豬心肌和骨骼肌miRNA轉(zhuǎn)錄組比較分析

譚 婭，馬繼登，劉一輝，沈林園，李學(xué)偉，李明洲，朱 礪

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究所，四川 雅安 625014)

豬心肌和骨骼肌miRNA轉(zhuǎn)錄組比較分析

譚 婭，馬繼登，劉一輝，沈林園，李學(xué)偉，李明洲，朱 礪

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究所，四川 雅安 625014)

【目的】 研究microRNA (miRNA)在豬不同類型肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中的作用?！痉椒ā?以豬心肌以及2種骨骼肌(背最長(zhǎng)肌和腰大肌)為材料，采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)鑒定其miRNA轉(zhuǎn)錄組，并進(jìn)行差異表達(dá)分析和靶基因富集分析。【結(jié)果】 從豬心肌、背最長(zhǎng)肌和腰大肌組織的3個(gè)小RNA測(cè)序文庫(kù)中共獲得約56M的序列，通過(guò)生物信息分析共鑒定出907個(gè)非冗余miRNA，其中441個(gè)miRNA在3個(gè)文庫(kù)共同表達(dá)，123個(gè)miRNA在文庫(kù)間表現(xiàn)為顯著的差異表達(dá)(P<10-6)。對(duì)3個(gè)文庫(kù)差異表達(dá)miRNA的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，背最長(zhǎng)肌與腰大肌的相關(guān)性最高(r=0.94)，證明2種骨骼肌的表達(dá)模式十分相近，而心肌與2種骨骼肌的表達(dá)模式不同。通過(guò)對(duì)各文庫(kù)高表達(dá)的miRNA分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)量前十的miRNA中有6個(gè)miRNA的表達(dá)量在心肌中極顯著上調(diào)。對(duì)在心肌內(nèi)上調(diào)的6個(gè)miRNA進(jìn)行的靶基因預(yù)測(cè)和生物學(xué)功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，這些差異miRNA主要靶向作用于鈣信號(hào)通路和胰島素信號(hào)通路。熒光定量PCR (qRT-PCR)驗(yàn)證結(jié)果表明高通量測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可靠?！窘Y(jié)論】 從miRNA層面揭示了豬心肌和骨骼肌的差異，這種差異在一定程度上印證了心肌和骨骼肌之間迥異的生理學(xué)特征。

microRNA；心??；骨骼肌；高通量測(cè)序；豬

心肌和骨骼肌均是來(lái)源于脊椎動(dòng)物的中胚層橫紋肌，其中心肌的線粒體和肌紅蛋白含量豐富，氧化能力和抗疲勞能力均高于骨骼肌。相比之下，骨骼肌為異質(zhì)性很高的組織，根據(jù)肌纖維類型可將骨骼肌分為氧化型(腰大肌)和酵解型(背最長(zhǎng)肌)，這2種類型的骨骼肌在氧化酵解和抗疲勞能力方面存在顯著差異[1-2]。心肌和骨骼肌在生物體內(nèi)發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能，同時(shí)其細(xì)胞結(jié)構(gòu)也呈現(xiàn)出明顯差異[3]。哺乳動(dòng)物的大多數(shù)心肌細(xì)胞是具有分支結(jié)構(gòu)的雙核細(xì)胞，心肌細(xì)胞間具有閏盤(pán)結(jié)構(gòu)，而骨骼肌細(xì)胞為長(zhǎng)梭形的多核細(xì)胞。肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的這種差異與心肌和骨骼肌的功能差異息息相關(guān)。

miRNA(microRNA)是一類長(zhǎng)18～24 nt的內(nèi)源性非編碼小RNA，它通過(guò)與靶mRNA的3′UTR區(qū)完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶向mRNA的降解或翻譯抑制[4]。前人研究表明，miRNA在生物個(gè)體的生理和病理過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用[5-6]，血清應(yīng)答因子(Serum response factor,SRF)/心肌素(Myocardin)和肌肉分化因子(Myogenic differentiation,MyoD)/肌肉增強(qiáng)因子(Myocyte enhancer factor,MEF)分別是心肌和骨骼肌發(fā)育過(guò)程中關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，miRNA可通過(guò)正反饋或負(fù)反饋調(diào)控這些轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)節(jié)心肌和骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育[7]。

