華南象草PpCAD基因的亞細(xì)胞定位及其在轉(zhuǎn)基因煙草中的異源表達(dá)

唐 然，張博雅，彭小群，張向前，江 院，解新明

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，廣東省草業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣州510642）

華南象草PpCAD基因的亞細(xì)胞定位及其在轉(zhuǎn)基因煙草中的異源表達(dá)

唐 然，張博雅，彭小群，張向前，江 院，解新明＊

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，廣東省草業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣州510642）

該研究根據(jù)已克隆的華南象草（Pennisetum purpureumcv.Huanan）肉桂醇脫氫酶（CAD）基因PpCAD的cDNA序列，構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體pAN580－PpCAD，用PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化象草原生質(zhì)體，以探究PpCAD蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位；同時(shí)構(gòu)建植物過(guò)表達(dá)載體pBA002－PpCAD，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在煙草中異源表達(dá)，以研究PpCAD基因與植物木質(zhì)素合成的關(guān)系。結(jié)果顯示：（1）PpCAD定位在象草原生質(zhì)體的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；（2）過(guò)表達(dá)載體pBA002－PpCAD轉(zhuǎn)化煙草后獲得27株轉(zhuǎn)基因煙草，其中25株P(guān)CR鑒定為陽(yáng)性；（3）半定量RT－PCR檢測(cè)6株轉(zhuǎn)基因煙草后發(fā)現(xiàn)，PpCAD基因在不同植株的表達(dá)量存在差異，通過(guò)Southern雜交檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)該差異與目的基因插入的拷貝數(shù)有關(guān)；（4）6株轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草表型上沒(méi)有明顯差異，除目的基因多拷貝插入的植株OEC6外，木質(zhì)素含量有不同程度的提高，最高比野生型提高了56.50%。研究表明，PpCAD是一個(gè)細(xì)胞質(zhì)蛋白，在煙草中過(guò)表達(dá)PpCAD能夠提高植株木質(zhì)素含量，表明PpCAD基因參與了植物的木質(zhì)素合成，可用于象草的木質(zhì)素調(diào)控研究。

華南象草；木質(zhì)素；PpCAD；亞細(xì)胞定位；遺傳轉(zhuǎn)化；煙草

木質(zhì)素是一種復(fù)雜的三維高分子化合物，由松柏醇、芥子醇和香豆醇3種單體聚合而成，與植物的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)［1－2］，在維持植株機(jī)械強(qiáng)度，保證水分和營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸，提高生物與非生物脅迫方面起到重要的作用［3－4］。但是，由于木質(zhì)素主要沉積于導(dǎo)管細(xì)胞和維管束間的纖維細(xì)胞中，且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難于降解，在造紙工業(yè)中會(huì)造成大量的能源浪費(fèi)和環(huán)境污染［5］。同時(shí)，木質(zhì)素的存在還制約著木質(zhì)纖維生物質(zhì)乙醇的轉(zhuǎn)化，并且降低牧草的干物質(zhì)消化率［6－7］。所以，植物木質(zhì)素的調(diào)控研究成為熱點(diǎn)。

肉桂醇脫氫酶（CAD，EC 1.1.1.195）是木質(zhì)素合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶，催化木質(zhì)素單體形成的最后一步，并將醛類化合物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇類［8－9］。CAD基因在植物體內(nèi)以多基因家族的形式存在，通常將控制木質(zhì)素合成的CAD基因稱為Bona－fide CAD，而將其同系物稱為CAD－like基因［9－10］。如水稻（Oryza sativa）的CAD基因家族中有12個(gè)成員，而B(niǎo)ona－fide CAD基因只有1個(gè)，即OsCAD2。OsCAD7與水稻植株的莖稈強(qiáng)度有關(guān)，是唯一驗(yàn)證了功能的水稻CAD－like基因，而大多數(shù)CAD－like基因的功能未知［11－12］。所以，在對(duì)CAD基因進(jìn)行調(diào)控的研究前，必須對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證，這也是培育木質(zhì)化改良新品系的必經(jīng)之路。如今，在一些物種中已經(jīng)進(jìn)行了Bona－fide CAD的調(diào)控研究，如下調(diào)楊樹(shù)（Populus tremula×Populus alba）的CAD基因提高了木質(zhì)素高聚物中醛基單元的組分，簡(jiǎn)化了預(yù)處理?xiàng)l件，降低了造紙成本［13］；沉默柳枝稷（Panicum virgatum）CAD基因降低了植株木質(zhì)素含量，改變了木質(zhì)素組分，并提高了糖化效率［14］；而作為牧草的紫花苜蓿（Medicago sativa）在CAD基因下調(diào)后干物質(zhì)消化率明顯提高［15］。降低植物木質(zhì)素含量的轉(zhuǎn)基因研究一直在進(jìn)行中，但是關(guān)于CAD基因調(diào)控的研究卻很少，特別是在單子葉植物中［16－17］。

