早產(chǎn)兒喂養(yǎng)不耐受腸道菌群多樣性研究

張良娟，虎崇康，林 燕，江 遜，田 娟，田 姣，雷 達(dá)，王寶西

(第四軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院兒科，陜西 西安710038)

早產(chǎn)兒喂養(yǎng)不耐受腸道菌群多樣性研究

張良娟，虎崇康，林 燕，江 遜，田 娟，田 姣，雷 達(dá)，王寶西

(第四軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院兒科，陜西 西安710038)

目的 采用變性梯度凝膠電泳聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-DGGE)技術(shù)從微生物生態(tài)學(xué)的角度分析比較喂養(yǎng)不耐受(FI)與健康早產(chǎn)兒腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性及相似性。方法 以2013年11月至2014年9月在第四軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院兒科新生兒病房診斷為FI的早產(chǎn)兒為FI組。選擇與FI組胎齡、日齡、出生體重相匹配的非FI早產(chǎn)兒作為對照組。采集出現(xiàn)FI時和同時間段對照組的糞便標(biāo)本，進(jìn)行16SrDNAV3區(qū)擴(kuò)增和變性梯度凝膠電泳(DGGE)，從而分析比較兩組間腸道菌群多樣性指數(shù)及相似性。結(jié)果 細(xì)菌多樣性檢測顯示FI組的腸道菌群多樣性指數(shù)香農(nóng)-維納指數(shù)(H)、豐度(S)、均衡度指數(shù)(E)和辛普森多樣性指數(shù)(D)均低于對照組(均P<0.05)；相似性矩陣圖及聚類分析結(jié)果顯示組內(nèi)菌群相似性較組間高(P<0.05)；PCA結(jié)果同聚類分析一致。結(jié)論 腸道微生物群落多樣性的改變及群落結(jié)構(gòu)紊亂可能是引起早產(chǎn)兒FI的重要因素。

早產(chǎn)兒；喂養(yǎng)不耐受；變性梯度凝膠電泳；細(xì)菌群落多樣性；益生菌

新生兒出生時因消化系統(tǒng)發(fā)育尚未完全成熟，胃腸功能調(diào)節(jié)差、胃腸分泌能力低下，在喂養(yǎng)過程中容易出現(xiàn)腹脹、嘔吐、胃潴留等癥狀，當(dāng)這些癥狀呈進(jìn)行性加重并出現(xiàn)喂養(yǎng)障礙時，即發(fā)生新生兒喂養(yǎng)不耐受(feeding intolerance，F(xiàn)I)，嚴(yán)重時可致壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis, NEC)，是引起新生兒高死亡率的主要原因，特別在超低出生體重兒(extremely low birth weight, ELBW)及極低出生體重兒(very low birth weight, VLBW)中多見。研究表明，早期腸道微生物的組成可通過復(fù)雜的神經(jīng)內(nèi)分泌軸影響腸道營養(yǎng)、屏障功能、感覺-運(yùn)動功能、激素分泌、血管再生和免疫防御等[1]。因此，生后腸道微生物定植在最終腸道功能發(fā)展中起著重要作用。早產(chǎn)兒腸道異常菌群定植可能在FI和NEC發(fā)病中起著重要作用[2]。本研究采用變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)從微生物生態(tài)學(xué)的角度分析比較FI和健康早產(chǎn)兒腸道微生物群落多樣性及結(jié)構(gòu)的差異，為臨床醫(yī)生認(rèn)識腸道微生物多樣性在早產(chǎn)兒FI發(fā)病中的作用以及探索新的治療思路提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2013年11月至2014年9月在第四軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院兒科新生兒病房收治的7例FI早產(chǎn)兒為研究對象。入選標(biāo)準(zhǔn)：①孕周在32～37w，出生體重<2 500g，經(jīng)剖宮產(chǎn)娩出，以配方奶喂養(yǎng)，生時無窒息及臍繞頸史，無羊水污染史，在生后24h內(nèi)收住新生兒科；②FI診斷標(biāo)準(zhǔn)：無法消化腸內(nèi)食物，鼻飼下胃內(nèi)殘余量超過喂入量的50%，腹脹、嘔吐或兩者兼有，擾亂家屬的喂養(yǎng)計(jì)劃[3]；③排除標(biāo)準(zhǔn)：有消化系統(tǒng)先天畸形者、NEC、膿毒癥及抗生素、益生菌使用者。對照組選取同時間段與FI組的胎齡、日齡、體重等相匹配未發(fā)生FI的7例早產(chǎn)兒。采集出現(xiàn)FI時和同時間段對照組的糞便標(biāo)本，用消毒EP管收集，冰袋送實(shí)驗(yàn)室，-70°保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑及儀器