豬在解剖學(xué)和生理學(xué)上與人具有很高的相似性，因此通常被作為一種生物模型進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)研究[8]。目前，已有研究比較了氧化型和酵解型肌肉的miRNA轉(zhuǎn)錄組[9]，而骨骼肌與心肌miRNA轉(zhuǎn)錄組的比較還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)利用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定和對(duì)比了豬心肌和骨骼肌的miRNA轉(zhuǎn)錄組，試圖從miRNA層面探討和解釋兩者的本質(zhì)差異，并為后續(xù)肌肉相關(guān)的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

3頭210日齡的雌性長(zhǎng)白豬，按照NY/T 65-2004豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)于重慶市畜牧科學(xué)研究院。試豬屠宰后，迅速分離心肌(CM)、背最長(zhǎng)肌(LDM，酵解型骨骼肌的典型代表)和腰大肌(PMM，氧化型骨骼肌的典型代表)組織，通過(guò)液氮瞬間冷凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA的提取 采用Ambion公司的mirVanaTMmiRNA Isolation試劑盒提取樣品的RNA。所有RNA樣品進(jìn)行1%甲醛變性凝膠電泳、核酸蛋白儀和毛細(xì)管電泳檢測(cè)。

1.2.2 小RNA文庫(kù)的構(gòu)建及高通量測(cè)序 分別取3頭試驗(yàn)豬心肌、背最長(zhǎng)肌和腰大肌組織的總RNA各5 μg，將相同組織的總RNA混合即得該組織的小RNA文庫(kù)。高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建的主要步驟如下：利用聚丙烯酰胺凝膠電泳從總RNA中純化出14～40 nt的小RNA，用T4連接酶(Promega，美國(guó))連接上特異的接頭序列；利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系(Invitrogen公司，美國(guó))對(duì)加接頭后的小RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增；利用LC Sciences公司的Illumina GA-2(36 nts)測(cè)序平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增后的cDNA進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 miRNA測(cè)序結(jié)果的生物信息學(xué)分析 原始的測(cè)序結(jié)果通過(guò)Illumina GA-2測(cè)序平臺(tái)自帶的質(zhì)量控制程序(Pipeline software)進(jìn)行預(yù)處理，參照Li等[10]的方法對(duì)數(shù)據(jù)做進(jìn)一步處理。去除接頭序列后，測(cè)序讀段(reads)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)度(14～27 nt)過(guò)濾、序列組成(A、C、G 或 T 含量<80%)過(guò)濾以及拷貝數(shù)(拷貝數(shù)>3)過(guò)濾，剩下的讀段再通過(guò)與NCBI[11]、Rfam[12]以及Repbase database[13]數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)去除豬已知的RNA序列，最終得到高質(zhì)量讀段(High-quality reads)。將高質(zhì)量讀段與miRBase中豬以及其他24種哺乳動(dòng)物已知的前體miRNA序列進(jìn)行比對(duì)，鑒定出豬已知、保守以及推定的miRNA序列。

1.2.4 miRNA差異表達(dá)分析及生物學(xué)功能預(yù)測(cè) 利用IDEG6[14]在線軟件對(duì)3個(gè)文庫(kù)miRNA表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和顯著性檢驗(yàn)(包括Audic-Claver test、Fisher exact test 以及 Chi-square 2×2 test 3種方法)。在3種檢驗(yàn)方法下同時(shí)達(dá)到P<10-6(Bonferroni correction)的miRNA定義為差異表達(dá)miRNA。

采用PicTar[15]和TargetScan human 5.1[16]2種軟件對(duì)組織間差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，并取這2個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的交集作為最終預(yù)測(cè)的靶基因。將預(yù)測(cè)得到的靶基因通過(guò)DAVID在線軟件(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)進(jìn)行基因注解(GOterm)和KEGG通路(KEGG pathway)分析，獲得miRNA靶基因富集的生物學(xué)通路。

1.2.5 熒光定量PCR分析 隨機(jī)選取5個(gè)miRNA，采用伯樂(lè)公司的FX96實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)對(duì)其在3種肌肉組織中的表達(dá)量進(jìn)行熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)。熒光定量PCR試劑盒采用High-Specificity miRNA qRT-PCR Detection Kit(Stratagene公司，美國(guó))。定量上、下游引物由miRNA序列本身和通用引物組成，定量試驗(yàn)選用 U6 snRNA,18S rRNA 和Met-tRNA 作為內(nèi)參基因[17]，采用2-ΔΔCt法對(duì)定量試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析處理，采用單因素方差分析對(duì)差異顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的質(zhì)量檢測(cè)

