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    NaCl脅迫對荊芥種子萌發(fā)及幼苗抗氧化酶活性的影響

    2015-07-01 23:34:03張瑞娥王智穎豆麗君劉小麗
    關(guān)鍵詞:荊芥陰離子幼苗

    張瑞娥,王 娟, 王智穎, 豆麗君, 劉小麗,2*

    (1.阜陽師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院,安徽 阜陽 236037;2.抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心,安徽 阜陽 236037)

    NaCl脅迫對荊芥種子萌發(fā)及幼苗抗氧化酶活性的影響

    張瑞娥1,王 娟1, 王智穎1, 豆麗君1, 劉小麗1,2*

    (1.阜陽師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院,安徽 阜陽 236037;2.抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心,安徽 阜陽 236037)

    用紙床培養(yǎng),通過測定萌發(fā)率、胚根長、胚芽長、鮮重等生物量指標(biāo)及各項生理生化指標(biāo)的方法探究了不同濃度NaCl(0 mmol/L、25 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L、200 mmol/L)脅迫對特大葉荊芥幼苗種子萌發(fā)及幼苗生長的影響。結(jié)果表明:NaCl脅迫對荊芥種子萌發(fā)率無明顯影響,而荊芥根長、芽長、鮮重、子葉展開數(shù)和種皮脫落數(shù)等均隨濃度的增加呈下降趨勢,當(dāng)脅迫濃度≥100 mmol/L時抑制極為顯著。SOD和POD活性在25 mmol/L的NaCl脅迫濃度下較對照組升高,而在其后的脅迫濃度下均較對照組低,陰離子氧生成量表現(xiàn)出相應(yīng)的先下降后上升的趨勢。

    荊芥;NaCl脅迫;種子萌發(fā);生理指標(biāo);抗氧化酶

    長期以來, 自然因素和人為因素的影響導(dǎo)致土地鹽漬化情況越來越嚴(yán)重[1]。鹽堿土環(huán)境下,由于離子間的相互拮抗、離子的非滯留性和強(qiáng)淋溶性等原因,而致使土壤中一些植物生長所必需元素含量降低或有害物質(zhì)含量增加[2],進(jìn)而改變植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)[3]及植物的基礎(chǔ)代謝[4-6],在種子萌發(fā)[7]、苗期生長[8]直至整個生命周期中對植物造成很大的傷害。因此,目前不僅要關(guān)注于鹽堿土壤的改良,亦要了解植物鹽脅迫的生理機(jī)制,以為鹽堿狀態(tài)下植物的栽培奠定理論基礎(chǔ)。

    荊芥(NepetacatariaL.) 為唇形科的一年生草本植物,其干燥地上部分,是臨床常用中藥[9-10]。荊芥中葉大者更為鮮嫩,稱為“大葉荊芥”,而特大葉荊芥(葉長6~8 cm,寬3~5 cm)的產(chǎn)量較大葉荊芥的產(chǎn)量要高出35%~85%[11]。通過研究不同濃度梯度的NaCl 脅迫對荊芥種子萌發(fā)、幼苗性狀和生理指標(biāo)的影響,可為篩選、鑒定和培育耐鹽堿荊芥提供重要指導(dǎo)意義。植物整個生命周期的關(guān)鍵是種子萌發(fā)和幼苗生長,李秀霞、張吉立、 張錦偉、于泉林等人及國家標(biāo)準(zhǔn)中都采用種子萌發(fā)和幼苗生長狀況作為評價鹽害對植物的影響程度的指標(biāo)[12-16]。前人通過鹽脅迫對紫蘇、海濱錦葵、決明等類似荊芥的藥用植物的種子萌發(fā)和幼苗生長等方面進(jìn)行了研究[17-19]。但是針對特大葉荊芥種子,NaCl脅迫對其的影響的研究還鮮見報道?;诖耍驹囼炛饕蕴卮笕~荊芥種子為試驗材料,對其進(jìn)行一定時間的NaCl脅迫處理和緩解生長,探究NaCl脅迫對特大葉荊芥種子萌發(fā)、幼苗生長及生理生化指標(biāo)的影響,以期為解決鹽脅迫對荊芥的危害及荊芥耐鹽性鑒定提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 供試材料