象草（Pennisetum purpureum）是一種優(yōu)良的C4禾本科牧草，廣泛種植于熱帶與亞熱帶地區(qū)［18］。由于其具有較好的適口性和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，已成為中國(guó)華南地區(qū)的重要牧草之一［19］。除此之外，因其產(chǎn)量高、生物量大、抗逆性強(qiáng)、熱值高等特點(diǎn)，也常被用作造紙?jiān)虾湍茉醋魑铮?0－21］。所以，木質(zhì)素的含量及組分成為制約象草開(kāi)發(fā)與利用的重要因素。如今，控制華南象草（P.purpureumcv.Huanan）木質(zhì)素合成的PpCAD基因［9］、Pp4CL（4－香豆酰輔酶A連接酶）基因［22］和PpCCR（肉桂酰輔酶A還原酶）基因［23］已成功克隆并經(jīng)過(guò)了生物信息學(xué)分析，但都缺乏體內(nèi)及體外的表達(dá)分析研究。

本研究構(gòu)建PpCAD基因亞細(xì)胞定位載體和植物表達(dá)載體，分別以華南象草原生質(zhì)體和煙草（Nicotiana tabacum）作為轉(zhuǎn)化媒介，研究PpCAD蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布，以及PpCAD基因在煙草中異源表達(dá)后植株木質(zhì)素含量的變化，以驗(yàn)證Pp－CAD與木質(zhì)素合成的關(guān)系，為象草的木質(zhì)化改良研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試材料為華南象草（P.purpureumcv.Huanan），種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草引種園。煙草（Nicotiana tabacum）組培苗K326、根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105、大腸桿菌（Escherichia coli）Top10、植物表達(dá)載體pBA002－3 ×HA、亞細(xì)胞定位載體pAN580和pUTL2－mCherry由本實(shí)驗(yàn)室保存。其中，pBA002－3×HA的植物篩選標(biāo)記為Bar基因。pAN580和pUTL2－mCherry分別帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）報(bào)告基因和紅色熒光蛋白（mCherry）報(bào)告基因。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

采用TransZolUpTM試劑盒（北京全式金生物科技有限公司）提取華南象草幼葉總RNA，通過(guò)1%（W／V）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，并用微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度與濃度。參照TransScript First－strand cDNA Synthesis Super MIX（北京全式金生物科技有限公司）使用說(shuō)明書，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈。

1.3 載體構(gòu)建

根據(jù)已克隆的華南象草PpCAD基因cDNA序列（GeneBank登錄號(hào)為HQ840705）［9］，設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物Pp－Spe－F與Pp－Sma－R、Pp－Xba－F與Pp－Bam－R，分別帶有SpeⅠ／SmaⅠ和XbaⅠ／BamHⅠ兩組限制性酶切位點(diǎn)（引物序列見(jiàn)表1，下同）。以T／A克隆載體pMD19－T－PpCAD為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Pp－Spe－F與Pp－Sma－R引物組的擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，與亞細(xì)胞定位載體pAN580經(jīng)SpeⅠ和SmaⅠ雙酶切后連接；Pp－Xba－F與Pp－Bam－R引物組的擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，與植物表達(dá)載體pBA002－3×HA經(jīng)XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切后連接。2組連接產(chǎn)物經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，挑選單菌落進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，挑選陽(yáng)性菌落擴(kuò)繁后提取質(zhì)粒并送測(cè)序。2個(gè)載體的表達(dá)均由煙草花葉病毒啟動(dòng)子（CaMV 35S）啟動(dòng)。構(gòu)建的表達(dá)載體分別命名為pAN580－PpCAD和pBA002－Pp－CAD。