1%甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)RNA有26S和18S 2條清晰亮帶，且26S條帶亮度約為18S條帶亮度的2倍，幾乎不見(jiàn)5S條帶；核酸蛋白儀檢測(cè)結(jié)果顯示，RNA樣品的A260/A280約為1.95；毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果也表明RNA的完整性和純度都能達(dá)到小RNA測(cè)序的要求。

2.2 小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)概述

利用高通量測(cè)序技術(shù)從豬心肌(CM)、背最長(zhǎng)肌(LDM)和腰大肌(PMM)組織的小RNA測(cè)序文庫(kù)中共獲得約56 M(million)原始測(cè)序數(shù)據(jù)。過(guò)濾掉已知的小RNA(如rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA)、mRNA以及重復(fù)序列片段(圖1-A)，得到可參與后續(xù)分析的高質(zhì)量讀段。其中從心肌、背最長(zhǎng)肌和腰大肌測(cè)序文庫(kù)分別獲得20.31 M，15.87 M和17.93 M的高質(zhì)量讀段，這些測(cè)序讀段分別占原始數(shù)據(jù)的94.12%，95.48%和97.14%。

如圖1-B所示，3個(gè)文庫(kù)的高質(zhì)量讀段長(zhǎng)度分布(length distribution)基本一致，絕大部分高質(zhì)量讀段長(zhǎng)度在21～23 nt，該長(zhǎng)度分布與典型的miRNA長(zhǎng)度分布相符[18]，從側(cè)面反映了本研究中小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性。

2.3 miRNA表達(dá)譜鑒定

根據(jù)前體和成熟體的特征，本研究共鑒定出3類miRNA：第1類為豬已知 miRNA，共包括321個(gè)成熟miRNA，此類miRNA能被定位到271個(gè)豬已知的miRNA前體上。目前，從miRBase 19.0數(shù)據(jù)庫(kù)(2012-08)中已知豬有271個(gè)miRNA前體和306個(gè)miRNA成熟體，本研究中所鑒定出的miRNA覆蓋了所有已報(bào)道的豬miRNA序列；第2類為豬保守的miRNA，包括72個(gè)成熟miRNA，這些miRNA能定位到豬的基因組以及miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中65個(gè)其他已知哺乳動(dòng)物的前體miRNA；第3類為豬推定的miRNA，該組包括512個(gè)成熟miRNA，對(duì)應(yīng)了505個(gè)前體miRNA序列，這些前體miRNA的基因組序列經(jīng)UNAFold[19]軟件預(yù)測(cè)能形成穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，同時(shí)這些序列的長(zhǎng)度為18～26 nt，并且在miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中不能與任何哺乳動(dòng)物的前體miRNAs比對(duì)上。由于不同前體miRNA可以編碼相同的成熟miRNA，最終在3個(gè)文庫(kù)中總共鑒定得到907個(gè)非冗余的成熟miRNA序列(Unique miRNA)。

本研究發(fā)現(xiàn)，豬已知miRNA的數(shù)量?jī)H占CM、LDM和PMM 3個(gè)文庫(kù)miRNA總數(shù)的42.78%，39.36%和41.01%，但其拷貝數(shù)總和占所有miRNA拷貝數(shù)總和的99.39%，96.45%和97.19%，另外2類miRNA的拷貝數(shù)僅占到所有miRNA拷貝數(shù)總和的1.59%，3.53%和2.80%(圖1-C)，這說(shuō)明測(cè)序得到的大部分序列為豬已知miRNA的表達(dá)序列，同時(shí)也證明了低拷貝數(shù)的miRNA可以通過(guò)測(cè)序技術(shù)進(jìn)行有效的鑒定和分析。

2.4 miRNA在3個(gè)文庫(kù)中的差異表達(dá)分析

本研究對(duì)所鑒定的907個(gè)非冗余miRNA進(jìn)行了組織特異性表達(dá)分析，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，共有441(48.62%)個(gè)非冗余 miRNA在3個(gè)文庫(kù)中共表達(dá)，另有161(17.75%)，68(7.51%)和158(17.42%)個(gè)非冗余miRNA分別特異性表達(dá)于CM、LDM和PMM組織中。為了進(jìn)一步檢測(cè)3個(gè)組織中miRNA的差異表達(dá)情況，綜合運(yùn)用IDEG6在線分析軟件中3種不同的統(tǒng)計(jì)方法(Audic-Claverie test、Fisher exact test 以及Chi-square 2×2 test)對(duì)miRNA的表達(dá)進(jìn)行了差異顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果表明，在907個(gè)非冗余miRNA中，有123個(gè)非冗余miRNA在3個(gè)文庫(kù)間呈現(xiàn)出顯著的差異表達(dá)模式(P<10-6)。

