生孢子上是否有纖維狀體。

1.2.2 白粉病菌菌絲染色觀察 將長有白粉病菌的甜瓜葉片用打孔器打成小圓片，浸泡在含0.15%三氯乙酸的乙醇-三氯甲烷（75∶25，V/V）溶液中，70 ℃恒溫水浴30 min以上，直至葉片脫色，用清水沖洗后，在15%三氯乙酸和0.6%考馬斯亮藍(lán)R-250（溶于99%甲醇中）混合液（體積比為1∶1）中，染色5 min，取出后用清水沖凈，貯存于冰乙酸、甘油、水（體積比為5∶20∶75）混合液中，觀察時以水為浮載劑，葉面朝上在光學(xué)顯微鏡下觀察染色效果[11-12]。

1.2.3 白粉病菌ITS序列的克隆與測序 孢子的收集和DNA的提取按以下方法進(jìn)行：從新鮮繁殖的長滿白粉病菌的甜瓜葉片表面用干凈的小毛筆刷下分生孢子，將其收集于1.5 mL離心管中，保存于-20 ℃冰箱進(jìn)行DNA提取。DNA提取按照Omega真菌提取試劑盒里的方法進(jìn)行。ITS區(qū)擴增引物采用真菌核糖體rDNA-ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）和ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）[13]。PCR反應(yīng)體系含DNA 模板1 μL（約30 ng），2×緩沖液10 μL、引物（2 μmol·L-1）各1 μL、Taq酶1 125 U，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳檢測。擴增的PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后連入pGEM-Teasy載體，經(jīng)PCR驗證陽性克隆后委托北京華大生物技術(shù)公司（上海分公司）測序。將測得的白粉病菌rDNA-ITS序列在DNASTAR軟件（DNASTAR Inc.，Madison，WI，USA）進(jìn)行分析后遞交到GenBank，登錄號為：KP980563。經(jīng)Blast比對，搜索同源性序列，并在CLC sequence viewer 6.0軟件中對3個白粉病菌序列進(jìn)行同源比對分析。

1.2.4 白粉病菌生理小種的鑒定 感染白粉病菌的甜瓜葉片于2014年9月期間采自江蘇宿遷宿城、淮安、南京六合、南京玄武、蘇州吳中、南通海門，上海嘉定、奉賢，浙江寧波地區(qū)。白粉病菌13個鑒別寄主播種于50孔穴盤，1葉1心時進(jìn)行噴霧接種，接種濃度為105個·mL-1，每個材料接10～15株苗，2次重復(fù)。鑒定所用瓜苗放置于長1.5 m，寬1.2 m，高1.5 m的不銹鋼架內(nèi)，架子四周與頂部用塑料薄膜封閉，架子置于塑料大棚內(nèi)，大棚頂部覆蓋遮陽網(wǎng)。不銹鋼架內(nèi)前兩天保持90%以上濕度，后面通過頂部通風(fēng)保持70%左右濕度，觀察其發(fā)病情況，接種2周統(tǒng)計病情。甜瓜苗期病情鑒定采用6級分級標(biāo)準(zhǔn)：0級：整個植株沒有病斑；1級：僅子葉有很少量病斑；2級：僅子葉有較多病斑或子葉有病斑，莖上有很少量病斑；3級：子葉有很多病斑，莖上有少量病斑；4級：子葉和莖上布滿病斑，真葉有病斑；5級：植株因感病而死。病情指數(shù)=Σ（病級×該病級株數(shù)）/（最高病級×調(diào)查總株數(shù)）×100。病情指數(shù)≤45為抗（R）；45<病情指數(shù)≤100為感（S）[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 白粉病菌孢子的形態(tài)觀察

來自不同地方的白粉病菌首先進(jìn)行鏡檢，其分生孢子均為橢圓形，無色，單胞，大小為約25 μm×12 μm，有發(fā)達(dá)的纖維狀體。不同地方的白粉病菌形態(tài)大小無差異，如圖1-A所示。進(jìn)一步通過考馬斯亮藍(lán)染色法觀察其菌絲體（圖1-B），可清晰看到其分生孢子梗，分生孢子梗與菌絲呈垂直生長，孢子串生成念珠狀，由此可初步推斷本研究中接種的白粉病菌為瓜單囊殼白粉病菌。