1.4 華南象草PpCAD基因的亞細(xì)胞定位

1.4.1 原生質(zhì)體的分離與純化 華南象草原生質(zhì)體的分離與純化參照水稻原生質(zhì)體分離與純化方法［24］并有改良。取生長(zhǎng)12d的華南象草幼苗，在4℃條件下避光處理16h，以幼苗第1片葉鞘上、下5 cm的幼嫩部位作為原生質(zhì)體分離材料。稱取0.5g葉鞘，用手術(shù)刀片切成0.5mm細(xì)段并轉(zhuǎn)入0.6 mol／L甘露醇中浸泡30min；將材料移入10mL酶解液中，在28℃、遮光條件下50r／min震蕩酶解4 h。酶解液組分為：1.5%（W／V）纖維素酶R－10（Yakult，Japan）、0.75%離析酶（W／V）R－10（Yakult， Japan）、0.5mol／L甘露醇、10mmol／L MES［2－（N－嗎啉）乙磺酸（pH 5.8）］、10mmol／L CaCl2和0.1%牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）。酶解結(jié)束后用200目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾酶解產(chǎn)物混合液，殘?jiān)?0mL預(yù)冷的W5溶液（154mmol／L NaCl，125mmol／L CaCl2，5mmol／L KCl，2mmol／L MES，pH 5.7）沖洗后進(jìn)行第2次過(guò)濾；濾液于300 r／min離心5min后吸出上清，加入2mL預(yù)冷的W5溶液，輕懸沉淀，150r／min離心2min，移去上清后再用2mL預(yù)冷的W5溶液重復(fù)洗滌2～3次；洗好的沉淀用500μL W5溶液懸浮，得到純化的原生質(zhì)體。

表1 PCR所用引物Table 1 PCR primers

1.4.2 原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化采用PEG介導(dǎo)法。150r／min離心2min收集純化好的原生質(zhì)體后用MMg溶液（0.5mol／L甘露醇，15 mmol／L MgCl2，2mmol／L MES，pH 5.7）重懸，使原生質(zhì)體終濃度達(dá)2×106個(gè)／mL。取20μL構(gòu)建好的pAN580－PpCAD重組質(zhì)粒（10ng）加入100 μL原生質(zhì)體細(xì)胞中，混勻后加入10μL新鮮制備的PEG（polyethylene glycol，PEG）溶液［40%（W／V）PEG 4000，0.2mol／L甘露醇，100mmol／L CaCl2］，輕彈混勻，28℃黑暗孵育15min。同時(shí)，為了增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，以空載體pUTL2－mCherry為對(duì)照，將其與重組質(zhì)粒pAN580－PpCAD共轉(zhuǎn)化象草原生質(zhì)體。在共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，將2個(gè)質(zhì)粒等質(zhì)量混合（總濃度10～15ng），并加入到100μL原生質(zhì)體細(xì)胞中。孵育完成后，加入1mL W5溶液，小心顛倒混勻以終止反應(yīng)。150r／min離心5min后移去上清，用1mL WI溶液（0.5mol／L甘露醇，20 mmol／L KCl，4mmol／L MES，pH 5.7）重懸，28℃黑暗中靜置培養(yǎng)過(guò)夜（12～16h）。孵育完成后，300 r／min離心5min收集細(xì)胞，用約50μL WI溶液重懸后進(jìn)行顯微觀察。

1.4.3 顯微拍照 EGFP和mCherry的激發(fā)波長(zhǎng)（最大吸收峰）分別為488和587nm，發(fā)射波長(zhǎng)（最大發(fā)射峰）分別為511和610nm。轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體使用蔡司激光掃描共聚焦顯微鏡7DUO（Zeiss LSCM 780＆7Live）進(jìn)行觀察和拍照，并用Zen 2012軟件進(jìn)行進(jìn)行圖片處理。

1.5 華南象草PpCAD基因在煙草中的異源表達(dá)

1.5.1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 利用凍融法，將含有PpCAD基因的植物表達(dá)載體pBA002－PpCAD轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)，鋪板后挑單菌落進(jìn)行PCR鑒定。選擇陽(yáng)性單菌落擴(kuò)繁作為農(nóng)桿菌侵染的種質(zhì)液。