對(duì)上述123個(gè)差異表達(dá)的非冗余miRNA進(jìn)行表達(dá)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，背最長(zhǎng)肌與腰大肌的相關(guān)系數(shù)(r=0.94，P<0.01)明顯高于心肌與背最長(zhǎng)肌(r=0.77，P<0.01)以及心肌與腰大肌(r=0.81，P<0.01)的相關(guān)系數(shù)(圖3)，該結(jié)果說(shuō)明同為骨骼肌的背最長(zhǎng)肌和腰大肌的miRNA表達(dá)譜更為接近，而心肌的miRNA表達(dá)譜與2種骨骼肌明顯不同。該結(jié)果證明在miRNA表達(dá)譜層面即能很好地將豬的心肌和骨骼肌加以區(qū)分。

圖3 豬CM、LDM和PMM 3個(gè)文庫(kù)123個(gè)差異表達(dá)miRNA的相關(guān)性分析CM.心肌；LDM.背最長(zhǎng)??；PMM.腰大??；lg CM、lg LDM和lg PMM分別為CM、LDM和PMM文庫(kù)miRNA拷貝數(shù)的常用對(duì)數(shù)Fig.3 Correlation analysis of 123 differentially expressed miRNAs among three libraries of pigCM.Cardiac muscle;LDM.Longissimus dorsi muscle;PMM.Psoas major muscle;All reads of miRNAs from CM,LDM and PMM libraries were calculated as lg

2.5 差異表達(dá)miRNA的生物學(xué)功能預(yù)測(cè)

豬心肌內(nèi)表達(dá)量前十的miRNAs及其分布比例見(jiàn)圖4。

圖4 豬心肌內(nèi)表達(dá)量前十的miRNAs及其分布比例Fig.4 Top ten miRNAs and their ratios of high-quality reads in CM of pig

本研究鑒定出的豬miRNA拷貝數(shù)呈現(xiàn)出一種較大的動(dòng)態(tài)變化，表達(dá)量較低的miRNA其測(cè)序拷貝數(shù)僅有3個(gè)，但是表達(dá)量高的miRNA其測(cè)序拷貝數(shù)能達(dá)到上百萬(wàn)個(gè)，而3個(gè)文庫(kù)中表達(dá)量前十的miRNA(miR-143-3p、miR-378-1&-2-3p、miR-1-3p、miR-133a-1&-2-3p、miR-27b-3p、miR-148a-3p、let-7f-1&-2-5p、miR-30e-5p、miR-101-1&-2-3p和let-7a-1-5p)占整個(gè)文庫(kù)拷貝數(shù)的絕大部分。在心肌中，表達(dá)量前十的miRNA拷貝數(shù)占高質(zhì)量讀段的82.24%(圖4)，如此高豐度的表達(dá)可能暗示它們?cè)谛募≈杏兄匾δ?。此外，本研究發(fā)現(xiàn)在心肌內(nèi)表達(dá)量前十的miRNA在其他2個(gè)文庫(kù)也高表達(dá)，并且其中有8個(gè)miRNAs(miR-143-3p、miR-378-1&-2-3p、miR-1-3p、miR-133a-1&-2-3p、miR-27b-3p、miR-30e-5p、miR-101-1&-2-3p和let-7a-1-5p)在3個(gè)文庫(kù)呈現(xiàn)出差異表達(dá)模式(P<10-6)，這8個(gè)miRNA中有6個(gè)miRNA(miR-143-3p、miR-378-1&-2-3p、miR-27b-3p、miR-30e-5p、miR-101-1&-2-3p和let-7a-1-5p)在心肌中的表達(dá)量同時(shí)極顯著高于背最長(zhǎng)肌和腰大肌(圖5)。

圖5 豬心肌內(nèi)高表達(dá)的前十個(gè)miRNAs在3個(gè)文庫(kù)的相對(duì)表達(dá)量**表示與心肌相比差異極顯著(P<0.01)；CM.心肌；LDM.背最長(zhǎng)??；PMM.腰大肌Fig.5 Relative expression levels of the ten most highly expressed miRNAs in cardiac muscle across the three libraries of pig** indicates highly significant difference (P<0.01) when compared with CM;CM.Cardiac muscle;LDM.Longissimus dorsi muscle;PMM.Psoas major muscle