使用QIAamp?Fast DNA Stool Mini(QIAGEN，德國)試劑盒提取糞便總細(xì)菌DNA基因組，PCR擴(kuò)增引物采用16SrDNA V3區(qū)帶GC夾子的357F和518R，引物序列[4]見表1。使用Bio-Rad公司一般PCR儀擴(kuò)增細(xì)菌基因組16SrDNA V3區(qū)。采用Touchdown PCR策略，反應(yīng)體系為50μL：25μL 2×Taq PCR Master Mix；2μL 357f (10μmol/L)；2μL 518r(10μmol/L)；4μL DNA；補(bǔ)足ddH2O至50μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性94.0℃ 5min，1個循環(huán)；變性94.0℃30s，退火61.0℃30s(每循環(huán)降0.5℃)，延伸72.0℃1min，10個循環(huán)；變性94.0℃30s，退火56.0℃30s(每循環(huán)降0.5℃)，延伸72.0℃1min，25個循環(huán)；終延伸72.0℃10min，1個循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后將擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，電壓70V，40min左右，電泳圖見圖1。

變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)應(yīng)用Bio-Rad公司的Dcode系統(tǒng)(通用基因突變檢測系統(tǒng))。取10μL PCR的產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析，采用變性梯度為35%～55%、濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠(化學(xué)變性劑為100%尿素7mol/L和40%(v)的去離子甲酰胺)在1×TAE緩沖液中150V 60℃下電泳4h，銀染法染色30min，采用Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝膠成像系統(tǒng)拍照，DGGE分析見圖2。

表1 用于PCR的引物

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Quantity one 軟件對DGGE圖譜的電泳條帶數(shù)、條帶密度進(jìn)行數(shù)字化并導(dǎo)出結(jié)果計(jì)算香農(nóng)-維納指數(shù)(Shannon-Wiener Index，H)、豐度(Richness，S)、均衡度指數(shù)(Evenness，E)和辛普森多樣性指數(shù)(Simpson’s diversity Index，D)等細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)比較FI及對照組腸道細(xì)菌的多樣性；采用聚類分析及主成分分析(Principal components analysis，PCA)觀察比較其腸道細(xì)菌的相似性情況。具體計(jì)算公式如下：

E=H/Hmax=H/lnS；

D=1-∑(Ni/N)z(Ni/N)2;

S為DGGE圖譜上的每個樣本的條帶數(shù)。

(其中，Pi=樣品中單一條帶的強(qiáng)度在該樣品所有條帶總強(qiáng)度中所占的比率，N=DGGE 圖譜單一泳道上所有條帶的豐度，Ni為第i條帶的豐度，Hmax=最大的物種多樣性指數(shù)。)

2 結(jié)果

2.1 一般情況

FI組平均胎齡33.93±1.27w，平均體重2.02±0.35kg，男/女性為3/4；對照組平均胎齡34.47±0.82w，平均體重2.13±0.30kg，男/女為5/2。兩組性別、體重、胎齡比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。

2.2 糞便基因組16SrDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增

圖1 糞便基因組DNA的PCR產(chǎn)物電泳圖

Fig.1 Electropherogram of PCR products of genomic DNA in feces

圖中顯示，檢測到長約200bp左右的目的片段，無拖尾、條帶整齊、亮度可、特異性高，適用于下一步的DGGE分析。

2.3 變性梯度凝膠電泳結(jié)果

2.3.1 電泳圖

FI組及對照組的DGGE圖譜結(jié)果見圖2。圖中，一條泳道代表一個樣本，泳道的條帶越多說明生物多樣性越豐富，條帶信號的亮度可粗略的代表細(xì)菌表達(dá)量的強(qiáng)弱。

a-g為FI組，A-G為對照組。從圖中可以看出兩組的DGGE電泳條帶的數(shù)目、信號強(qiáng)度均顯示不同，且個體間條帶數(shù)多種多樣。

圖2 FI組和對照組腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的DGGE電泳圖譜

Fig. 2 DGGE electropherogram of intestinal bacterial community structure of FI group and the control group

