離體條件下2種除草劑誘導瀘定百合多倍體的比較研究

周玲云，鄧 敏，高素萍

（四川農業(yè)大學 風景園林學院，成都611130）

植物新品種的選育是一個長期漫長的過程，采取組織培養(yǎng)技術與化學誘變技術相結合的途徑能夠縮短育種年限。這一技術在天山雪蓮［1］、菊花［2］等植物中已獲得成功。除了利用傳統(tǒng)的秋水仙素作為多倍體誘導劑外［3］，除草劑類的誘變劑應用越來越受到重視。除草劑類物質一般通過抑制微管組裝從而干擾細胞分裂，因此也可以用作植物多倍體的誘導劑［4］。氟樂靈和二甲戊靈是一種新型除草劑，由于其與植物蛋白親和力高、動物蛋白親和力低，從而具有誘導植物多倍體效率高、環(huán)境污染小的特點，用此類除草劑已在大蒜［5］、毛新楊［6］、馬蹄蓮［7］等植物中成功獲得多倍體。為保護野生瀘定百合種質資源以及培育優(yōu)良新品種，本試驗選用價格低廉的氟樂靈和二甲戊靈作為誘變劑，從細胞學上鑒定其加倍效果，并從形態(tài)、氣孔特征上比較其誘導效果，為生產上尋求一種經濟實用可靠的育種方法。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗材料為瀘定百合組織培養(yǎng)的無菌生根苗的不定芽。為保證2種試劑處理結果的可比性，材料均選擇同一批次，培養(yǎng)基為MS＋1.0mg／L 6－BA＋0.15mg／L NAA＋30g／L 蔗糖＋7g／L 瓊脂，pH 5.8，溫度（25±1）℃，培養(yǎng)條件為光周期12h／d，光照強度為1 500～2 000lx。

1.2 方 法

1.2.1 多倍體誘導方法 根據(jù)預備試驗，設置氟樂靈（乳油480g／L，鎮(zhèn)江建蘇農藥化工有限公司）和二甲戊靈（乳油330g／L，江蘇龍燈化學有限公司）的誘導濃度，采用溶液浸泡法處理材料。浸泡前選取不定芽，剪去葉片，切成大小相同（0.3cm×0.3 cm）的小塊。誘變溶液均經過濾滅菌，設置二甲戊靈和氟樂靈（避光）溶液的濃度均為100、200和300 μmol／L，處理時間設置為12、24和36h，用無菌水和質量百分比濃度為0.1%秋水仙素（99%Wolsen秋水仙素粉末）作為對照。每種誘變劑9個處理組合，每種組合處理90個外植體，放置搖床上輕輕搖動，使其與溶液充分接觸。處理完畢用無菌水沖洗4～5次，轉入培養(yǎng)基（MS＋1.0mg／L 6－BA ＋0.15 mg／L NAA ＋30g／L蔗糖＋7g／L 瓊脂，pH 5.8）繼續(xù)培養(yǎng)，待長勢恢復良好，得到完整植株后，用莖尖進行染色體倍性鑒定。

同時，統(tǒng)計形態(tài)變異率。與對照相比，以株高、葉片厚度和寬窄、葉色等為指標進行統(tǒng)計。計算公式：

形態(tài)變異率＝形態(tài)變異株數(shù)／各處理總數(shù)×100%

死亡率（%）＝死亡數(shù)／接種數(shù)×100%

死亡數(shù)指接種35d后死亡的總不定芽數(shù)，形態(tài)變異株數(shù)指接種35d后誘變的總不定芽數(shù)。

1.2.2 多倍體鑒定 （1）形態(tài)特征比較：待各處理植株長出3片新葉（大約45d），選取對照和多倍體植株各20株，用游標卡尺測定其葉長、葉寬（葉片中間最寬部位）、葉厚（葉片中間最厚部位），每指標數(shù)據(jù)連續(xù)測3次，取其平均值作為葉形指數(shù)（葉長／葉寬）計算值。

（2）細胞學鑒定：處理后，待植株長出新根，切取對照與形態(tài)變異明顯植株約2mm 長根尖，采用根尖細胞染色體計數(shù)法進行倍性鑒定。具體方法：采用植物染色體常規(guī)壓片法，上午9：00～10：00選取生長旺盛的1cm 左右長新根，用0.05%秋水仙素室溫處理2h后，卡諾固定液（無水乙醇∶冰醋酸＝3∶1）在4℃冰箱中固定24h。取出用蒸餾水洗凈，放入60 ℃的水浴鍋中預熱好的1mol／L 鹽酸解離液中解離8min后洗凈。改良卡寶品紅染液染色3 min，壓片、顯微鏡（上海光學XSP－15CA 顯微鏡，下同）鏡檢、鑒定、攝像。