1.5.2 煙草遺傳轉(zhuǎn)化 根據(jù)改良的葉盤法進(jìn)行煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。選擇健康的煙草組培苗，無(wú)菌條件下剪取葉片，剔除葉脈后切成0.5cm×0.5cm小塊，并接種于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基MS－P（MS＋0.5mg／L 6－BA＋0.1mg／L NAA）中預(yù)培養(yǎng)3d。將含有pBA002－PpCAD載體的EHA105種質(zhì)液，以1∶100比例擴(kuò)繁至OD600為0.4～0.5，5 000r／min離心5min，收集菌體后用不含蔗糖的1／2MS培養(yǎng)基重懸，使OD600為0.1～0.2。煙草葉片結(jié)束預(yù)培養(yǎng)后將其浸沒(méi)于重懸液中，每5min晃動(dòng)1次，15 min后取出葉片，吸干多余菌液，于MS－P培養(yǎng)基中黑暗下共培養(yǎng)48h。將共培養(yǎng)后的葉盤轉(zhuǎn)入無(wú)菌水中清洗5min，再轉(zhuǎn)入含500mg／L Cef的無(wú)菌水中清洗10min，再用無(wú)菌水清洗葉盤3～4次，盡可能去除葉盤表面農(nóng)桿菌。用無(wú)菌濾紙吸干葉盤表面水分，轉(zhuǎn)入MS－S培養(yǎng)基（MS＋0.5mg／L 6－BA＋0.1mg／L NAA＋5mg／L Basta＋200mg／L Cef＋200mg／L Car）中進(jìn)行篩選及分化培養(yǎng)。每2周用MS－S培養(yǎng)基繼代1次，待分化后的煙草無(wú)菌苗生長(zhǎng)至3cm時(shí)，轉(zhuǎn)入MS－R（MS＋0.2mg／L NAA＋100mg／L Timetin）培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)。待根系長(zhǎng)成后移栽至溫室，種植土壤為植物營(yíng)養(yǎng)土，購(gòu)自廣州市榮豐園藝公司，種植前將營(yíng)養(yǎng)土、蛭石、河沙以8∶1∶1比例混合，并以500g／盆進(jìn)行分配。分化、生根及移栽后的植物培養(yǎng)條件均為25℃、16h光／8h暗培養(yǎng)。

1.5.3 PCR擴(kuò)增和Southern雜交 采用新型植物基因組DNA試劑盒（康為世紀(jì)）提取煙草成熟葉片DNA，并用位于載體插入位點(diǎn)兩端序列的引物PBA－F和PBA－R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，野生型植株為陰性對(duì)照，含有目的片段的質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，反應(yīng)體系為：2×Taq MasterMix（康為世紀(jì)）10μL，10 μmol／L引物PBA－F／PBA－R各0.5μL，DNA模板1μL，ddH2O 8μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃孵育10min。轉(zhuǎn)基因煙草成熟葉片總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄方法同1.2，RT－PCR以cDNA為模板，采用載體上的Bar基因進(jìn)行引物BAR－F／BAR－R檢測(cè)，并以看家基因Actin引物Actin－F／Actin－R擴(kuò)增作為內(nèi)參。PCR反應(yīng)體系中各組分用量以及PCR反應(yīng)程序與上述相同。Southern雜交通過(guò)地高辛標(biāo)記檢測(cè)試劑盒Ⅱ（Roche）進(jìn)行，大量提取轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ酶切24h，DNA模板量為15μg，并以40ng質(zhì)粒pBA002－PpCAD經(jīng)XbaⅠ酶切后作為對(duì)照。用Bar基因標(biāo)記探針，Southern雜交中，探針的標(biāo)記、電泳、轉(zhuǎn)膜、預(yù)雜交、雜交與顯影等步驟均按照說(shuō)明書的步驟進(jìn)行。

1.5.4 木質(zhì)素含量測(cè)定 待轉(zhuǎn)基因煙草移栽3個(gè)月后，利用溴乙酰法［25］測(cè)定莖桿木質(zhì)素總含量。稱取1g新鮮樣品，用5mL 95%乙醇研磨粉碎，5 000 r／min離心30min。去除上清，用95%乙醇清洗沉淀3次，再用乙醇∶正己烷（1∶2）清洗沉淀3次。將清洗后的沉淀置于烘箱中烘干至恒重。取3mg烘干樣品放入小錐形瓶中，加入5mL 25%（V／V）AcBr（溶于冰醋酸中）提取液于恒溫水浴鍋中，用玻璃片蓋住瓶口，70℃振動(dòng)孵育30min。將液體（約4mL）轉(zhuǎn)入10mL容量瓶，依次加入0.9mL 2mol／L NaOH、5mL冰醋酸、0.1mL 7.5mol／L鹽酸羥胺，定容至10mL。2 000r／min離心7min，吸取上清測(cè)定OD280值。根據(jù)樣品的OD280，利用木質(zhì)素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求得樣品木質(zhì)素的濃度（mg／L），并計(jì)算樣品木質(zhì)素重量。木質(zhì)素總含量＝木質(zhì)素重量／干燥樣品重量（%），實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。數(shù)據(jù)利用Excel 2013軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，并用SPSS 17.0進(jìn)行鄧肯式新復(fù)極差法（DMRT）多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體構(gòu)建與鑒定