2.2 白粉病菌ITS序列的分析

為進(jìn)一步明確本研究中白粉病菌種類，我們選取江蘇南京玄武地區(qū)甜瓜白粉菌進(jìn)行rDNA-ITS序列分析。首先以病菌總DNA為模板，用ITS1和ITS4引物均擴增出大小為563 bp的目標(biāo)片段（圖2）。將PCR產(chǎn)物克隆到T載體，并進(jìn)行測序，通過Blast發(fā)現(xiàn)南京玄武地區(qū)的白粉病菌與已報道的Podosphaera xanthii相似度達(dá)100%。

2.3 白粉病菌生理小種的鑒定

接種試驗觀察結(jié)果表明，在感病品種如‘Topmark上，白粉病菌接種1周肉眼可觀察到明顯的病斑，接種10天發(fā)病明顯，2周已充分發(fā)病，可達(dá)到4級，不同的品種之間抗感差異明顯。所接白粉病菌均可使‘IranH，‘Topmark，‘Vedrantais和‘Nantais Oblong4個品種發(fā)病，病情指數(shù)達(dá)到60%以上，最高達(dá)89.1%（表2），而其他材料除‘PI124112和‘PMR6有零星輕度發(fā)病外，均未出現(xiàn)白粉病癥狀。即9個地區(qū)的白粉病菌侵染13個鑒別寄主，只有‘IranH，‘Topmark，‘Vedrantais和‘ Nantais Oblong表現(xiàn)為感?。⊿），其他材料均表現(xiàn)抗?。≧）（表3）。對照13個鑒別寄主抗感反應(yīng)（表1），表明江蘇宿遷宿城、淮安、南通海門、南京玄武、南京六合、蘇州吳中，上海嘉定、奉賢，浙江寧波等地的甜瓜白粉病菌為單囊殼白粉菌生理小種1，未發(fā)現(xiàn)其他生理小種（表3）。

3 討 論

試驗采用國際通用的標(biāo)準(zhǔn)鑒定體系，對來自江蘇省、上海市、浙江省的9份白粉病樣品進(jìn)行了白粉病菌菌種及生理小種的鑒定，明確了江蘇省、上海市和寧波地區(qū)溫室大棚甜瓜白粉病菌的生理小種為單囊殼白粉菌P. xanthii的生理小種1。

以往研究表明，單囊殼屬單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）和白粉屬二孢白粉菌（Golovinomyces cichoracearum）是引起我國甜瓜白粉病的2個最主要的病原菌[15]，二者無性階段形態(tài)相似，而有性階段的閉囊殼不經(jīng)常出現(xiàn)，所以給病原物分類鑒定工作造成困難。Vakalounakis等[16]提出了2種病菌的結(jié)構(gòu)差異，根據(jù)Podosphaera xanthii的分生孢子是橢圓形、有發(fā)達(dá)的纖維狀體，而Golovinomyces cichoracearum 的分生孢子為細(xì)長的圓柱形、其上沒有纖維狀體而區(qū)分。本研究中，對不同地方的白粉菌孢子通過鏡檢、考馬斯亮藍(lán)染色菌絲初步確認(rèn)江浙滬地區(qū)白粉菌可歸為單囊殼白粉菌P. xanthii。近年隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，運用ITS序列進(jìn)行真菌分類越來越普遍。ITS序列具有受外界環(huán)境影響較小、進(jìn)化速度快的特點，既具保守性又在科、屬、種水平上具有特異性，而且序列長度適中，含足夠量的遺傳信息[17-19]。如馬原松等[20]對河南省幾種作物的白粉菌進(jìn)行了ITS序列分析，與形態(tài)觀察結(jié)果一致。趙冰等[21]應(yīng)用ITS序列快速鑒定了豌豆白粉菌種。為進(jìn)一步確認(rèn)形態(tài)觀察的結(jié)果準(zhǔn)確性，選取南京玄武地區(qū)的白粉菌進(jìn)行ITS序列分析，blast結(jié)果表明南京玄武地區(qū)白粉病菌為單囊殼白粉菌P. xanthii。