2.3.2 泳道/條帶識別圖

通過Quantity one 軟件對DGGE圖譜的14條泳道進(jìn)行分析，到了以e泳道為標(biāo)準(zhǔn)的DGGE條帶強(qiáng)度，見圖3。

注：數(shù)字1～7代表a～g，8～14分別代表A～G。

圖3 FI組和對照組腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的條帶識別圖

Fig. 3 Band identification graph of intestinal bacterial community structure of FI group and the control group

從圖中可看到每個樣本腸道菌群結(jié)構(gòu)的整體分布情況，其中，條帶粗細(xì)不一，對應(yīng)其在DGGE膠上的密度大小不同。圖下方為以e作為標(biāo)準(zhǔn)后從高至低排列的樣品間相似性百分比。

2.3.3 相似性矩陣圖分析

通過Quantity One軟件導(dǎo)出戴斯系數(shù)，計(jì)算出各樣品相似性的矩陣，見表2。

整體看各樣品間的相似性高低不等，高達(dá)87%，低致35.5%。組內(nèi)比較，F(xiàn)I組其相似性最高達(dá)87%，如樣品5和7；樣品1和2、3和4、4和5、6和7 相似性分別為67%、76.7%、81.1%、70.8%。對照組組內(nèi)相似性最高如樣品11和12為83.5%，余樣品8和9、10和11、11和12、13和14分別為80.3%、69.4%、83.5%、69.3%。其中6和11樣品相似率為85.6%，可能與患兒胎齡、樣本收集時間較為相似等有關(guān)。因此，本結(jié)果提示組內(nèi)腸道菌群較組間相似性明顯，說明腸道微生物群落在疾病的發(fā)病過程中存在著動態(tài)變化，且在一種疾病中趨于一致。

表2 FI和對照組腸道細(xì)菌群落相似性矩陣

2.4 細(xì)菌群落多樣性分析

圖4 FI組和對照組腸道細(xì)菌群落多樣性指數(shù)比較

Fig.4 Comparison of diversity indexes of intestinal bacterial community between FI group and the control group

從圖中可看出，多樣性指數(shù)的4個指標(biāo)在FI組均較對照組低(P<0.05)。其中，H值愈小，代表了群落中生物種類愈少，所含信息愈少。E表示群落間的均衡度，可見FI組間生物群落均勻度低于對照組。而豐度S愈大，其結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，抵抗力穩(wěn)定性就越大，可見FI組不如對照組穩(wěn)定。最后，D反映的是群落中的種數(shù)，各種個體分配越均勻，指數(shù)越高，提示群落多樣性好，結(jié)果顯示D指數(shù)FI組較對照組低(均P<0.05)。

2.5 聚類分析

根據(jù)DGGE圖譜分析軟件Quantity One用非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)實(shí)現(xiàn)不同樣品間的聚類分析，如圖6。

圖5 FI組和對照組腸道細(xì)菌群落相似性聚類分析

Fig.5 Similarity clustering analysis of intestinal bacterial community of FI group and the control group

從圖中可看出FI組及對照組分別被聚類到不同的簇中。聚類分析中以0.67為截取點(diǎn)，將14個樣本聚為5個簇，如樣本1和2為一簇；樣本8和9為一簇；樣本10為一簇；樣本13和14為一簇；樣本3、4、5、7和6、11、12為最后一簇。其中樣本1和2，8和9，13和14相似性相近，表明組內(nèi)相似性較高；樣本10為單一簇，通過觀察圖4可以發(fā)現(xiàn)其與組內(nèi)樣本11相似性為69.4%，較FI組中的任一樣本相似性均高；針對最后一簇聚類結(jié)果，若以0.74為截取點(diǎn)，可將內(nèi)部分為2個簇，可明顯的發(fā)現(xiàn)FI組樣本3、4、5和7聚為一簇，樣本6、11和12被聚為一簇，其中6號樣本可能系由于個體差異未與FI聚類到一起，但從中也可發(fā)現(xiàn)樣本間組內(nèi)相似性仍較高，且與組間相似性存在一定的差異。