以pMD19－T－PpCAD為模板，經(jīng)引物組Pp－Spe－F與Pp－Sma－R擴(kuò)增，得到含有起始密碼子和終止密碼子的PpCAD片段，大小約1.1kb（圖1）。該目的片段經(jīng)過(guò)SpeⅠ和SmaⅠ雙酶切后，與亞細(xì)胞定位載體pAN580連接，得到重組質(zhì)粒pAN580－PpCAD，經(jīng)酶切驗(yàn)證，PpCAD片段成功連接到載體（圖1）。同樣，以pMD19－T－PpCAD為模板，經(jīng)引物組Pp－Xba－F與Pp－Bam－R擴(kuò)增后得到約1.1 kb產(chǎn)物，與植物表達(dá)載體pBA002－3×HA相連（圖1），用XbaⅠ和BamHⅠ對(duì)重組質(zhì)粒pBA002－Pp－CAD進(jìn)行雙酶切，能夠切出約1.1kb目的片段（圖1）。最終經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，得到含有目的片段PpCAD的2個(gè)載體。

圖1 目的片段PpCAD的克隆與載體構(gòu)建后的雙酶切鑒定M.DL2000；1.含有酶切位點(diǎn)SpeⅠ和SmaⅠ的PpCAD基因目的片段；2.含有酶切位點(diǎn)XbaⅠ和BamHⅠ的PpCAD基因目的片段；3.pAN580－PpCAD雙酶切鑒定；4.pBA002－PpCAD雙酶切鑒定Fig.1 Cloning of target fragment PpCADand enzyme digestion identification after vector construction M.DL2000；1.Target fragment of PpCADharboring SpeⅠand SmaⅠrestriction sites；2.Target fragment of PpCADharboring XbaⅠand BamHⅠrestriction sites；3.Restriction digestion of pAN580－PpCAD；4.Restriction digestion of pBA002－PpCAD

圖2 PpCAD蛋白的亞細(xì)胞定位A.pAN580－PpCAD在象草原生質(zhì)體的瞬時(shí)表達(dá)；B.pAN580－PpCAD和pUTL2－mCherry在象草原生質(zhì)體的共轉(zhuǎn)化；GFP.綠色熒光蛋白信號(hào)；Chlorophyll.葉綠體自發(fā)熒光；mCherry.紅色熒光蛋白信號(hào)；Bright.明場(chǎng)；Merged.左邊所有圖片的疊加Fig.2 Subcellular localization of PpCAD protein A.Transient expression of pAN580－PpCADin P.purpureumprotoplasts；B.Co－expression of pAN580－PpCAD and pUTL2－mCherry in P.purpureumprotoplasts；GFP.Signal of green fluorescent protein；Chlorophyll.Chlorophyll autofluorescence；mCherry.Signal of red fluorescent protein；Bright.Bright field；Merged.Overlapping of all left photos

2.2 PpCAD基因亞細(xì)胞定位

以PEG介導(dǎo)法將含有EGFP綠色熒光蛋白報(bào)告基因的pAN580－PpCAD轉(zhuǎn)化到華南象草原生質(zhì)體中，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察，葉綠體自發(fā)熒光為參照，發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體細(xì)胞質(zhì)中有綠色熒光信號(hào)（圖2，A），表明PpCAD蛋白可能定位在細(xì)胞質(zhì)中。為進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果，將帶有紅色熒光蛋白mCherry的pUTL 2－mCherry空載體和pAN580－PpCAD同時(shí)轉(zhuǎn)化到華南象草原生質(zhì)體中，在共轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞中檢測(cè)到大面積紅色熒光信號(hào)，但是綠色熒光信號(hào)只在除了細(xì)胞膜和葉綠體的部分檢測(cè)到（圖2，B），說(shuō)明PpCAD是細(xì)胞質(zhì)蛋白。

