甘草總黃酮的制備及其抗皮膚老化功能

白 陽, 孫正旺,2, 劉春瑩, 魚紅閃, 孫長凱, 金鳳燮

甘草總黃酮的制備及其抗皮膚老化功能

白 陽1, 孫正旺1,2, 劉春瑩1, 魚紅閃1, 孫長凱3, 金鳳燮1

(1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧大連 116034; 2.韓國慶熙大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,韓國京畿道 446-701; 3.大連醫(yī)科大學(xué)腦疾病研究所,遼寧大連 116044)

研究了甘草植物各部位的甘草總黃酮分布和藥渣中甘草總黃酮的提取方法,并探索了甘草總黃酮對皮膚細(xì)胞的毒性及其抗老化功能。結(jié)果表明,甘草植物各部位中甘草總黃酮的含量分布由多到少依次是葉、根、果實、莖。從甘草根藥渣中可提取3%的總黃酮,接近于甘草直接提取總黃酮的量。甘草總黃酮的質(zhì)量濃度在1和10μg/m L時,皮膚細(xì)胞正常生長,但在100μg/mL時,細(xì)胞存活量低于25%,說明高濃度的甘草總黃酮抑制細(xì)胞生長。甘草總黃酮明顯抑制UVB導(dǎo)致的皮膚細(xì)胞膠原蛋白分解酶(MMP-L1)的生成,甘草總黃酮質(zhì)量濃度在1和10μg/mL時,將MMP-L1的生成分別降低23%和56%,說明其具有抗皮膚老化功能。

甘草總黃酮;細(xì)胞毒性;抗老化

0 引 言

甘草的主要成分是甘草皂苷[1]和甘草黃酮。甘草總黃酮具有良好的抗炎、美白、保護皮膚的功能[2],是化妝品的綠色添加劑。康金森等[3]給小白鼠腹腔注射甘草總黃酮,檢測實驗鼠肝臟組織中的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及皮膚組織中的SOD、MDA的變化,證明了甘草總黃酮的皮膚抗老化功能。

本實驗研究了甘草植物的根、莖、葉和種子中的甘草總黃酮分布、甘草根提取甘草皂苷后的藥渣中甘草總黃酮的提取方法及甘草總黃酮的皮膚細(xì)胞毒性。UVB照射人正常皮膚成纖維細(xì)胞,會誘導(dǎo)膠原蛋白分解酶的生成[4],同時研究了甘草總黃酮抑制膠原蛋白分解酶生成的方法及甘草總黃酮對皮膚細(xì)胞的抗UVB和抗老化功能,以期為甘草總黃酮在功能化妝品中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

新疆烏拉爾甘草,薄層層析硅膠板(Silica gel 60 F254),人正常皮膚成纖維細(xì)胞(NHDF),細(xì)胞DMEM培養(yǎng)基,胎牛血清(FBS),青霉素/鏈霉素,MTT試劑,二甲基亞砜,測定膠原蛋白分解酶(MMP-L1)的免疫ELISA試劑盒。

1.2方法

1.2.1 測定甘草植物各部位的甘草總黃酮分布

取甘草根、莖、葉、種子各10 g,搗碎,分別加入8倍體積的80%乙醇,常溫浸泡24 h,離心收集上清,再用5倍體積的80%乙醇提取2次,合并3次提取液,減壓濃縮,干燥,乙酸乙酯萃取至無黃酮(TCL檢測),減壓濃縮、干燥得甘草總黃酮,精密稱重[5]。該實驗重復(fù)3次。

1.2.2 甘草渣中提取甘草總黃酮

取500 g切好的甘草根,加入6倍體積的水,在50℃提取4 h,重復(fù)3次,合并提取液,上樣于1 000 m L的AB-8樹脂柱中吸附皂苷,用6倍柱體積的水洗柱除掉糖類,再用80%乙醇洗柱洗脫皂苷,洗脫液減壓濃縮、干燥得甘草皂苷。

