芒果MSOC1基因的克隆與表達(dá)分析

魏軍亞，唐 杰，劉國(guó)銀，劉德兵＊，陳業(yè)淵

（1中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所／農(nóng)業(yè)部熱帶作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，海南儋州571737；2海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，?？?70228；3海南大學(xué)應(yīng)用科技學(xué)院，海南儋州571737）

芒果MSOC1基因的克隆與表達(dá)分析

魏軍亞1，唐 杰2，劉國(guó)銀3，劉德兵3＊，陳業(yè)淵1

（1中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所／農(nóng)業(yè)部熱帶作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，海南儋州571737；2海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海口570228；3海南大學(xué)應(yīng)用科技學(xué)院，海南儋州571737）

MADS－box轉(zhuǎn)錄因子在多種植物的發(fā)育過(guò)程、特別是花器官的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。為研究MADS－box轉(zhuǎn)錄因子在芒果花器官發(fā)育中的作用，利用RT－PCR和RACE技術(shù)分離到1個(gè)芒果的SOC1基因，命名為MSOC1（GenBank登錄號(hào)為KP404094）。MSOC1編碼區(qū)為733bp，編碼223個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為25.6kD，理論等電點(diǎn)為8.96。序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，MSOC1具有保守的MADS－box及半保守的K區(qū)，屬于MADS－box家族SOC1／TM3亞家族。組織特異性表達(dá)分析表明，MSOC1基因在芒果各個(gè)組織部位均有表達(dá)，但在莖、葉和花芽中表達(dá)量高，而在根和花中表達(dá)量低。

芒果；MSOC1；克?。槐磉_(dá)

高等植物開(kāi)花受一系列內(nèi)外因素的共同調(diào)控，許多特定基因在特定時(shí)空環(huán)境下表達(dá)及相互作用，以確保植物在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間和地點(diǎn)發(fā)生從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變，從而保證植物在適宜時(shí)間開(kāi)花［1］。開(kāi)花相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控是實(shí)現(xiàn)這一轉(zhuǎn)變過(guò)程的分子基礎(chǔ)，花分生組織特征基因和花器官特征基因絕大多數(shù)都是MASD－box類基因［2］。MASD－box基因是高等植物中一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控和信號(hào)傳導(dǎo)等多個(gè)方面，尤其在花發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1）基因是植物開(kāi)花途徑中控制開(kāi)花時(shí)間的基因，它整合了光周期途徑、春化途徑、自主途徑和赤霉素途徑等誘導(dǎo)開(kāi)花途徑的各種信號(hào)，作用于下游花分生組織特異基因，促進(jìn)植物的營(yíng)養(yǎng)分生組織向花序分生組織轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)植物的開(kāi)花［3］。目前已從擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestivum）、非洲菊（Gerbera hybrida）、甜橙（Citrus sinensis）、大豆（Glycine max）等［4－9］多個(gè)物種中克隆到SOC1基因，研究發(fā)現(xiàn)SOC1基因除了能整合多種開(kāi)花信號(hào)，還具有其他功能，如控制一年生擬南芥的生長(zhǎng)習(xí)性［10］，參與天氣冷涼延遲開(kāi)花、溫暖氣候促進(jìn)開(kāi)花的微調(diào)［11］等。

芒果是重要的熱帶、亞熱帶果樹(shù)，享有“熱帶果王”的盛譽(yù)，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［12］。目前有關(guān)于芒果開(kāi)花機(jī)理的分子生物學(xué)研究較少，眾多與開(kāi)花有關(guān)的基因，如CO、FT、LFY、FLC、AP1等中，僅對(duì)LFY［13］和AP1［14］基因進(jìn)行了一些研究。為克隆新的芒果開(kāi)花有關(guān)的MADS－box基因，研究其在芒果花發(fā)育中的作用，本研究利用RT－PCR和RACE技術(shù)克隆得到1個(gè)芒果開(kāi)花調(diào)控的重要轉(zhuǎn)錄因子SOC1基因的同源基因MSOC1的序列全長(zhǎng)，進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析，并研究分析了MSOC1基因在芒果植株不同組織部位的表達(dá)，以期為從分子水平上認(rèn)識(shí)芒果成花機(jī)理等研究積累資料奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料呂宋芒（Carabao）采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所芒果種質(zhì)資源圃。于2013年年12月15日采收呂宋芒花序，用液氮速凍后，保存在－80℃冰箱中備用，作為提取總RNA的植物材料，用于基因克隆研究。于2014年1月20日分別采收呂宋芒花芽、花以及根、莖、葉等器官，用液氮速凍后，保存在－80℃冰箱保存，用于基因的組織表達(dá)特異性分析。