甜瓜白粉病菌生理小種分化復(fù)雜，我國對各地甜瓜的白粉病菌的鑒別已有不少報道。在北京[14]、海南[10]、吉林[6]、上海[9]四個地區(qū)存在P. xanthii的生理小種1和2France，其中北京、海南和吉林的致病菌以2France為優(yōu)勢生理小種；而在上海以生理小種1為優(yōu)勢生理小種。這與本研究結(jié)果一致，本研究從上海奉賢和嘉定取樣鑒定結(jié)果為P. xanthii的生理小種1，此前研究中上海的生理小種2只在浦東發(fā)現(xiàn)。徐志豪等[22]研究認(rèn)為，P. xanthii 中的生理小種2 是引起浙江地區(qū)甜瓜白粉病的主要病原菌。但徐等采樣地點只選取了杭州地區(qū)，不能說明整個浙江地區(qū)的甜瓜白粉病菌。本研究取了寧波地區(qū)甜瓜白粉病菌，結(jié)果表明寧波地區(qū)的甜瓜白粉病致病菌為P. xanthii的生理小種1。

馬鴻艷等[23]對2009—2010年黑龍江省主要瓜類作物上的白粉病菌做了鑒定，發(fā)現(xiàn)了生理小種1和6，優(yōu)勢生理小種為1。劉東順等[8]和張莉等[7]在不同年份對甘肅省甜瓜主要區(qū)進(jìn)行了白粉病菌生理小種鑒定，劉東順等[8]認(rèn)為甘肅省甜瓜白粉病菌為單囊殼生理小種1和2Fance，還有7存在，優(yōu)勢小種為1，張莉等[7]鑒定結(jié)果為單囊殼生理小種1和2US，優(yōu)勢小種為1，這可能是取樣年份不同，采樣地點不同引起的鑒定結(jié)果差異。但引起甘肅甜瓜白粉病的白粉病菌優(yōu)勢生理小種一致，都是生理小種1。趙光偉等[24]鑒定認(rèn)為單囊殼白粉菌生理小種1為鄭州地區(qū)甜瓜白粉病致病生理小種。我們的研究采集了江蘇6個地區(qū)、上海2個地區(qū)和浙江寧波地區(qū)共9份甜瓜白粉病菌樣品，鑒定結(jié)果為P. xanthii的生理小種1是引起上述地區(qū)甜瓜白粉病的致病菌，并未發(fā)現(xiàn)其他生理小種。從以上研究可看出，引起我國甜瓜白粉病致病的病原菌主要為P. xanthii的生理小種1或2France，大部分地區(qū)仍然以生理小種1為優(yōu)勢種。

甜瓜白粉病菌生理小種復(fù)雜，明確引起各地甜瓜白粉病的致病菌生理小種，對于開展甜瓜白粉病防治，引進(jìn)抗病材料和選育抗病品種具有重要意義。本研究只是選取了一部分地區(qū)的樣品，應(yīng)該加大采樣地點，同時對某一地點開展連續(xù)多年的監(jiān)測，密切關(guān)注生理小種的分布變化，從而可及時改變育種方案，培育具有針對性的抗性材料。

參考文獻(xiàn)

[1] Sitterly W R.Powdery mildews of cucurbits[J].The powdery mildews，1978： 359-379.

[2] Kuzuya M，Yashiro K，Tomita K，et al.Powdery mildew（Podosphaera xanthii） resistance in melon is categorized into two types based on inhibition of the infection processes[J].Journal of Experimental Botony，2006，57（9）： 2093-2100.

[3] Perez-Garcia A，Romero D，F(xiàn)ernandez-Ortuno D，et al. The powdery mildew fungus Podosphaera fusca（synonym Podosphaera xanthii），a constant threat to cucurbits[J]. Molecular Plant Pathology，2009，10（2）： 153-160.

