馬鈴薯雜種無(wú)性株系的SSR 鑒定及花粉育性和染色體構(gòu)型分析

王 丹，于肖夏，鞠天華，于 卓＊，郝治滿(mǎn)，姜 超

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，呼和浩特010019；2 赤峰天澤生物科技有限公司，內(nèi)蒙古赤峰025457）

馬鈴薯是重要糧、菜、飼兼用作物，也是重要工業(yè)和能源原料。其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含淀粉、蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素、酚類(lèi)物質(zhì)及鉀、鋅、硒、硫等營(yíng)養(yǎng)元素［1－3］。隨著中國(guó)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，專(zhuān)用型

和深加工型馬鈴薯品種的選育工作倍受重視［4－6］。內(nèi)蒙古是中國(guó)重要的馬鈴薯種薯和商品薯生產(chǎn)基地。目前生產(chǎn)上運(yùn)用的馬鈴薯品種對(duì)水肥條件要求較高，但其田間抗病能力弱，種薯退化周期短，特別是黑痣病、粉痂病、晚疫病等病害危害嚴(yán)重，馬鈴薯產(chǎn)量損失逐年增大［7－10］。因此，選育抗病性和適應(yīng)性強(qiáng)、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)馬鈴薯品種非常必要。

通過(guò)分析比對(duì)子代與親本在DNA 水平上的差異，可為馬鈴薯優(yōu)良株系（或品系）選育和鑒定提供分子依據(jù)。如李長(zhǎng)青等［11］利用3對(duì)SSR 適宜引物建立了3個(gè)馬鈴薯雜交組合共59個(gè)雜種株系的指紋圖；甘霖等［12］利用ISSR 標(biāo)記技術(shù)成功的鑒定了4個(gè)馬鈴薯雜交組合選出的23 個(gè)優(yōu)良雜種株系。段艷鳳等［13］利用6對(duì)SSR 引物將88份彩色馬鈴薯材料一一區(qū)分開(kāi)來(lái)。馬鈴薯雜種株系花粉育性是判斷其是否可作為雜交中間材料而進(jìn)一步利用的重要細(xì)胞學(xué)依據(jù)，一般花粉可育率高于50%的雜種材料可作為父本利用，而低于50%適于作母本利用［14］。馬鈴薯雜種染色體配對(duì)行為與花粉育性的高低密切相關(guān)，通常二價(jià)體頻率越高，表明染色體遺傳相對(duì)穩(wěn)定，相應(yīng)的花粉育性亦越高［15］。

本課題組從美國(guó)引進(jìn)了馬鈴薯材料‘MB09’（四倍體，2n＝4x＝48），并在內(nèi)蒙古呼和浩特和赤峰地區(qū)種植觀察發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)量高，品質(zhì)好，生育期較短，薯形好，但其抗病性差。國(guó)內(nèi)育成品種‘隴薯7號(hào)’（四倍體，2n＝4x＝48）具有抗病性和適應(yīng)強(qiáng)、淀粉含量高、芽眼淺等優(yōu)良特性，但生育期較長(zhǎng)。為培育出抗病性和抗逆性強(qiáng)、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的馬鈴薯新品種，我們按照遺傳差異較大和優(yōu)缺點(diǎn)互補(bǔ)的親本組配原則，用‘MB09’材料作母本，‘隴薯7號(hào)’作父本，人工去雄授粉雜交，成功獲得‘MB09’ב隴薯7號(hào)’雜種F1代共1 035個(gè)單株材料；通過(guò)田間試驗(yàn)觀測(cè)，從中選出生長(zhǎng)健壯、田間抗病性和適應(yīng)性強(qiáng)的優(yōu)良株系20個(gè)（無(wú)性系一代），進(jìn)而對(duì)這20個(gè)雜種株系進(jìn)行產(chǎn)量和品質(zhì)等農(nóng)藝性狀測(cè)定分析，選出優(yōu)異株系8個(gè)（無(wú)性系二代）。本試驗(yàn)采用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)‘MB09’ב隴薯7 號(hào)’的20 個(gè)雜種株系進(jìn)行DNA 指紋分析，并利用花粉染色鏡檢及卡寶品紅染色體制片方法對(duì)其選出的8個(gè)優(yōu)異株系的花粉育性及花粉母細(xì)胞染色體配對(duì)構(gòu)型進(jìn)行觀察，為進(jìn)一步馬鈴薯雜交新品系選育提供分子細(xì)胞遺傳學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 供試材料