提取皂苷后的甘草藥渣中,甘草根部藥渣分別用600,400,200 m L的80%乙醇浸泡24 h,將3次乙醇浸提液混合,離心、上清液減壓濃縮,得甘草總黃酮粗品,粗品用乙酸乙酯萃取后,溶液減壓濃縮,干燥得米黃色的甘草總黃酮[6]。

1.2.3 薄層層析(TLC)法檢測甘草總黃酮

利用展開劑(乙酸乙酯、丁酮、甲醇、水的體積比為10∶7∶1∶1)展開,置于暗箱式紫外分析儀(274 nm)觀察檢測,并以標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁黃酮為對照。

1.2.4 甘草總黃酮對皮膚細(xì)胞的毒性和抗老化功能

當(dāng)紫外線照射MHDF細(xì)胞時,會誘導(dǎo)膠原蛋白分解酶的生成。參照Hwang[7]的方法,加入不同濃度的甘草總黃酮對細(xì)胞生長和膠原蛋白分解酶的生成產(chǎn)生抑制[8],確認(rèn)其對細(xì)胞的毒性和抗皮膚老化功能。

1.2.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

MHDF細(xì)胞接種到裝有DMEM培養(yǎng)基的100 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿,放入含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,在37℃培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)6～10代,得到細(xì)胞濃度較好的培養(yǎng)液用于實驗。

1.2.4.2 UVB照射與樣品處理

將培養(yǎng)的細(xì)胞(約1.2×105個)接種到40 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞生長至占據(jù)培養(yǎng)皿面積80%的時候,吸去培養(yǎng)基,PBS洗一遍,然后加入300μL PBS,用透明膜封口,UVB照射細(xì)胞40 s,照射劑量為144 mJ/cm2,照射后立即用300μL PBS再洗一遍,分別接種到含有甘草黃酮0(對照),1,10,100μg/m L的培養(yǎng)液(2 m L/平皿)中,在37℃培養(yǎng)72 h。其中1 m L培養(yǎng)液,用于抑制MMP-L1生成的測定,剩下1 m L用于細(xì)胞存活力的測定。該實驗重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞存活力

在1 mL的培養(yǎng)液中加入100μL的1 mg/mL的MTT,培養(yǎng)2 h,將培養(yǎng)液溶于DMSO中,振蕩10 min,測定570 nm吸光度,得到細(xì)胞存活力。

1.2.6 甘草總黃酮抑制膠原蛋白分解酶的生成

利用免疫ELISA試劑盒測定1 m L培養(yǎng)液中的膠原蛋白分解酶生成量。

2 結(jié)果與討論

2.1甘草各部位甘草總黃酮的分布

甘草葉中總黃酮含量最高,為4.6%;其次為甘草根,為3%。甘草果實和莖中總黃酮含量分別2%和0.85%。所提取的甘草總黃酮和對照蘆丁黃酮一樣,在紫外線274 nm下,有明顯斑點,說明是黃酮類。

2.2甘草根中的甘草皂苷和總黃酮提取

500 g甘草根經(jīng)提取,得到46 g甘草皂苷,甘草根中的皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在9%以上,但甘草莖葉中的甘草皂苷含量較低。提取甘草皂苷后的藥渣,得到甘草總黃酮15.3 g,得率為3%,接近于甘草根直接提取總黃酮的量,說明先提取甘草根中的甘草皂苷,再提取藥渣中的甘草總黃酮的方法可行,提取結(jié)果如圖1所示。

2.3甘草總黃酮的細(xì)胞毒性

從圖2中可以看到,甘草總黃酮質(zhì)量濃度為1和10μg/m L時,細(xì)胞生長正常。但是甘草總黃酮質(zhì)量濃度為100μg/m L時,細(xì)胞存活量低于25%,說明甘草總黃酮對細(xì)胞有毒性。因此,甘草總黃酮用于化妝品時,應(yīng)控制其添加量。