1.2 MSOC1基因全長(zhǎng)cDNA克隆

1.2.1 總RNA提取及cDNA第一鏈合成 參照改良CTAB法［15］提取呂宋芒花序總RNA。將提取的總RNA取3μL在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD值，計(jì)算RNA濃度和純度。以1.0g總RNA為模板，Oligo（dT）primer為引物，采用TaKaRa PrimeScriptTMRTPCR Kit試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］合成cDNA第一鏈。

1.2.2 芒果MSOC1基因5′－RACE和3′－RACE及全長(zhǎng)的克隆 以本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)簡(jiǎn)并引物進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增得到一個(gè)MADS－box基因的保守片段為依據(jù)，分別設(shè)計(jì)3′－RACE和5′－RACE引物（表1），以上述花序組織反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行3′－RACE和5′－RACE擴(kuò)增。RACE操作參照3′－Full RACE Core Set試劑盒和5′－Full RACE Core Set試劑盒（TaKaRa）推薦的方法進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件為94℃變性5min后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94℃變性45s、55℃退火45s、72℃延伸2min，36個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。

根據(jù)5′－RACE和3′－RACE測(cè)序結(jié)果，將3′－RACE、5′－RACE和已知片段進(jìn)行拼接獲得全長(zhǎng)cDNA序列，根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)特異性引物SOC1－1和SOC1－2（表1），以花序組織反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min、94℃變性30s、55℃退火45 s、72℃延伸1.5min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，切膠回收與PMD18－T載體（Takara）連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物及其序列Table 1 Primers required in PCR amplification

1.3 生物信息學(xué)分析

利用NCBI的BLAST工具進(jìn)行同源分析；利用ORF（Open Reading Frame，ORF）Finder軟件尋找開(kāi)放閱讀框；利用ProtParam軟件（http：／／web.expasy.org／protparam／）分析編碼蛋白的氨基酸序列組成、分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)。采用Ex－PASy ProtParam軟件分析序列等電點(diǎn)。采用ClustalW和Mega軟件進(jìn)行推導(dǎo)氨基酸序列的多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。

1.4 基因表達(dá)特性分析

采用半定量RT－PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MSOC1基因在不同組織（花芽、花、根、莖和葉）的表達(dá)模式。其中，半定量RT－PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，45℃退火45s，72℃延伸90s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)，擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。采用SYBR?GreenⅠ嵌合熒光法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)體系為：10μL SYBR?Premix Ex Taq混合液，正、反向引物各1μL 2μL cDNA，加入ddH2O補(bǔ)足到20μL體系。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性3min；然后95℃5s，60℃30s，共40個(gè)循環(huán)，試驗(yàn)以Actin為內(nèi)參基因，3次重復(fù)，2－△△Ct法［16］計(jì)算不同時(shí)間MSOC1基因相對(duì)表達(dá)量，應(yīng)用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

圖1 芒果MSOC1基因3′－RACE（A），5′－RACE（B）和全長(zhǎng)ORF擴(kuò)增結(jié)果（C）Fig.1 PCR products of 3′－RACE（A），5′－RACE（B）and full length ORF（C）of MSOC1gene M.DL2000

2.1 芒果MSOC1基因克隆與鑒定

以芒果花序cDNA為模板，利用RACE方法分別獲得789bp的3′端片段（圖1，A）和268bp的5′端片段（圖1，B）。將得到的3段序列（中間序列、3′端、5′端序列）在DNAMAN中進(jìn)行序列拼接，根據(jù)拼接序列在ORF兩端設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到MSOC1基因的mRNA全長(zhǎng)ORF序列（圖1， C），測(cè)序結(jié)果顯示，該P(yáng)CR產(chǎn)物長(zhǎng)度為733bp，測(cè)序結(jié)果與拼接序列相應(yīng)片段完全一致。

通過(guò)NCBI的Blastx比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該序列與四季芒（Siji Mangifera indica L.）的SOC1（GenBank登錄號(hào)為ADX97324.1）序列一致性達(dá)99%，其推導(dǎo)的蛋白序列具有MADS＿M(jìn)EF2類保守結(jié)構(gòu)域和K－box結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明所克隆的基因?qū)儆诘湫偷腗ASD－box基因。因此，初步認(rèn)為克隆得到了芒果SOC1基因，將其命名為MSOC1，GenBank登錄號(hào)為KP404094。