材料為馬鈴薯‘MB09’ב隴薯7號(hào)’雜種F1中選出的優(yōu)良株系F1－1～F1－20（無(wú)性系一代）及從這20個(gè)株系中選出的株系F1－1、F1－2、F1－7、F1－11、F1－13、F1－14、F1－15和F1－20共8個(gè)優(yōu)異株系（無(wú)性系二代）和其親本。8個(gè)雜種株系的田間抗病性均較強(qiáng)，株型、薯型和生長(zhǎng)勢(shì)好，芽眼淺，還原糖含量均很低（鮮薯含量小于0．1%）。其中株系F1－7為高淀粉株 系（22．21%），株 系F1－2 和F1－20為 高 蛋 白 株 系（2．73%和2．96%），株系F1－11和F1－13均為高產(chǎn)株系（單株平均產(chǎn)量1．44kg和1．55kg）。各材料均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯育種研究中心提供。

1．2 SSR 指紋圖建立

1．2．1 DNA 提取與純度檢測(cè) 在苗期，選取22份馬鈴薯材料的幼嫩葉片，用天根生化科技有限公司生產(chǎn)的植物基因組試劑盒提取DNA，1．6%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 純度后，將各材料的DNA 濃度稀釋到50ng／μL 左右，置冰箱中保存?zhèn)溆谩?2個(gè)馬鈴薯材料的基因組DNA 電泳條帶清晰均勻，無(wú)拖尾現(xiàn)象，DNA 純度高，符合SSR 分析的要求。

表1 SSR－PCR反應(yīng)體系Table 1 SSR－PCR reaction system

表2 SSR 適宜引物及其堿基序列Table 2 SSR suitable primers and their nucleotide sequences

1．2．2 SSR－PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及程序 SSR 擴(kuò)增反應(yīng)體系詳見(jiàn)表1。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性1個(gè)循環(huán)，時(shí)間為4min；94℃變性30s，56℃退火45s，72 ℃延伸90s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10min，1個(gè)循環(huán)后終止反應(yīng)［12］。試驗(yàn)所用PCR 儀為Bio－rad T00Thermal Cycler。

1．2．3 電泳及銀染 對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，PAGE 凝膠濃度為6%，樣孔加樣量6μL，Marker為DL100，功率70W，電泳時(shí)間1h。電泳完畢后將膠板放入固定液（蒸餾水2L、酒精200mL、冰乙酸20mL）中固定15min，蒸餾水漂洗3min，用1．5%AgNO3溶液染色15min后放入蒸餾水中速漂5s，置顯影液（蒸餾水2L、NaOH 60g、甲醛10mL）中顯色10min，蒸餾水漂洗，自然晾干后掃描膠板［14］。

1．2．4 SSR 適宜引物篩選 用親本及其20個(gè)雜種F1無(wú)性株系的基因組DNA 為模板篩選SSR 適宜引物，試驗(yàn)所用的40對(duì)SSR 引物堿基序列來(lái)源于NCBI網(wǎng)站公布的馬鈴薯特異性引物，委托上海生工有限公司合成。通過(guò)PCR 擴(kuò)增從中選出多態(tài)性豐富、條帶清晰穩(wěn)定的2對(duì)SSR 適宜引物（表2）。