（3）葉片氣孔特征的觀察：誘變處理后第16～24周，撕取加倍苗與對照苗各20株的葉片下表皮制片。具體方法是：上午9：00～10：00，取頂部完全展開的葉子，用鑷子撕取下表皮置于載玻片上，加蓋玻片，在目鏡帶測微尺的普通顯微鏡下取3個視野測氣孔長度、氣孔寬度、氣孔密度、保衛(wèi)細胞長度和寬度，觀察氣孔與倍性的關系，明確氣孔是否可作為多倍體快速鑒定的一個重要指標。每個樣品測定3片葉，每葉重復觀測3次，計算平均值，統(tǒng)計并在4倍和10倍顯微鏡下攝影。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析（One－way ANOVA）檢驗處理的顯著性；用LSD 法進行處理間多重比較。用Microsoft Excel 2010制作圖表。

2 結果與分析

2.1 2種除草劑誘導下瀘定百合的死亡率與形態(tài)變異率

與對照（CK）相比，二甲戊靈的不同濃度及浸泡時間均能使瀘定百合產生一定程度的變異。以形態(tài)變異作為初步統(tǒng)計指標，隨二甲戊靈誘變濃度的提高，不定芽死率也明顯提高，部分不定芽變黑，生長緩慢或死亡。本試驗中考慮到在此濃度時形態(tài)變異植株生長良好且變異率較高，可以確定二甲戊靈誘變不定芽的適宜濃度和處理時間為300μmol／L＋36h，氟樂靈誘變不定芽的適宜濃度和處理時間為200μmol／L＋36h（表1）。

同時試驗還表明：氟樂靈誘變后大部分瀘定百合不定芽恢復生長與增殖均較困難，繼續(xù)培養(yǎng)容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，并最終死亡，而二甲戊靈沒有發(fā)生此類現(xiàn)象（圖版Ⅰ，1A、1B）。與對照相比，秋水仙素的各不同處理也能產生一定程度變異。處理后生長7 d左右一切正常，生長到14d左右就開始出現(xiàn)“爛心現(xiàn)象”，其腐爛部分為褐色（圖版Ⅰ，1C）。且隨著濃度和時間的增加這種現(xiàn)象就出現(xiàn)的越早、越嚴重，這可能是秋水仙素對試管苗產生了毒害。在秋水仙素處理濃度和處理時間的最佳組合研究中，以秋水仙素濃度0.1%處理24h誘變率高達34.4%為宜，但死亡率已達40.0%（表1）。

就2 種除草劑與秋水仙素處理的誘變效果比較，形態(tài)變異率差異并不顯著，但死亡率無論從整體還是個體上，都表現(xiàn)出秋水仙素處理比2種除草劑高，最高濃度處理相同時間秋水仙素死亡率高出除草劑處理17.3%。綜合3種誘變劑對瀘定百合處理后不定芽死亡率和形態(tài)變異率等各項指標的分析結果，初步認為，氟樂靈、二甲戊靈對植物傷害較小，但變異率可達到秋水仙素處理效果。

2.2 多倍體的鑒定

2.2.1 細胞學鑒定 二甲戊靈誘變處理后，產生形態(tài)變異的總168株，氟樂靈處理后形態(tài)變異177株，秋水仙處理后形態(tài)變異194株，抽取各組形態(tài)變異數(shù)的30%進行染色體制片分析。取變異株與對照株根尖進行染色體制片觀察，結果表明：經二甲戊靈、氟樂靈和秋水仙素處理后，植物根尖染色體數(shù)目加倍，具有四倍體（2n＝4x＝48）染色體數(shù)特征（圖版Ⅰ，2A～2D）。部分變異植株同時存在二倍體和四倍體，或是非整倍體細胞，這是多倍體嵌合現(xiàn)象。