2.3 PpCAD基因在煙草中的過(guò)表達(dá)

2.3.1 轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測(cè) 本研究共得到27株轉(zhuǎn)基因煙草植株，移栽4周后，提取成熟葉片DNA，并用位于載體插入位點(diǎn)兩端引物PBA－F和PBA－R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明（圖3），27株轉(zhuǎn)基因煙草中除了OEC8和OEC21外，其余25株都能擴(kuò)增出與對(duì)照大小相同的片段，但是OEC1、OEC2、OEC3、OEC14、OEC17、OEC24和OEC27的擴(kuò)增條帶豐度較低，可能是由于含有目的基因的農(nóng)桿菌以內(nèi)生菌的形式存在于煙草植株內(nèi)造成的假陽(yáng)性現(xiàn)象，也可能是因?yàn)镈NA模板濃度較低造成。除此之外的18個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草DNA都能擴(kuò)增出期望大小的目的條帶，而野生型WT不能擴(kuò)增出條帶，證明PpCAD基因整合到了煙草基因組中。

2.3.2 轉(zhuǎn)基因煙草RT－PCR和Southern雜交檢測(cè)挑選6個(gè)PCR陽(yáng)性植株OEC4、OEC6、OEC12、OEC15、OEC16和OEC25進(jìn)行RT－PCR檢測(cè)，在轉(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中目的基因的表達(dá)量，并以看家基因Actin作為內(nèi)參，分析目的基因在不同轉(zhuǎn)基因植株之間表達(dá)水平的差異。RT－PCR鑒定結(jié)果（圖4，A）顯示，OEC6反轉(zhuǎn)錄不能擴(kuò)增出目的條帶，而OEC12條帶豐度最高，說(shuō)明該植株的目的基因表達(dá)水平最高。同理，OEC25表達(dá)水平最低，而OEC4、OEC15、OEC16都有目的基因的表達(dá)，但表達(dá)水平略低于OEC12。用Bar基因探針對(duì)該6個(gè)植株進(jìn)行Southern雜交后發(fā)現(xiàn)（圖4，B），所有煙草植株都能雜交出目的條帶，進(jìn)一步證明目的基因存在于轉(zhuǎn)基因煙草中。其中，OEC4、OEC12、OEC15和OEC16只有1條雜交帶，說(shuō)明目的基因以單拷貝的形式整合進(jìn)煙草基因組中；而OEC6有4個(gè)雜交帶，OEC25有2個(gè)雜交帶，說(shuō)明目的基因在這2個(gè)煙草植株中以多拷貝的形式存在。結(jié)合RT－PCR結(jié)果，OEC6沒(méi)有目的基因表達(dá)和OEC25表達(dá)量低的原因可能是由于目的基因的多拷貝插入。

圖3 轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR檢測(cè)M.DL2000；OEC1～OEC27.轉(zhuǎn)基因煙草植株1～27；WT.野生型植株（陰性對(duì)照）；CK＋.pBA002－PpCAD質(zhì)粒（陽(yáng)性對(duì)照）；下同F(xiàn)ig.3 PCR assays of N.tabacumtransgenic plantsM.DL2000；OEC1－OEC27.N.tabacumtransgenic plants No.1－27；WT.Wild type（Negative control）；CK＋.Plasmid of pBA002－PpCAD（Positive control）；The same as below

圖4 轉(zhuǎn)基因煙草植株RT－PCR（A）和Southern雜交檢測(cè)（B）A.轉(zhuǎn)基因植株RT－PCR檢測(cè)；B.轉(zhuǎn)基因植株Southern雜交：a～j.Southern雜交條帶Fig.4 RT－PCR assays（A）and Southern blot（B）of N.tabacumtransgenic plants A.RT－PCR assays of transgenic plants；B.Southern blot of transgenic plants：a～j.Hybridization fragments of Southern blotting

2.3.3 轉(zhuǎn)基因煙草木質(zhì)素含量測(cè)定 6個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草植株的形態(tài)與對(duì)照相比沒(méi)有明顯差異（圖5，A），說(shuō)明在煙草中過(guò)表達(dá)PpCAD不影響植株表型。測(cè)定該6個(gè)植株莖稈木質(zhì)素含量（圖5，B），OEC15木質(zhì)素含量最高，占樣品干重31.17%，比野生型植株木質(zhì)素含量（19.19%）提高了57.50%，且差異顯著（P＜0.05）；OEC4、OEC12、OEC16和OEC25木質(zhì)素含量與對(duì)照相比也有不同程度的提高，分別提高了45.32%、28.34%、35.79%和45.07%。但是，OEC6木質(zhì)素含量只占樣品干重18.97%，與對(duì)照相比差異不顯著。結(jié)合RT－PCR和Southern雜交結(jié)果，推斷可能是OEC6中Pp－CAD基因的多拷貝抑制表達(dá)而造成的。以上結(jié)果表明，PpCAD基因在煙草中的過(guò)量表達(dá)會(huì)在一定程度上提高植株木質(zhì)素含量，也表明了PpCAD基因參與了植物木質(zhì)素的合成。