1．3 花粉育性鑒定

在馬鈴薯開(kāi)花盛期，田間隨機(jī)取親本及其8個(gè)優(yōu)異雜種株系的花藥帶回室內(nèi)鏡檢。在載玻片上用鑷子擠壓花藥，使花粉散出，滴加1．0%的醋酸洋紅，在OlympusBX51的10×10倍顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)可育花粉和不可育花粉數(shù)，每份材料觀察50個(gè)視野左右。觀察標(biāo)準(zhǔn)：可育花粉染色深、花粉粒較大、飽滿(mǎn)、形狀有規(guī)則；不育花粉染色淺或者是沒(méi)有染上色、花粉空癟、形狀無(wú)規(guī)則?；ǚ劭捎剩?）＝（可育花粉粒總數(shù)／觀察的花粉?？倲?shù)）×100%［15］。

1．4 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期Ⅰ（PMCMⅠ）染色體觀察

在馬鈴薯現(xiàn)蕾初期，取8個(gè)優(yōu)異雜種株系及其雙親的幼小花蕾若干，置于裝有卡諾液（無(wú)水乙醇∶冰醋酸＝3∶1）的廣口瓶中，4℃冰箱中固定22～24 h后，用清水洗凈放入70%酒精中保存?zhèn)溆谩Ｖ破瑫r(shí)，在載玻片上用解剖針將花蕾挑開(kāi)擠出花藥，去除雜質(zhì)，滴加卡寶品紅染色，放蓋玻片用鑷子輕敲，使細(xì)胞分散均勻后壓片，Olympus BX51 顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)PMCMⅠ染色體數(shù)并照相［16］。

2 結(jié)果與分析

2．1 雜種F1 無(wú)性株系的SSR 指紋分析

利用篩選出的SSR 引物C57和S25對(duì)20個(gè)雜種株系及其親本PCR 擴(kuò)增結(jié)果如圖1 所示。20個(gè)株系的SSR 指紋圖與雙親間均產(chǎn)生互補(bǔ)型條帶及新的特征帶或缺失型條帶，其中引物C57擴(kuò)增出互補(bǔ)型條帶及新的特征帶的株系為F1－1～F1－3、F1－5、F1－7～F1－20，擴(kuò)增出缺失型條帶的為F1－4和F1－6；引物S25擴(kuò)增出互補(bǔ)型條帶及新的特征帶的株系為F1－1、F1－2、F1－4～F1－6、F1－9～F1－20，擴(kuò)增出缺失型條帶的為F1－3、F1－7和F1－8。這從DNA 水平證明它們均為真實(shí)的雜種株系。另外，株系F1－12和F1－17的SSR 指紋一致，說(shuō)明引物C57能把90%的雜種株系識(shí)別出來(lái)，而引物S25擴(kuò)增的SSR 指紋圖可將這20個(gè)株系完全區(qū)別開(kāi)來(lái)。由于不同引物在雜種株系間擴(kuò)增出的SSR 指紋圖不完全相同，因此在馬鈴薯雜種株系鑒定及DNA 指紋圖建立時(shí)最好選用2對(duì)以上引物。

圖1 引物C57（A）和S25（B）對(duì)‘MB09’ב隴薯7號(hào)’雜種F1 無(wú)性株系擴(kuò)增的SSR 指紋圖M．DL100DNA；P1．‘MB09’；P2．‘隴薯7號(hào)’；1～20．‘MB09’ב隴薯7號(hào)’雜種F1Fig．1 SSR fingerprint of F1hybrid lines from‘MB09’בLongshu 7’amplified by primer C57（A）and S25（B）M．DL100DNA；P1．‘MB09’；P2．‘Longshu 7’；1－20．F1hybrid lines of‘MB09’בLongshu 7’

2．2 雜種F1 優(yōu)異株系花粉育性差異分析

8個(gè)雜交株系間的花粉可育率不同，株系F1－1、F1－13、F1－14間差異不顯著，但它們與株系F1－2、F1－7、F1－15、F1－20間均達(dá)到極顯著差異（圖2和表3）。父本‘隴薯7號(hào)’花粉育性為83．33%，母本‘MB09’為20．45%（最低），其中F1－7 的花粉育性 最高，達(dá)87．08%，且與其母本差異極顯著；其余優(yōu)異株系的花粉可育率變幅為36．73%～77．78%，介于雙親之間。根據(jù)8個(gè)株系育性程度，在今后的雜種育種中可作為中間材料進(jìn)一步利用，其中株系F1－1、F1－13、F1－14和F1－15適于作母本利用，而株系F1－2、F1－7、F1－11和F1－20適宜作父本利用。