圖1 甘草各部位提取的總黃酮的TLC結(jié)果Fig.1 TLC result of total flavonoids extracted from various parts of the licorice

圖2 甘草總黃酮質(zhì)量濃度對細(xì)胞存活量的影響Fig.2 Effect of licorice flavonoids concentration of cell viability

2.4甘草總黃酮對膠原蛋白分解酶生成的抑制

從圖3中可以看到,細(xì)胞受到UVB照射時,明顯地生成膠原蛋白分解酶,MMP-L1酶蛋白質(zhì)量濃度從0.03μg/m L增加到0.18μg/m L。加入甘草總黃酮質(zhì)量濃度為1μg/m L時,MMP-L1酶蛋白質(zhì)量濃度降至0.14μg/m L,降低了23%。當(dāng)甘草總黃酮質(zhì)量濃度為10μg/m L時, MMP-L1酶蛋白質(zhì)量濃度降至0.08μg/m L,降低了56%。說明甘草總黃酮明顯地抑制UVB引起的人體皮膚細(xì)胞膠原蛋白分解酶的生成,也就是甘草總黃酮會提高人體皮膚細(xì)胞抗UVB功能。

圖3 甘草總黃酮質(zhì)量濃度對膠原蛋白分解酶的抑制Fig.3 Effect of licorice flavonoids concentration on collagen hydrolase inhibition

3 結(jié) 論

用乙醇提取法測定甘草各部位黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù),由高到低依次為葉4.6%,根3.0%,果實2.0%,莖0.85%。從甘草根提取皂苷后的藥渣中提取總黃酮得率為3.0%左右,接近于甘草根中直接提取總黃酮的量,說明此方法可行,對甘草加工行業(yè)有一定的意義。

當(dāng)甘草總黃酮質(zhì)量濃度達到100μg/m L時,細(xì)胞存活量低于25%,明顯抑制細(xì)胞生長,對細(xì)胞有毒性,說明甘草總黃酮在化妝品中添加時不亦過多,在1和10μg/m L時細(xì)胞毒性小。當(dāng)甘草總黃酮濃度為1和10μg/m L時,將皮膚細(xì)胞的膠原蛋白分解酶的生成分別降低23%和56%,說明甘草總黃酮明顯抑制UVB導(dǎo)致的皮膚細(xì)胞膠原蛋白分解酶的生成,具有皮膚抗老化功能。

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Preparation of licorice flavonoid and its anti-skin-aging function

BAI Yang1, SUN Zhengwang1,2, LIU Chunying1, YU Hongshan1, SUN Changkai3, JIN Fengxie1
(1.School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China; 2.College of Life Science,Kyung-Hee University,Yong-si 446-701,Korea; 3.Institute for Brain Disorders,Dalian Medical University,Dalian 116044,China)

The distribution and extraction of licorice flavonoids in liquorice were studied,and their toxicity against skin-cells and anti-skin-aging activity were determined.The descending content of licorice flavonoids in liquorice was leaf,root,fruit and stem.3%of licorice flavonoids could be extracted from the root residue,which was close to that from root.The normal growth of skin cells were observed when the licorice flavonoid concentration was 1 and 10μg/m L,but only 25%of active skin cells were obtained when the concentration was 100μg/m L.Licorice flavonoids inhibit the formation of collagen-protein-hydrolase induced by UVB.Its production was decreased by 23%and 56%respectively when flavonoids content was 1 and 10μg/m L,suggested that it had the anti-skin-aging function.

licorice flavonoids;toxicity to skin-cells;anti-aging

TS201.2;R283.6

:A

文章編號:1674-1404(2015)05-0317-03

2014-11-10.

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2012ZX09503001-003).

白陽(1989-),女,碩士研究生;通信作者:金鳳燮(1945-),男,教授.