2.2.2 形態(tài)特征比較 經細胞學鑒定后，對四倍體植株與無菌水對照植株（非加倍二倍體）的形態(tài)學觀測發(fā)現(xiàn)，四倍體植株的株型矮化，莖粗壯，葉色濃綠，葉片較大、肥厚，葉邊呈不規(guī)則卷翹、皺縮，生長較為緩慢。圖版Ⅰ，3A～3D 和表2是處理后生長45d的二倍體與四倍體植株形態(tài)比較。

表1 2種除草劑對不定芽死亡率與材料形態(tài)變異率的影響Table1 Effects of two herbicides on death rate and variation rate of Lilium sargentiae

表2 瀘定百合二倍體與形態(tài)變異植株葉片特征比較Table2 Comparison of L.sargentiaeleaf trait between diploid and morphological variation plants

表3 瀘定百合二倍體與四倍體植株氣孔差異比較Table3 Differences of stomata between diploid and tetraploid L.sargentiae

比較2種誘變劑與秋水仙素處理形態(tài)指標的差異，結果顯示不顯著，但前者處理后約15d就可逐漸恢復生長，而后者需要20d左右，個別還有爛心現(xiàn)象，表明秋水仙素對植物材料的傷害更大。

2.2.3 氣孔特征的比較 2種誘變劑處理與秋水仙素處理后氣孔特征均表現(xiàn)出相似性，且無顯著差異，因此，本特征比較僅選擇二甲戊靈處理后葉片的氣孔特征為代表（圖版Ⅰ，4A～4D、表3）。與二倍體植物氣孔特征相比（圖版Ⅰ，4A、4B），四倍體植株的氣孔（圖版Ⅰ，4C、4D）明顯增大得多，厚度增加也明顯，且有些氣孔的外形不規(guī)則，四倍體氣孔的保衛(wèi)細胞大小不一（圖版Ⅰ，4C），沒有二倍體氣孔的保衛(wèi)細胞（圖版Ⅰ，4A）那樣均勻，同一物鏡下數(shù)量明顯減少，且同一個變異株同一個部位的氣孔大小等特征也表現(xiàn)得不盡相同，這種現(xiàn)象一般為嵌合體現(xiàn)象。由此，氣孔的變化可以作為多倍體快速鑒定的一個重要指標，其鑒定過程方便又快捷。

3 討 論

3.1 誘變劑的選擇

氟樂靈和二甲戊靈作為誘變劑在大蒜［5］、辣椒［8］、甜瓜［9］、小麥［10］等植物育種中都有應用，而在百合中的應用報道極少，僅有封紫采用氟樂靈誘導百合2n花粉的研究。與秋水仙素相比，硝基苯胺類除草劑除具有低毒價廉的優(yōu)點，且在本實驗中，誘導瀘定百合不定芽產生多倍體（四倍體）要優(yōu)于秋水仙素。此外，2種誘變劑誘導的多倍體無論在細胞學上還是在氣孔特征上，均表現(xiàn)出相似性，這與前人的研究大致相似?；诖?，全面考慮兩種誘變劑在生產中的安全性，成本及效果，可將二甲戊靈、氟樂靈作為秋水仙素的替代品在育種生產中應用。

3.2 倍性的早期鑒定

染色體計數(shù)法是鑒定倍性最可靠的方法之一，但難度較大，不易得到典型制片。有學者用掃描細胞光度儀早期檢測倍性，但成本昂貴，不易普及［11］。Sari等［12］認為根據(jù)保衛(wèi)細胞的大小、單位面積上的氣孔數(shù)及保衛(wèi)細胞中葉綠體數(shù)，可以有效區(qū)分倍性。本實驗中四倍體植株與二倍體相比，單位面積的氣孔數(shù)量，氣孔大小都有顯著差異。因此，進一步驗證了Sari的方法，將氣孔特征作為瀘定百合多倍體初步快速鑒定的有效方法。

3.3 處理時間與誘變劑濃度的確定

至于誘變劑處理的適宜時間，以處理材料完全被浸透，并有足夠的藥量進入生長點細胞為宜。一般來說，處理幼嫩的組織，如萌動的種子及幼苗，處理的濃度要低，處理的時間不少于24h。劉歡等［13］在用二甲戊靈離體誘導虎眼萬年青多倍體實驗中，二甲戊靈濃度為800μmol／L，處理時間為24h，最高變異率達46.67%；而趙曉潘［14］通過氟樂靈浸泡半枝蓮腋芽48h誘導染色體加倍的最適濃度為20 μmol／L，變異率為64.7%。說明二甲戊靈、氟樂靈藥液易于進入虎眼萬年青、半枝蓮、百合等草本植物生長點，從而易獲得加倍材料。