    供試品種為特大葉荊芥種子,購于阜陽市潁匯大市場。

    1.1.2 試劑配制

    蒸餾水;NaCl母液;Hangland完全培養(yǎng)液;0.05 mol/L磷酸緩沖液(PH7.8);SOD反應(yīng)液[130 mmol/L甲硫氨酸溶液、750 μmol/L氮藍(lán)四唑溶液、100 μmol/LEDTA-Na2溶液];20 μmol/L核黃素溶液;20 mmol/L KH2PO4;POD反應(yīng)混合液[取100 mmol/L PH6.0 PBS 50 mL,加入愈創(chuàng)木酚28 μL,加熱攪拌,直至愈創(chuàng)木酚溶解,待溶液冷卻后,加入30% H2O219 μL,混合均勻,保存于冰箱中];1 mmol/L鹽酸羥胺(70 mg/L);磺胺;萘胺。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 種子處理

    荊芥種子用0.1% KMnO4浸泡消毒15分鐘,用蒸餾水沖洗干凈,并將漂浮于水面上的死種子挑出,重復(fù)至溶液無色。

    1.2.2 種子萌發(fā)試驗

    準(zhǔn)備18套干燥而潔凈的直徑為9 cm的培養(yǎng)皿,平均分成三組即3個重復(fù),對每組培養(yǎng)皿對應(yīng)NaCl濃度(0、25、50、100、150、200 mmol/L)進(jìn)行編號(NCK、NT1、NT2、NT3、NT4、NT5)并貼標(biāo)簽,每培養(yǎng)皿墊2張定性濾紙后加入對應(yīng)濃度的NaCl溶液20 mL,從消毒過的荊芥種子中精選大小一致、健壯飽滿的籽粒,分別取100 粒種子擺放入墊有2 層濾紙的培養(yǎng)皿中,盡量保持籽粒間間距一致,避免垛疊影響結(jié)果,擺放完成后,將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中,25 ℃無光照培養(yǎng)。每天需定時定量更換濾紙及處理液(前5天為20 mL,后幾天為10 mL),觀察種子萌發(fā)情況并記錄發(fā)芽粒數(shù)。

    1.2.3 緩解生長試驗

    待NaCl各濃度中均再無種子萌發(fā)后,更換濾紙,并將處理液更換為Hoagland 營養(yǎng)液每皿5 mL,將材料移入智能光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),白天12 h、25 ℃、六級光照;晚上12 h、23 ℃、無光照,每天根據(jù)干濕度情況對材料適量添加Hoagland完全培養(yǎng)液,使植物體正常生長,并于兩周后觀察記錄荊芥成苗數(shù)。

    1.3 測定項目及方法

    1.3.1 生物量指標(biāo)的測定

    NaCl脅迫處理前8天每天觀察并記錄每培養(yǎng)皿中的種子萌發(fā)數(shù),計算萌發(fā)率;于第9天觀察記錄子葉展開數(shù)和種皮脫落數(shù);第10天,每皿隨機(jī)選取10株荊芥植株,測其根長、芽長,用濾紙吸干植株表面水分后測量鮮重;計算緩解生長后的成苗率。

    1.3.2 抗氧化酶活性的測定

    1.3.2.1 酶液的提取

    每一處理組中分別稱量完整的荊芥植株0.3 g放入預(yù)冷的研缽中,加1 mL預(yù)冷的0.05 mol/L磷酸緩沖液(PH7.8)研磨,待研磨成勻漿后再加1 mL磷酸緩沖液(PH7.8)繼續(xù)研磨,之后將其轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中,先后加2 mL磷酸緩沖液到研缽中洗滌兩次,再轉(zhuǎn)移到離心管。將離心管放入離心機(jī)中,所得勻漿用LD-4A低速離心機(jī)于4 000 r/min下離心10 min,將上清液小心倒入干凈的離心管,即為提取的酶液。

    1.3.2.2 酶活性及陰離子氧生成量的測定

    SOD( 超氧化物歧化酶) 活性的測定采用王學(xué)奎的NBT(氮藍(lán)四唑)法[20];POD (過氧化物酶)活性的測定陰離子氧生成量的測定均采用瞿偉菁、張志良的方法[21]:分別是愈創(chuàng)木酚比色法和羥胺法。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    試驗數(shù)據(jù)的記錄和計算用Microsoft Excel 2003;數(shù)據(jù)的處理和統(tǒng)計分析用SPSS 軟件(13.0 版本)完成。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 NaCl脅迫對荊芥種子萌發(fā)和幼苗性狀的影響