綜合考慮目前豬基因組注釋工作的缺陷以及已鑒定的豬miRNA種類的局限，本研究對(duì)這6個(gè)在豬心肌內(nèi)顯著上調(diào)的miRNA進(jìn)行了靶基因的預(yù)測(cè)以及KEGG通路分析，并將預(yù)測(cè)得到的靶基因在DAVID在線分析軟件中對(duì)其功能進(jìn)行分類，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，這些miRNA靶基因顯著地富集于擴(kuò)張型心肌病、肥厚型心肌病、鈣信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路和Ⅱ型糖尿病等生物學(xué)通路，其中鈣離子反應(yīng)、負(fù)調(diào)控鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)過(guò)程與鈣信號(hào)通路有關(guān)，而胰島素刺激反應(yīng)、胰島素刺激的細(xì)胞反應(yīng)、胰島素受體信號(hào)通路以及調(diào)控胰島素受體信號(hào)通路等生物學(xué)過(guò)程與胰島素信號(hào)通路有關(guān)。

2.6 高通量數(shù)據(jù)驗(yàn)證

隨機(jī)選取5個(gè)miRNAs(miR-378-1&-2-3p、miR-139-5p、miR-499-5p、miR-206-3p和miR-208b-3p)在心肌、背最長(zhǎng)肌和腰大肌組織中進(jìn)行qRT-PCR分析，并與miRNA高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行皮爾森相關(guān)性分析，結(jié)果(表1)表明，高通量測(cè)序結(jié)果和qRT-PCR結(jié)果呈極顯著的正相關(guān)(r=0.98±0.02,P<0.01)，表明本研究高通量測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

圖6 豬心肌內(nèi)上調(diào)的6個(gè)miRNA靶基因的生物學(xué)功能分析圖柱旁邊的數(shù)字為富集在該通路的基因數(shù)目Fig.6 Gene function analysis on targets of the six up-regulated miRNAs in pig CM Number behind each bar is the involved genes

表1 豬miRNA高通量測(cè)序結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果的皮爾森相關(guān)性分析Table 1 Pearson’s correlation analysis between deep sequencing results and qRT-PCR results of pig miRNAs

3 討 論

從本研究豬心肌、背最長(zhǎng)肌和腰大肌組織的3個(gè)文庫(kù)高質(zhì)量讀段長(zhǎng)度分布上看，21～23 nt讀段最多，該長(zhǎng)度分布符合miRNA長(zhǎng)度分布模式，這是Dicer酶切割的典型產(chǎn)物長(zhǎng)度[18]。Illumina GA-2測(cè)序平臺(tái)的測(cè)序長(zhǎng)度在18～24 nt，符合miRNAs成熟體的長(zhǎng)度范圍，并且隨機(jī)選取的5個(gè)miRNA的qRT-PCR結(jié)果與高通量測(cè)序結(jié)果相關(guān)性也極高，證明本研究高通量測(cè)序結(jié)果的可靠性。

miR-1和miR-133是肌肉特異的miRNA，不僅參與肌細(xì)胞的增殖和分化的全過(guò)程，同時(shí)也參與心肌細(xì)胞的傳導(dǎo)性功能以及肌肉的肥大等過(guò)程，因此其在豬心肌和骨骼肌里都高表達(dá)；miR-143是心血管特異性的miRNA，其對(duì)血管平滑肌有重要調(diào)控作用[20]。本研究表明，miR-143在豬心肌內(nèi)表達(dá)量最高；miR-378在豬心肌和骨骼肌內(nèi)均高表達(dá)，其可抑制靶基因肌細(xì)胞分化抑制因子(myoR)的表達(dá)，在肌細(xì)胞分化過(guò)程中，miR-378的表達(dá)量上升，從而促進(jìn)了肌肉的分化[21]；let-7a在心肌和骨骼肌中廣泛表達(dá)；而關(guān)于miR-27b、miR-30e和miR-101與肌肉相關(guān)的報(bào)道很少，這些高表達(dá)的miRNAs預(yù)示了其在豬心肌和骨骼肌中均有重要的生物學(xué)功能。