圖5 轉(zhuǎn)基因煙草表型（A）與木質(zhì)素含量測(cè)定（B）A.轉(zhuǎn)基因煙草表型；B.溴乙酰法木質(zhì)素含量測(cè)定，數(shù)據(jù)為木質(zhì)素含量平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；數(shù)值后不同小寫字母表示材料間差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）Fig.5 Phenotypes of N.tabacumtransgenic plants（A）and determination of lignin content（B）A.Photos of N.tabacumtransgenic plants；B.Lignin content determined by acetyl bromide method；All data were the mean values of lignin content±standard error；Different letters after the numbers denote that the difference is significance among materials（P＜0.05）

3 討 論

3.1 PpCAD蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)

通過(guò)原生質(zhì)體為受體的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，能夠快速高效分析基因在植物細(xì)胞水平的表達(dá)特性，對(duì)蛋白質(zhì)定位、蛋白質(zhì)互作以及蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)變化分析有十分重要的意義［24］。蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位是理解植物的形態(tài)建成和生長(zhǎng)發(fā)育的主要手段之一，同時(shí)也是功能基因組學(xué)的重要內(nèi)容［26］。在本研究中，PpCAD蛋白與GFP組成的融合蛋白定位在原生質(zhì)體細(xì)胞質(zhì)中，說(shuō)明PpCAD是一個(gè)細(xì)胞質(zhì)蛋白。通常情況下，植物基因的定位信息存在于自身編碼的某段氨基酸序列中，蛋白合成后再由精確的導(dǎo)向機(jī)制定位到細(xì)胞的特定位置［27］。PpCAD蛋白通過(guò)分子生物學(xué)預(yù)測(cè)后推斷是一個(gè)沒(méi)有定向序列的非分泌蛋白，而且預(yù)測(cè)定位于細(xì)胞質(zhì)中［9］，與本研究實(shí)際定位結(jié)果一致。但在孝順竹（Bambusa multiplex）的亞細(xì)胞定位研究中卻發(fā)現(xiàn)CAD蛋白只定位于洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞核中［28］，這可能是因物種差異造成的。同時(shí)，孝順竹的CAD蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞表達(dá)，屬于異源表達(dá)，而PpCAD蛋白的轉(zhuǎn)化受體就是象草的原生質(zhì)體，這可能也是造成定位差異的原因。

3.2 PpCAD基因在煙草中過(guò)表達(dá)提高了植株木質(zhì)素含量

在煙草的遺傳轉(zhuǎn)化研究中，共得到了27株轉(zhuǎn)基因煙草，其中25株為PCR鑒定的含有目的片段PpCAD的陽(yáng)性植株，并選6株生長(zhǎng)一致的煙草進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。半定量RT－PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該6個(gè)植株P(guān)pCAD基因在葉片中的表達(dá)量有明顯差異，Southern雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)目的基因?yàn)槎嗫截惒迦霑r(shí)基因幾乎不表達(dá)（如OEC6）。而當(dāng)插入片段為單拷貝時(shí)，目的基因表達(dá)量較高（如OEC12），這也進(jìn)一步證實(shí)了在轉(zhuǎn)基因研究中基因多拷貝插入造成的沉默現(xiàn)象［29］。一般認(rèn)為，轉(zhuǎn)基因植株中目的基因的插入拷貝數(shù)和基因表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)［30］，本研究結(jié)論與之相同。