表3 8個(gè)雜種株系及其親本花粉育性Table 3 The pollen fertility of 8hybrid lines and their parents

圖2 8個(gè)優(yōu)異雜種株系及其親本的花粉育性P1．‘隴薯7號(hào)’；a．F1－1；b．F1－2；c．F1－7；d．F1－11；e．F1－13；f．F1－14；g．F1－15；h．F1－20；P2．‘MB09’Fig．2 The pollen fertility of 8excellent hybrid lines and their parents P1．‘Longshu 7’；a．F1－1；b．F1－2；c．F1－7；d．F1－11；e．F1－13；f．F1－14；g．F1－15；h．F1－20；P2．‘MB09’

圖3 8個(gè)優(yōu)異雜種株系及其親本的PMCMⅠ染色體配對(duì)行為1．‘隴薯7號(hào)’；2．F1－1；3．F1－2；4．F1－7；5．F1－11；6．F1－13；7．F1－14；8．F1－15；9．F1－20；10．‘MB09’Fig．3 The chromosome pairing behavior of 8excellent hybrid lines and their parents at PMCMⅠ1．‘Longshu 7’；2．F1－1；3．F1－2；4．F1－7；5．F1－11；6．F1－13；7．F1－14；8．F1－15；9．F1－20；10．‘MB09’

表4 8個(gè)雜種株系及親本花粉母細(xì)胞分裂中期ⅠPMCMⅠ染色體配對(duì)構(gòu)型Table 4 Chromosome configuration of 8hybrid lines and their parents at PMCMⅠ

2．3 雜種F1 優(yōu)異株系PMCMⅠ染色體構(gòu)型分析

親本間的PMCMⅠ染色體配對(duì)構(gòu)型差異明顯（圖3和表4）。其中母本MB09 的二價(jià)體頻率較低，且棒狀二價(jià)體較多，染色體配對(duì)構(gòu)型為12．11Ⅰ＋3．93Ⅱ＋3．74Ⅲ＋4．21Ⅳ；父本隴薯7號(hào)的二價(jià)體頻率較高，且以環(huán)狀二價(jià)體為主，染色體配對(duì)構(gòu)型為1．25Ⅰ＋13．52Ⅱ＋0．94Ⅲ＋4．42Ⅳ。

與雙親相比，8個(gè)優(yōu)異雜種株系的染色體配對(duì)構(gòu)型明顯不同。株系F1－2、F1－7、F1－11和F1－20的二價(jià)體頻率為72．38%～82．91%，與父本（80．36%）接近，并以株系F1－7（82．91%）最高，且以環(huán)狀二價(jià)體為主，其染色體配對(duì)構(gòu)型分別為2．01Ⅰ＋12．15Ⅱ＋3．67Ⅲ＋2．67Ⅳ、1．42Ⅰ＋14．63Ⅱ＋1．13Ⅲ＋3．48Ⅳ、1．96Ⅰ＋13．47Ⅱ＋1．85Ⅲ＋3．38Ⅳ和2．36Ⅰ＋11．66Ⅱ＋3．83Ⅲ＋2．71Ⅳ；株系F1－1、F1－13、F1－14和F1－15的二價(jià)體頻率為49．13%～62．18%，介于雙親之間，并均以棒狀二價(jià)體為主，其染色體配對(duì)構(gòu)型分別為4．75Ⅰ＋9．79Ⅱ＋4．98Ⅲ＋2．18Ⅳ、5．67Ⅰ＋8．80Ⅱ＋5．15Ⅲ＋2．32Ⅳ、5．03Ⅰ＋9．53Ⅱ＋5．20Ⅲ＋2．08 Ⅳ和7．12Ⅰ＋7．36Ⅱ＋6．31Ⅲ＋1．81Ⅳ。將該結(jié)果進(jìn)一步與上述花粉育性情況比較表明，二價(jià)體頻率高的雜種株系，其花粉育性也高，反之則花粉育性低，這為優(yōu)異雜種株系育性評(píng)價(jià)利用提供了細(xì)胞遺傳學(xué)依據(jù)。