    2.1.1 NaCl脅迫對萌發(fā)率、子葉展開和種皮脫落的影響

    根據(jù)種子在鹽脅迫下的萌發(fā)率和幼苗生長指標(biāo)可以評價萌發(fā)期的耐鹽性。由表1可以看出,在脅迫處理一天后的萌發(fā)率隨著脅迫濃度的升高而降低,低濃度(25~50 mmol/L)NaCl脅迫對一天后的萌發(fā)率影響較小,分別比對照組下降了2.65%和1.78%,未達(dá)到顯著程度。NaCl在100 mmol/L、150 mmol/L和200 mmol/L的脅迫濃度下,分別比對照組下降了39.82%、66.37%、88.51%,差異顯著(P<0.05)。在第二天到第八天,各處理組的萌發(fā)率相近,無明顯變化,并與對照組的萌發(fā)率差異不顯著。說明在這期間鹽脅迫對荊芥種子的萌發(fā)并無明顯影響,進(jìn)一步說明荊芥種子萌發(fā)期的耐鹽性高,不易受到鹽堿地的迫害。

    在不同濃度NaCl溶液脅迫下,處理組的子葉展開數(shù)及種皮脫落數(shù)均低于對照組,分別比對照組減少13.89%、30.56%、96.29%、100%、100%和10.65%、20.78%、96.29%、100%、100%,隨著脅迫濃度的增大而減少,且差異顯著(P<0.05),以致最后兩組的子葉展開數(shù)和種皮脫落數(shù)均為0。說明鹽脅迫對荊芥幼苗的生長存在著明顯的抑制作用,即使得荊芥幼苗發(fā)育緩慢,濃度越大,生長越緩慢,脅迫濃度在100 mmol/L及之后荊芥停留在種胚階段而無幼苗生長。

    表1 NaCl脅迫下荊芥種子萌發(fā)及幼苗生長指標(biāo)的影響

    注:表中數(shù)值為三次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差,字母表示相同天數(shù)不同NaCl濃度下萌發(fā)率、子葉展開率及種皮脫落百分?jǐn)?shù)在P<0.05水平上的顯著性差異。

    2.1.2 NaCl脅迫對根長、芽長、鮮重的影響

    從圖1可以看出,根長和芽長均比對照組中的數(shù)值小(根長:2.063 cm、2.008 cm、0.582 cm、0.112 cm、0.117 cm、0.093 cm;芽長:2.108 cm、1.923 cm、0.957 cm、0、0、0),且基本隨著NaCl濃度的升高而下降,根長及芽長分別比對照組下降2.67%、71.79%、94.57%、94.33%、95.49%和8.78%、54.6%、100%、100%、100%,在第3個脅迫濃度(100 mmol/L)已沒有芽的的形成,且第3個濃度之后根長的降低趨于平穩(wěn),說明低濃度的NaCl(<100 mmol/L)萌發(fā)的種子,鹽脅迫下具有根和芽的生長,高濃度的NaCl(≥100 mmol/L)溶液中的種子,雖能夠萌發(fā)(以突破種皮為標(biāo)準(zhǔn)),但在鹽溶液中很難有芽的的形成,說明鹽脅迫對根和芽的生長存在明顯的抑制作用,且對芽的抑制較強(qiáng)。

    由圖2可以看出,處理組的荊芥植株鮮重均比對照組小(0.016 14 g、0.015 17 g、0.008 69 g、0.006 16 g、0.005 98 g、0.006 41 g),基本隨著脅迫濃度的增加株重逐漸下降,分別比對照組下降6.01%、46.16%、58.49%、62.95%、60.29%,說明鹽脅迫對生長物質(zhì)的積累存在抑制作用,即鹽脅迫使得生長緩慢,有機(jī)物質(zhì)積累減少,不利生長。