2.6 主成分分析

采用Canoco軟件對DGGE圖譜中每個泳道相對應(yīng)條帶的峰值進(jìn)行PCA。

圖6 FI組和對照組腸道細(xì)菌群落PCA分析

Fig. 6 PCA analysis of intestinal bacterial community of FI group and the control group

從圖中結(jié)果可以看出PCA1和PCA2累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為51.7%。將14個樣本分為6個類群：類群A為樣本3、4、5和7；類群B為樣本11、12、13和14；類群C為樣本1和2；類群D為樣本8和9；類群E、F分別對應(yīng)樣本6和10。均顯示組內(nèi)腸道菌群結(jié)構(gòu)較組間相似明顯，與聚類分析結(jié)果基本一致。

3 討論

在腸道復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)中，微生物群落通過細(xì)菌與細(xì)菌、細(xì)菌與宿主間形成相互依賴、相互制約的生態(tài)系統(tǒng)，并發(fā)揮營養(yǎng)、腸道屏障、防御作用及免疫調(diào)節(jié)等諸多功能[1,5]，成為宿主代謝過程中不可或缺的一部分。新生兒的健康有賴于腸道菌群定植及菌群間動態(tài)平衡來維持。陰道分娩、母乳喂養(yǎng)足月兒的腸道微生物通常被認(rèn)為是健康有益的。早產(chǎn)兒因受分娩方式、新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房(NICU)住院時間、禁食及抗生素使用等影響，其腸道菌群的建立過程一直處于變化中，再加之器官發(fā)育的不成熟，因此更容易受不平衡菌群的影響發(fā)生諸如FI及NEC等疾病。所以，探索FI患兒腸道菌群變化在FI發(fā)病中的作用具有重要的臨床意義。

3.1 腸道菌群多樣性分析

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)I患兒腸道微生物多樣性低于健康兒童。臨床觀察發(fā)現(xiàn)FI是NEC發(fā)病的前驅(qū)階段，在NEC病因中占據(jù)較大比例。相關(guān)研究者通過PCR-DGGE技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)NEC患兒腸道微生物多樣性明顯低于健康兒童，腸道菌群紊亂是NEC發(fā)病的重要機(jī)制[6-7]。Arboleya等[8]同樣應(yīng)用該技術(shù)分別對早產(chǎn)兒和足月兒出生3個m內(nèi)第2d、10d、30d及90d的4個時間點(diǎn)的糞便微生物多樣性進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示4個時間點(diǎn)早產(chǎn)兒腸道微生物多樣性均明顯低于足月兒。因此，早產(chǎn)兒腸道菌群種類的減少是引起FI的重要誘因。

3.2 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

本研究結(jié)果亦顯示，組內(nèi)腸道微生物群落結(jié)構(gòu)相似性較組間高，即FI患兒腸道菌群結(jié)構(gòu)與健康兒童有明顯差異。Smith等[9]人應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)發(fā)現(xiàn)與健康兒童相比，NEC患兒的DGGE圖譜較為接近，說明一種疾病的不同個體腸道菌群結(jié)構(gòu)是趨于一致的。Schwiertz 等于2003年應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)對NICU的早產(chǎn)兒和足月兒出生4w內(nèi)糞便微生物多樣性進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示足月兒生后5d，條帶即達(dá)到穩(wěn)定；而早產(chǎn)兒需10d才可達(dá)到穩(wěn)態(tài)。因此，早產(chǎn)兒腸道細(xì)菌定植延遲，且足月兒與早產(chǎn)兒腸道細(xì)菌結(jié)構(gòu)模式不同。