2.2 芒果MSOC1全長(zhǎng)cDNA序列及生物信息學(xué)分析

利用NCBI在線工具分析芒果MSOC1的開(kāi)放閱讀框，發(fā)現(xiàn)MSOC1基因編碼區(qū)由669個(gè)核苷酸組成，編碼1個(gè)含有223個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)GA，且含有加尾信號(hào)AATAAA序列和polyA序列（圖2）。通過(guò)NCBI的Blastp比對(duì)發(fā)現(xiàn)，MSOC1基因的3～77位氨基酸為典型的MADS結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，MSOC1基因的第75～170位氨基酸為一個(gè)K－box結(jié)構(gòu)域。利用ExPASy ProtParam軟件分析其理化性質(zhì)，推測(cè)該蛋白的分子式為C1108H1828N332O346S11，相對(duì)分子質(zhì)量為25 689.3，預(yù)測(cè)其等電點(diǎn)（pI）為8.96。蛋白由20個(gè)氨基酸組成，其中負(fù)電荷系數(shù)［（Asp＋Glu）∶35］，正電荷系數(shù)［（Arg＋Lys）∶39］，該蛋白中相對(duì)含量較多的氨基酸是Glu（E）29占13.0%，Leu（L）22占9.9%，Arg（R）21占9.4%，Lys（K）18占8.1%，其中Pyl、Sec含量為0。不穩(wěn)定系數(shù)為65.51，說(shuō)明該蛋白是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白（40以下為穩(wěn)定蛋白）。

將MSOC1基因推導(dǎo)的氨基酸序列和其他物種SOC1蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)（圖3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列與很多植物SOC1蛋白氨基酸序列具有較高的同源性。其中與四季芒（Siji Mangifera indica）SOC1蛋白氨基酸序列相似性最高，達(dá)99%；與荔枝（Litchi chinensis）SOC1蛋白氨基酸序列的相似性為72%；和甜橙（Citrus sinensis）SOC1蛋白氨基酸序列的相似性為74%。MADS－box結(jié)構(gòu)域相似性在83%～100%之間，K－box結(jié)構(gòu)域相似性在51%～65%之間。芒果MSOC1在C端具有一個(gè)SOC1／TM3亞家族特有的基序，說(shuō)明所獲得的MSOC1屬于MADS－box基因家族中的SOC1／TM3亞家族。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)也可以看出（圖4），MSOC1也與四季芒（（ADX97324.1）親緣關(guān)系較近，歸屬于MADS－box基因家族SOC1／TM3亞家族。

圖2 MSOC1基因核苷酸序列和推測(cè)氨基酸序列帶下劃線的堿基序列ATG表示起始密碼子；＊表示終止密碼子TGAFig.2 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of MSOC1 The nucleotide sequence ATG with underlined means initiator codon；TGA with＊means terminator codon

圖3 不同植物SOC1氨基酸序列比對(duì)劃線部分為MADS－box、K－box結(jié)構(gòu)域Fig.3 Alignment of amino acid sequences of SOC1from different plants The MADS－box and F－box are underlined

2.3 芒果MSOC1基因的器官特異表達(dá)分析

用半定量RT－PCR方法分析MSOC1在芒果不同組織的表達(dá)情況，結(jié)果如圖5所示，MSOC1基因在根部、莖部、葉片、花芽和花中均有表達(dá)，但是表達(dá)程度不同。在葉片中表達(dá)強(qiáng)度最高，其次是莖部、花芽和根，花中表達(dá)量最低。

為了進(jìn)一步研究MSOC1在不同組織器官中的相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)行了熒光實(shí)時(shí)定量分析。結(jié)果顯示（圖6）與半定量結(jié)果一致?？梢?jiàn)芒果MSOC1基因具有顯著的組織表達(dá)特異性。尤其在營(yíng)養(yǎng)器官的根、莖和葉中特異表達(dá)，在花芽中也表達(dá)，而花的表達(dá)量最低。

圖4 芒果與其他物種中SOC1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of SOC1in mango and other different species

圖5 MSOC1在芒果不同組織部位的表達(dá)Fig.5 Different expression levels of MSOC1 gene in different organs of M.indica

圖6 MSOC1在芒果不同組織部位的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 The relative expression levels of MSOC1 gene in different organs of M.indica