    圖1 NaCl脅迫對根長和芽長的影響

    圖2 NaCl脅迫對荊芥鮮重的影響

    2.1.3 NaCl脅迫對荊芥成苗率的影響

    鹽脅迫對荊芥植物體的傷害程度可以通過成苗率(73.95%、70.26%、66%、6.2%、0.94%、0.43%)直觀的表現(xiàn)出來。由圖3可見,處理組的成苗率均低于對照組,分別是較對照組下降了4.99%、10.75%、91.62%、98.73%、99.42%,隨著脅迫濃度的增高成苗率不斷下降。說明NaCl抑制幼苗的生長,使得荊芥生長停滯或死亡。其次,可以看出,在100 mmol/L、150 mmol/L和200 mmol/L的脅迫濃度下,荊芥成苗率逐漸降低,并顯著(P<0.05)低于25 mmol/L和50 mmol/L脅迫濃度下的成苗率,說明從100 mmol/L開始,鹽脅迫的危害達(dá)到極大,到200 mmol/L時,3個重復(fù)組中的300粒種子中只一株幼苗,其它植株或只萌發(fā)不成苗,或不萌發(fā)。

    2.2 NaCl脅迫對荊芥植物體生理指標(biāo)的影響

    2.2.1 NaCl脅迫對SOD活性的影響

    圖4顯示了荊芥在不同NaCl濃度脅迫下SOD活性基本變化趨勢(455.88、463.46、345.58、285.13、245.71、163.39 U/g)。與對照組相比,低濃度NaCl(25 mmol/L)脅迫下,SOD活性較高,較對照組高出1.64%,即脅迫環(huán)境下導(dǎo)致植株產(chǎn)生SOD,以清除不良環(huán)境致使植株產(chǎn)生的過多的活性氧自由基。脅迫濃度在25 mmol/L以上的處理組SOD活性均比對照組小,分別較對照組下降24.19%、37.46%、46.1%、64.16%,且與對照組相比均是差異顯著(P<0.05)。另外,隨著脅迫濃度的升高,SOD活性逐漸降低,即SOD活性隨NaCl濃度的增高呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢,說明高濃度的NaCl抑制植株生長,過多的活性氧自由基積累抑制了SOD的活性。

    圖3 NaCl脅迫對荊芥植物體成苗率的影響

    圖4 NaCl脅迫對SOD活性的影響

    2.2.2 NaCl脅迫對POD活性的影響

    圖5 NaCl脅迫對POD活性的影響

    圖6 NaCl脅迫對陰離子氧生成量的影響

    2.2.3 NaCl脅迫對陰離子生成量的影響

    圖6顯示NaCl脅迫下陰離子氧生成量變化趨勢(8.704 9、3.442 8、9.295 5、17.669 1、25.624 8、30.249 4 nmol/g·min)。在不同濃度梯度的NaCl脅迫下,陰離子氧生成量呈現(xiàn)先降后升的變化趨勢。在25 mmol/L的NaCl脅迫下,陰離子氧生成量較對照組低60.45%,說明荊芥植株對脅迫的響應(yīng)使得體內(nèi)產(chǎn)生清除陰離子氧的酶活性增強(qiáng)。在50 mmol/L及之后的濃度脅迫下,其陰離子氧生成量分別是對照組的1.07倍、2.03倍、2.94倍、3.47倍。100 mmol/L、150 mmol/L、200 mmol/L的NaCl脅迫下,陰離子氧生成量與對照組相比均為差異顯著(P<0.05)。說明高濃度的NaCl脅迫嚴(yán)重影響荊芥植物體的代謝,導(dǎo)致清除陰離子氧的活性酶減少,陰離子氧含量上升,危害植物體的生長。

    3 總結(jié)

    種子萌發(fā)率作為衡量種子活力的指標(biāo)之一,可以反映出荊芥種子耐鹽性的高低。通過對荊芥種子萌發(fā)實驗的數(shù)據(jù)分析,可以看出NaCl脅迫對種子的萌發(fā)并無明顯影響。該結(jié)果與王桔紅和陳文對黑鍋枸杞的研究[22]中種子萌發(fā)對NaCl脅迫非常敏感的結(jié)論不一致。這可能是由于荊芥種子外包裹的白色粘膜對種子的保護(hù)作用,使得種子免于不良環(huán)境的影響,提高了種子萌發(fā)時期的耐鹽性,使種子不易受到鹽堿地的傷害,因此,處理組的萌發(fā)率與對照組差異不顯著。