有研究顯示，腸道微生物多樣性降低及群落結(jié)構(gòu)紊亂是引起NEC的重要因素[6-7]，而早產(chǎn)兒FI作為NEC發(fā)病的前驅(qū)階段，本研究結(jié)果同樣提示腸道微生物多樣性降低及群落結(jié)構(gòu)紊亂是引起FI的重要誘因。FI早產(chǎn)兒因消化系統(tǒng)發(fā)育不成熟，胃腸動力、免疫防御等功能不完善，加之腸內(nèi)細(xì)菌過度繁殖、發(fā)酵，導(dǎo)致腸壁缺血，容易發(fā)展為NEC。諸多研究者對早產(chǎn)兒腸道微生物群落的研究結(jié)果提示：新生兒出生后，受個體、環(huán)境及喂養(yǎng)等影響，腸道微生物處于動態(tài)變化過程中，每個新生兒都有其獨(dú)特的腸道微生物菌群圖譜。正常情況下，宿主為腸道共生菌提供一個穩(wěn)定的棲息地，共生菌通過提高腸道屏障功能及胃腸道動力，發(fā)揮免疫防御作用抵抗危險(xiǎn)因素，從而支持腸道結(jié)構(gòu)和功能的完整性。較足月兒相比，早產(chǎn)兒腸道微生物多樣性的降低和腸道群落結(jié)構(gòu)的紊亂，擾亂腸道正常功能，嚴(yán)重影響個體發(fā)育，容易導(dǎo)致如FI和NEC等疾病的發(fā)生發(fā)展。并有相關(guān)研究顯示腸道菌群多樣性與早產(chǎn)兒腸道對食物消化耐受能力及體重增長呈正相關(guān)[10]。由此可見，通過增加腸道益生菌群的多樣性可促進(jìn)宿主的健康。

近年來關(guān)于益生菌的應(yīng)用越來越廣泛，其作用機(jī)制通過保護(hù)粘膜屏障的完整性、抑制細(xì)菌移位、調(diào)節(jié)細(xì)菌定植、發(fā)揮免疫防御作用及調(diào)控腸道炎癥反應(yīng)等發(fā)揮有益的作用[11]。有研究發(fā)現(xiàn)益生菌可防止早產(chǎn)兒FI的發(fā)生，促進(jìn)其體重增長，且應(yīng)用是安全的[12]。研究發(fā)現(xiàn)益生菌可有效減少NEC 的發(fā)病率，減少NEC發(fā)病的嚴(yán)重程度和縮短病程，并減少病死率。應(yīng)用益生菌治療此類疾病可能是一種比較有前途的方法，因此，有必要制定益生菌攝入的標(biāo)準(zhǔn)化方案(比如單一或組合菌種、劑量、療程等)進(jìn)行多中心實(shí)驗(yàn)評估益生菌的利弊。這樣，通過早期對FI患兒實(shí)施必要的干預(yù)措施，盡量避免FI、NEC的發(fā)生，從而降低新生兒發(fā)病率和死亡率。本研究發(fā)現(xiàn)FI患兒腸道菌群多樣性較健康新生兒明顯減少，因此，應(yīng)進(jìn)一步深入觀察FI患兒腸道特定優(yōu)勢菌群的改變是否也參與了FI的發(fā)病過程，為臨床應(yīng)用益生菌預(yù)防和治療FI提供可靠依據(jù)。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：劉黎明]

Investigation of the intestinal microbial community diversity in preterm infants with feeding intolerance

ZHANG Liang-juan, HU Chong-kang, LIN Yan, JIANG Xun, TIAN Juan, TIAN Jiao, LEI Da, WANG Bao-xi

(DepartmentofPediatrics,TangduHospital,TheFourthMilitaryUniversity,ShaanxiXi’an710038,China)

Objective To observe and compare the diversity and similarity of intestinal bacterial community structure of preterm infants who had feeding intolerance (FI) and those who were healthy from the perspective of microbial ecology using polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) technology. Methods The preterm infants diagnosed as FI during December 2013 to September 2014 in neonatal wards of pediatric department of Tangdu Hospital of the Fourth Military University were recruited in FI group. The infants without FI but matched in gestational age, days of age and birth weight during the same period were taken in control group. The stool samples were collected in FI group when FI occurred and in the control group at the same period for conducting 16SrDNA V3 region amplification and DGGE, and thus the diversity and similarity of intestinal bacterial community structure between two groups were analyzed and compared. Results The results of bacterial diversity showed that H, S, E and D of FI group were lower than those of the control group (allP<0.05). Similarity matrix and cluster analysis showed that the intra-group similarity of the flora was higher than inter-group similarity (P<0.05). Principal components analysis (PCA) was consistent with the cluster analysis. Conclusion The change of intestinal microbial community diversity and community structure disorder may be the important factor causing FI in preterm infants.

preterm infants; feeding intolerance (FI); denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE); bacterial community diversity; probiotics

2014-11-03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81370490)

張良娟(1988-)，女，在讀碩士研究生，主要從事兒童消化動力的研究。

王寶西，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.02.002

R722

A

1673-5293(2015)02-0171-04