3 討 論

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，參與調(diào)控植物花器官特征的MADS－box基因研究獲得了突破性的進(jìn)展。其中SOC1作為開(kāi)花時(shí)間調(diào)控路徑的結(jié)點(diǎn)基因，廣泛存在于單子葉植物和雙子葉植物中［17］。SOC1整合了多條開(kāi)花途徑的開(kāi)花信號(hào)，不僅可調(diào)控開(kāi)花時(shí)間，而且也能參與花器官形態(tài)建成［18］。Becker等［19］認(rèn)為SOC1主要在營(yíng)養(yǎng)器官中表達(dá)，在營(yíng)養(yǎng)器官發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變也起重要的作用。在擬南芥中SOC1在各個(gè)部位均表達(dá)，在莖尖中表達(dá)量最高，其表達(dá)量隨著營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的進(jìn)程而增加，在成花轉(zhuǎn)變時(shí)表達(dá)量大量增加，與下游花分生組織特異基因共同作用完成成花轉(zhuǎn)變［20］。

本研究通過(guò)RT－PCR和RACE技術(shù)克隆得到芒果MSOC1基因，并對(duì)其亞家族的分屬和表達(dá)模式進(jìn)行了分析。其推導(dǎo)的蛋白序列具有MADS＿M(jìn)EF2類保守結(jié)構(gòu)域和K－box結(jié)構(gòu)域，屬于典型的MASD－box基因，在其C端具有一個(gè)SOC1／TM3亞家族特有的基序，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析將其屬于MADS－box基因家族中的SOC1／TM3亞家族。對(duì)MSOC1進(jìn)行不同組織部位的表達(dá)分析表明，該基因在根、莖、葉、花和早期花芽中均有表達(dá)，且在根中表達(dá)水平較低，在葉片和莖中表達(dá)較高，花芽的表達(dá)量比葉片和莖稍低。在擬南芥中，SOC1基因是調(diào)控植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的重要基因［20］，由此推測(cè)芒果MSOC1基因可能調(diào)控芒果花芽分化前期的表達(dá)，在芒果營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變過(guò)程中起著重要作用。

SOC1整合了多條開(kāi)花途徑的開(kāi)花信號(hào)，調(diào)控花分生組織的建成。目前人們對(duì)模式植物擬南芥SOC1已經(jīng)有了比較廣泛和深入的研究，但是仍然有許多問(wèn)題沒(méi)有研究清楚，本研究得到MSOC1基因，為進(jìn)一步深入研究基因表達(dá)模式和功能奠定了基礎(chǔ)。下一步將構(gòu)建MSOC1植物表達(dá)載體，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究，以期在分子水平上揭示MSOC1基因在芒果調(diào)控營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變過(guò)程中的分子機(jī)制和作用機(jī)理。

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（編輯：宋亞珍）

Cloning and Expression Analysis of MSOC1 Gene in Mango（Mangifera indica L.）

WEI Junya1，TANG Jie2，LIU Guoyin3，LIU Debing3＊，CHEN Yeyuan1
（1Tropical Crops Genetic Resources Institute／Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences，Danzhou，Hainan 571737，China；2Agriculture College，Hainan University，Haikou 570228，China；3Applied Science and Technology College，Hainan University，Danzhou，Hainan 571737，China）

MADS－box transcription factor plays a crucial role in plant development，especially controlling the formation and development of floral organs.In order to investigate the role of MADS－box transcription factor in mango flower development，we cloned the flower－specific gene from mango inflorescence，named MSOC1（GeneBank accession no.KP404094）with homology－based cloning and RACE method.The open reading frame of MSOC1was 733bps，encoding 223amino acids with molecular weight 25.6kD and isoelectric point 8.96.Sequence alignment and phylogenetic tree analysis indicated that the MSOC1deduced protein contained a conservative MADS－box and semi－conservative K domain and belonged to the SOC1／TM3subfamily of the MADS－box family.Tissue－specific analysis showed that MSOC1was expressed in various tissues of mango，high expression in stems，leaves and inflorescences，low expression in roots and flowers.

mango；MSOC1gene；clone；gene expression

Q785；Q786

A

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.06.1092

1000－4025（2015）06－1092－06

2015－02－02；修改稿收到日期：2015－04－17

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201203092）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（1630032012026）；海南大學(xué)應(yīng)用科技學(xué)院基金（HYK1402）；海南省應(yīng)用技術(shù)研發(fā)與示范推廣專項(xiàng)（ZDXM2015016）

魏軍亞（1974－），女，博士，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E－mail：junyawei＠126.com

＊通信作者：劉德兵，博士，副教授，主要從事果樹(shù)生物技術(shù)研究。E－mail：ldebing＠126.com