在本研究中，PpCAD基因在煙草中的過(guò)表達(dá)沒(méi)有造成植株的表型變化，這與前人研究結(jié)果一致［31］。通過(guò)溴乙酰法測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)素含量后發(fā)現(xiàn)，RT－PCR檢測(cè)PpCAD基因表達(dá)的植株中，木質(zhì)素含量有不同程度提高。其中，OEC15植株莖桿木質(zhì)素含量最高，比野生型提高了57.50%，最低的OEC12植株也提高了28.34%。孝順竹CAD基因在水稻中過(guò)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，所有轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)素含量平均增幅達(dá)50%［28］，與本研究結(jié)果類似。但是，臘梅（Chimonanthus praecox）CAD基因在煙草中過(guò)表達(dá)后，木質(zhì)素含量最高只比對(duì)照提高了18.80%［31］。同樣，銀合歡（Leucaena leucocephala）CAD基因轉(zhuǎn)化煙草后，木質(zhì)素含量最高只提高了7.43%［32］。造成這種差異的原因有很多，首先，這與木質(zhì)素的測(cè)定方法和測(cè)定時(shí)期有關(guān)［33］；其次，木質(zhì)素合成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，植物不同組織、器官和細(xì)胞內(nèi)存在一個(gè)復(fù)雜而完善的代謝網(wǎng)絡(luò)，且代謝的補(bǔ)償機(jī)制不同［34］；最后，可能是由于單子葉和雙子葉植物CAD基因?qū)δ举|(zhì)素合成的貢獻(xiàn)差異造成的［10］，象草和孝順竹同屬于單子葉植物，而臘梅和迎合歡屬于雙子葉植物。當(dāng)然，具體原因需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

Bona－fide CAD基因被認(rèn)為直接參與了木質(zhì)素的合成，先前的生物信息學(xué)分析推斷PpCAD基因是一個(gè)Bona－fide CAD基因［9］，本研究進(jìn)一步證明了PpCAD確實(shí)與植物的木質(zhì)素合成有關(guān)，說(shuō)明PpCAD基因可以用于培育象草木質(zhì)化改良新品種的研究。但是，CAD基因家族成員眾多，而大部分CAD－like基因的功能未知［8，10］。有研究表明部分CAD－like基因在Bona－fide CAD基因缺失后表達(dá)量上調(diào)，補(bǔ)償了木質(zhì)素合成的功能，說(shuō)明某些CAD－like基因可能也參與了木質(zhì)素的合成［35］。所以，在進(jìn)行木質(zhì)素下調(diào)研究時(shí)，最好能夠分析CAD基因家族中各成員的功能與關(guān)系，這樣才能達(dá)到有效調(diào)控木質(zhì)素合成的目的。

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（編輯：宋亞珍）

Subcellular Localization of PpCADfrom Elephant Grass（Pennisetum purpureumcv.Huanan）and Its Heterologous Expression in Transgenic Tobacco

TANG Ran，ZHANG Boya，PENG Xiaoqun，ZHANG Xiangqian，JIANG Yuan，XIE Xinming＊
（College of Forestry and Landscape Architecture，South China Agricultural University，Guangdong Engineering Research Center of Grassland Science，Guangzhou 510642，China）

In the present study，a vector of pAN580－PpCADwas constructed based on the cDNA sequence of PpCADgene from elephant grass（Pennisetum purpureumcv.Huanan），and transformed to elephant grass protoplasts by PEG－mediated method，attempting to figure out the subcellular localization of PpCAD protein.At the same time，the sense vector pBA002－PpCADwas constucted and overexpressed in tobacco by Agrobacterium－mediated method，aiming to study the relationship between PpCADand plant lignin biosynthesis.The results showed that：（1）PpCAD was located in the cytoplasm of elephant grass protoplasts.（2）27transgenic tobacco plants were obtained after transformed with overexpression vector pBA002－Pp－CAD，of which，25plants were identified positive by PCR.（3）The expression levels of 6transgenic plants were different after analyzed by semiquantitative RT－PCR.The Southern blot indicated the expression level was related to the insert copy number of target gene.（4）There was no obvious phenotype difference be－tween PpCADoverexpressed plants and wild type，but the lignin contents were increased in varying degrees among 6transgenic plants except OEC6.Compared with wild type，the maxium amplification rate of lignin content was 56.50%.This study demonstated that PpCAD was a cytoplasmic protein.Overexpression of PpCADin tobacco would lead to a increase of lignin content，which indicated that PpCADwas involve in plant lignin biosynthesis and it could be available for regulation of elephant grass lignin biosynthesis.

Pennisetum purpureum；lignin；PpCAD；subcellular localization；genitic transformation；tobacco

Q785；Q789

A

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.06.1069

1000－4025（2015）06－1069－09

2015－03－06；修改稿收到日期：2015－05－12

國(guó)家自然科學(xué)基金（31272491，30972138）；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（20124404110011）

唐 然（1988－），男，在讀博士研究生，主要從事牧草生物技術(shù)研究。E－mail：tangran＠stu.scau.edu.cn

＊通信作者：解新明，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事牧草生物技術(shù)及遺傳資源研究。E－mail：xiexmbs＠scau.edu.cn