[4] 王娟，鄧建新，宮國義，等. 甜瓜抗白粉病育種研究進(jìn)展[J].中國瓜菜，2006（1）： 33-36.

[5] 張學(xué)軍，季娟，翟文強，等. 新疆地區(qū)厚皮甜瓜白粉病菌生理小種的鑒定[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（8）： 1450-1455.

[6] 張波，王利波，崔四川，等. 吉林省薄皮甜瓜主產(chǎn)區(qū)白粉病菌生理小種的初步鑒定[J]. 吉林蔬菜，2011（6）： 100-101.

[7] 張莉，張慧君，張建農(nóng)，等. 甘肅甜瓜白粉病病原種及生理小種的鑒定[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011（2）： 87-91.

[8] 劉東順，程鴻，孔維萍，等. 甘肅甜瓜主產(chǎn)區(qū)白粉病菌生理小種的鑒定[J]. 中國蔬菜，2010（6）： 28-32.

[9] 顧海峰，張旭，張文芳，等. 上海地區(qū)西甜瓜白粉病菌生理小種的鑒定[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010（4）： 155-158..

[10] 包海清，許勇，杜永臣，等. 海南三亞地區(qū)葫蘆科作物白粉病菌生理小種分化的鑒定[J]. 長江蔬菜，2008（1）： 49-51.

[11] Wolf G，F(xiàn)ric F.A rapid staining method for Erysiphe graminis f. sp. hordei in and on whole barley leaves with a protein-specific dye[J].Phytopathology，1981，71（6）： 596-598.

[12] 王萍，欒非時，陳克農(nóng)，等.4種染色方法對甜瓜白粉病菌染色效果的觀察比較[J]. 菌物學(xué)報，2008（5）： 673-678.

[13] White T J，Bruns T，Lee S，et al.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]//Innis M A，Gelfand D H，Sninsky J J，White T J. In PCR Protocols： A Guide to Methods and Applications，San Diego，Academic Press，1990： 315-322.

[14] 王娟，宮國義，郭紹貴，等. 北京地區(qū)瓜類蔬菜白粉病菌生理小種分化的初步鑒定[J].中國蔬菜，2006（8）： 7-9.

[15] 鄭儒永. 中國真菌志. 白粉菌目[M]. 北京： 科技出版社，1987： 354-369.

[16] Vakalounkis D J，Klirenomou E，Papadakis A. Species spectrum，host range and distribution of powdery mildews on Cucurbitaceae in Crete[J]. Plant Pathology，1994，43（5）： 813-818.

[17] 匡治州，許楊.核糖體rDNA ITS序列在真菌學(xué)研究中的應(yīng)用[J].生命的化學(xué)，2004，24（2）： 120-122.

[18 ] 李依韋，銀玲.rDNA-ITS序列分析在植物病原真菌分類鑒定中的應(yīng)用[J]. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，27（1）： 66-67.

[19] Takamatsu S.Phylogeny and evolution of the powdery mildew fungi（Ersiphales，Asomycota） inferred from Iluclear ribosomal DNA sequences[J]. Mycroseience，2004，45（2）： 147-157.

[20] 馬原松，裴冬麗，王文靜，等.河南省幾種白粉菌的ITS序列分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，41（9）： 87-90.

[21] 趙冰，劉鐵志，文靜.豌豆白粉菌ITS基因的快速克隆及序列分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（3）：34-35.

[22] 徐志豪，壽偉林，黃凱美，等.白粉病菌的生理小種及其對不同基因型甜瓜的致病性（英文）[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，1999（5）： 29-32.

[23] 馬鴻艷，魏尊苗，祖元剛，等. 2009-2010年黑龍江省主要瓜類作物白粉病菌生理小種鑒定[J]. 植物保護學(xué)，2011，38（3）：287-288.

[24] 趙光偉，徐志紅，徐永陽，等.鄭州地區(qū)甜瓜白粉病菌生理小種鑒定[J].中國瓜菜，2012，25（6）： 13-15.