確定誘變劑適宜的濃度要綜合考慮誘變的效果和對外植體的傷害程度，一般以半致死劑量為參考［15－16］。Bhagwat等［17］則認為通過半致死劑量確定適宜的誘變濃度并不是絕對合適的，還要綜合考慮處理后材料的恢復情況、增殖率和再生情況。本試驗結果不單一考慮變異率，在同等變異率下，還結合考慮了致死率、恢復時間及其恢復效果。因此，對瀘定百合多倍體誘導，誘變劑二甲戊靈300μmol／L與氟樂靈200μmol／L是一個綜合各指標后相對適宜的濃度。

3.4 嵌合體問題

試驗結果發(fā)現(xiàn)，誘變劑處理后直接誘導成功的多倍體大部分均為嵌合體，這與鄭思鄉(xiāng)等［18］研究結果相同。嵌合體是多倍體育種中一個普遍出現(xiàn)而又難以解決的問題，根據(jù)喬永剛等［19］的論述，這可能是因為芽中所有細胞分裂的時間不同步，當幼芽附著有誘變劑溶液時，正在分裂的細胞就發(fā)生了加倍，變成四倍體細胞，而此期間該組織中一直處于G0期的細胞沒有發(fā)生分裂，繼續(xù)保持著原來的二倍體形式。一旦解除了誘變劑的抑制作用，誘導后的芽中各種倍性的細胞（包括尚未加倍的二倍體細胞）就保持競爭性分裂狀態(tài)。嵌合體的分離是多倍體育種中的一個關鍵環(huán)節(jié)。由于嵌合體中同時存在著二倍體和更高倍性的細胞，倍性高的細胞自身復制和蛋白質合成速度永遠不及二倍體細胞快，因此加倍了的細胞分裂速度就放慢，若不及時分離，就會使組織中的多倍體細胞逐漸被二倍體細胞排擠或“淹沒”，目前應用最多的方法是通過組織培養(yǎng)技術不斷切割繼代轉接再鑒定來得到純合多倍體，分離嵌合體。

總之，實驗結果表明，2種除草劑在適宜的濃度和時間處理下都能誘導瀘定百合試管苗產生多倍體，由原來的二倍體變?yōu)樗谋扼w。從形態(tài)、結構與染色體三個層次上與傳統(tǒng)誘變劑秋水仙素誘變結果無顯著差異。因此，綜合比較成本、對植物及人的毒性，二甲戊靈和氟樂靈可替代秋水仙素作為誘變劑誘導瀘定百合多倍體，是生產中值得推廣的誘變劑。

圖版Ⅰ 1A.氟樂靈處理后的褐化現(xiàn)象；1B.二甲戊靈處理植株；1C.秋水仙素處理后的“爛心現(xiàn)象”；2A.二倍體（2n＝24）；2B.二甲戊靈加倍處理（2n＝48）；2C.秋水仙素加倍處理（2n＝48）；2D.氟樂靈加倍處理（3n＝36）；3A.左2株為對照植株，右4株為二甲戊靈處理后變異植株；3B.左為對照葉片，右為氟樂靈處理后變異葉片；3C.左5株為秋水仙素處理后變異植株，右2株為對照植株；4A、4B.二倍體氣孔（二甲戊靈處理）；4C、4D.四倍體氣孔（二甲戊靈處理）；每個刻度為1μm。PlatesⅠ Fig.1A.The browning phenomenon by trifluralin；Fig.1B.The pendimethalin treatment plants；Fig.1C.The“rotten heart phenomenon”by colchicine treatment；Fig.2A.Diploid（2n＝24）；Fig.2B.Chromosome doubled by pendinmethalin（2n＝48）；Fig.2C.Chromosome doubled by colchicines（2n＝48）；Fig.2D.Chromosome doubled by trifluralin（3n＝36）；Fig.3A.Left two of the control plants，right four of the variation pendimethalin treatment plants；Fig.3B.Left two of the control leaf，right two of the trifluralin mutation leaves after treatment；Fig.3C.Left five of the variability colchicine treatment plants，right two of the control plants；Fig.4A，4B.Diploid stomata（conducted by pendinmethalin）；Fig.4C，4D.Tetraploid stomata（conducted by pendinmethalin）；each scale indicates 1μm.

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