3 討 論

雜種無(wú)性株系真實(shí)性鑒定是馬鈴薯新品種選育的重要環(huán)節(jié)，有研究表明不同的SSR 引物在馬鈴薯雜種株系間擴(kuò)增出的指紋特征不同，可分為‘偏母型’、‘偏父型’、‘雜種型’和‘雙親互補(bǔ)型’4種類(lèi)型，其中‘雙親互補(bǔ)型’是鑒定雜種株系與親本的最佳類(lèi)型［17］；李長(zhǎng)青等的研究認(rèn)為，在馬鈴薯雜種株系SSR 標(biāo)記雙親互補(bǔ)的基礎(chǔ)上常產(chǎn)生一些缺失或非雙親的新特征帶，可看作是雙親互補(bǔ)型的新類(lèi)型，這可能是在減數(shù)分裂過(guò)程中同源染色體復(fù)制時(shí)部分堿基發(fā)生基因突變或發(fā)生染色體交換和配對(duì)引起的［11，18］。本試驗(yàn)利用篩選出的2對(duì)SSR 特異引物C57和S25對(duì)‘MB09’ב隴薯7號(hào)’雜種F1中選出的20個(gè)優(yōu)良株系基因組DNA 擴(kuò)增的SSR 指紋圖顯示，同一雜種株系用不同SSR 引物擴(kuò)增出的指紋特征不同，不同雜種株系用同一SSR 引物擴(kuò)增出的指紋亦不同，據(jù)此認(rèn)為在馬鈴薯雜種株系鑒定時(shí)，除考慮以上雙親互補(bǔ)型、缺失型和新類(lèi)型外，還可以結(jié)合親本及其雜種株系的SSR 指紋差異進(jìn)行判定，若雜種株系與雙親的DNA 指紋明顯不同，即可將其認(rèn)定為真實(shí)的雜種株系，而引起不同雜種株系間的DNA 指紋差異的原因還有待深入研究。另外，本試驗(yàn)中用引物S25可將20個(gè)雜種株系及其與親本完全區(qū)別開(kāi)來(lái)，而用引物C57只能區(qū)分90%的雜種株系，因此在建立馬鈴薯雜種株系DNA 指紋圖時(shí)應(yīng)選用2對(duì)以上SSR 特異引物。

花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂過(guò)程較為復(fù)雜，受到一系列基因的精準(zhǔn)控制，不論這些基因中的哪一個(gè)發(fā)生倒位、斷裂等變異，均會(huì)導(dǎo)致減數(shù)分裂發(fā)生異常，細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)發(fā)生變化，最終導(dǎo)致花粉敗育［19］。不少學(xué)者在水稻［20，21］、玉米［22］、大豆［23］等作物上的研究表明，花粉敗育的主要原因是雜種F1花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)，因染色體組來(lái)自不同親本，在染色體組之間出現(xiàn)不平衡現(xiàn)象，如單價(jià)體、落后染色體和微核等導(dǎo)致雜種不育，因此在減數(shù)分裂時(shí)二價(jià)體出現(xiàn)頻率越高，其花粉育性越高。本試驗(yàn)對(duì)‘MB09’ב隴薯7號(hào)’的8個(gè)優(yōu)異雜種株系花粉母細(xì)胞PMCMⅠ染色體構(gòu)型及其花粉育性觀測(cè)亦表明，二價(jià)體頻率高的株系其花粉育性亦高，這與前人研究結(jié)果一致，為馬鈴薯雜種株系進(jìn)一步作為雜交中間材料利用提供細(xì)胞遺傳學(xué)依據(jù)。

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