    對于已萌發(fā)的荊芥種子而言,NaCl脅迫對其胚根、胚芽及鮮重等各種生物量指標(biāo)均有不同程度的影響。研究表明,對芽的抑制能力強(qiáng)于對根的抑制能力,并隨著濃度的升高,其影響越來越顯著,當(dāng)脅迫濃度大于50 mmol/L時尤為顯著,在之后濃度脅迫中,已無胚芽出現(xiàn)。同時,鮮重也隨著脅迫濃度的升高而降低。這與喬紹俊等對紫蘇的研究[17]結(jié)果一致??赡苁荖aCl脅迫導(dǎo)致荊芥組織細(xì)胞出現(xiàn)生理性缺水,也可能是高濃度的鹽脅迫導(dǎo)致質(zhì)膜選擇透過性降低而使得Na+和Cl-在細(xì)胞內(nèi)大量積累,導(dǎo)致代謝紊亂[23]。

    大量研究表明, 植物抗性與其體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)對活性氧的清除能力直接相關(guān)[24]。研究結(jié)果表明,NaCl脅迫下,荊芥植株的SOD、POD等抗氧化酶活性都發(fā)生了明顯的變化。都在25 mmol/L脅迫時較對照組出現(xiàn)相應(yīng)的升高,而在之后較對照組出現(xiàn)逐步降低的趨勢。這說明受低濃度NaCl脅迫的荊芥植株SOD、POD能夠協(xié)同作用,使活性氧的量維持在一個低水平上,降低陰離子氧對植株的傷害,也即降低NaCl脅迫對植株的傷害,而隨著脅迫濃度增高,則影響到荊芥自身物質(zhì)的合成,導(dǎo)致SOD和POD活性降低,這與李影麗等對舟山新木姜的研究[25]結(jié)果相似。因此,陰離子氧的生成量也出現(xiàn)相應(yīng)(先降后升)的變化趨勢。

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    Effect of NaCl stress on germination and seedling′s antioxidant enzymes activity of Nepeta cataria L.

    ZHANG Rui-e1,WANG Juan1,WANG Zhi-ying1,DOU Li-jun1,LIU Xiao-li1,2*

    (1.SchoolofBiologyandFoodEngineering,FuyangNormalUniversity,FuyangAnhui236037,China;2.EngineeringTechnologyResearchCenterofAnti-agingChineseHerbalMedicine,FuyangAnhui236037,China)

    By the method of filter paper cultivation, some biomass indexes including germination rate, radical length, germ length, fresh weight and some physiological indexes were studied to explore the influence of NaCl(0 mmol/L, and 25 mmol/L, and 50 mmol/L, and 100 mmol/L, and 150 mmol/L, and 200 mmol/L) stress on seed germination and seedling growth of Nepeta cataria L..The results showed that effects on seed germination rate was not significant under NaCl(0 mmol/L, and 25 mmol/L, and 50 mmol/L, and 100 mmol/L, and 150 mmol/L, and 200 mmol/L) stress,while these indexes including root length, bud length, fresh weight, the number of cotyledons opened and seed coat drop decreased with the increasing of NaCl concentration, when the concentrations is higher than 100 mmol/L the inhibition was significant. When concentration of NaCl was 25 mmol/L, SOD and POD activity was higher than the control group, while under subsequent stress, concentration activity was lower than the control group, and the anionic oxygen generation showed a corresponding upward trend after the first drop.

    NepetacatariaL.; NaCl stress; germination abilities; physiological index; antioxidant enzymes

    2015-02-28

    安徽省教育廳自然科學(xué)一般項目(KJ2013B200);阜陽師范學(xué)院自然科學(xué)重點項目(2015FSKJ03ZD);阜陽師范學(xué)院自然科學(xué)一般項目(2012FSKJ03,2013FSKJ18)資助。

    張瑞娥(1976-),女,碩士,講師,研究方向:植物營養(yǎng)與逆境生理。

    劉小麗(1967-),女,博士,副教授,研究方向:藥用植物學(xué),Email:Liu-x-l2002@sina.com。

    Q945.78

    A

    1004-4329(2015)03-059-06

    10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329(2015)03-059-06

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