本研究對(duì)在豬心肌內(nèi)上調(diào)的6個(gè)miRNAs的靶基因進(jìn)行了基因注解(GOterm)和KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)了一些重要的生物學(xué)通路，比如鈣信號(hào)通路和胰島素信號(hào)通路。鈣信號(hào)與肌肉的收縮及代謝、細(xì)胞的增殖以及其他一些信號(hào)通路密切相關(guān)；而胰島素信號(hào)參與了葡萄糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖與分化及抗凋亡等重要過(guò)程。結(jié)合前人的研究報(bào)道，本研究找到了心肌內(nèi)富集鈣信號(hào)通路和胰島素信號(hào)通路的證據(jù)。Ikeda等[22]和Dong等[23]通過(guò)熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR-1的靶基因?yàn)殁}調(diào)蛋白(CaM)，而miR-133的靶基因?yàn)殁}調(diào)磷酸酶(CaN)，CaM和CaN都是鈣信號(hào)通路的關(guān)鍵性因子。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-1和miR-133在2種骨骼肌里的表達(dá)水平均高于心肌，說(shuō)明骨骼肌內(nèi)CaM和CaN的表達(dá)較心肌低，則鈣信號(hào)通路活性也相應(yīng)較低，這與前面預(yù)測(cè)的鈣信號(hào)通路在心肌內(nèi)富集的結(jié)果相符。Pandey 等[24]發(fā)現(xiàn)，miR-29a能夠通過(guò)調(diào)控 PI3Kp85亞基活性直接減弱下游的胰島素信號(hào)；并且也有報(bào)道表明miR-29a可間接抑制Akt的表達(dá)[25]，從而負(fù)調(diào)控胰島素信號(hào)通路。本研究中，miR-29a(本次測(cè)序結(jié)果中的一個(gè)miRNA)在心肌內(nèi)的表達(dá)量同時(shí)低于2種骨骼肌(結(jié)果未列出)，可能導(dǎo)致PI3K和Akt在心肌的表達(dá)量升高，使胰島素信號(hào)增強(qiáng)，這也與筆者預(yù)測(cè)的胰島素信號(hào)在心肌內(nèi)富集的結(jié)果相一致。

本研究中，豬心肌和骨骼肌的miRNA存在著差異表達(dá)，且表達(dá)量排名前十的miRNAs差異十分明顯。心肌上調(diào)的miRNAs靶基因主要富集在鈣信號(hào)通路和胰島素信號(hào)通路，這些差異可能部分揭示了豬心肌和骨骼肌功能的差異，同時(shí)也為今后肌肉相關(guān)的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Comparative analysis on miRNA transcriptomes of cardiac muscle and skeletal muscle in pigs

TAN Ya,MA Ji-deng,LIU Yi-hui,SHEN Lin-yuan, LI Xue-wei,LI Ming-zhou,ZHU Li

(InstituteofAnimalGeneticsandBreeding,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an,Sichuan625014,China)

【Objective】 This study aimed to understand the function of miRNA in development of distinct muscles in pigs.【Method】 Illumina deep sequencing approach was applied for identification of miRNA transcriptomes of cardiac muscle and two skeletal muscles (longissimusdorsimuscle andpsoasmajor muscle) in pigs,and their differential expressions and target genes were analyzed.【Result】 A total of 56 million sequences were obtained from three small RNA sequencing libraries and 907 miRNAs were identified,of which 441 were co-expressed and 123 were differentially expressed (P<10-6) across the three libraries.The correlation analysis of these differentially expressed miRNAs showed thatlongissimusdorsimuscle andpsoasmajor muscle had a similar expression pattern (r=0.94),while cardiac muscle had a different expression pattern.By ranking analyses of highly expressed miRNAs in three libraries,six out of the top ten miRNAs in cardiac muscle were up-regulated simultaneously compared tolongissimusdorsimuscle andpsoasmajor muscle.GO and KEGG analyses on potentially function of target genes of the six up-regulated miRNAs in cardiac muscle showed that the involved target genes mainly enriched in calcium signaling pathway and insulin signaling pathway.qRT-PCR results also validated the high confidence of the deep sequencing data.【Conclusion】 The differences of miRNA transcriptomes in pigs,to some extent,highlighted the dramatically physiological differences between cardiac muscle and skeletal muscles.

microRNA;cardiac muscle;skeletal muscle;deep sequencing;pig

2014-01-27

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(“863”計(jì)劃)項(xiàng)目(2013AA102502)；國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2014ZX0800950B，2011ZX08006-003)；教育部長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(IRT13083)

譚 婭(1989-)，女，重慶開(kāi)縣人，在讀碩士，主要從事豬microRNA相關(guān)研究。

朱 礪(1975-)，男，四川廣元人，教授，主要從事豬的遺傳育種研究。E-mail:zhuli7508@163.com

時(shí)間:2015-06-30 13:47

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.08.023

Q78;S828.8

A

1671-9387(2015)08-0019-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150630.1347.023.html