銀柴胡離體培養(yǎng)與毛狀根誘導(dǎo)技術(shù)初步研究

胡海英, 吳曉玲

1.寧夏大學(xué)科技處, 銀川 750021;2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 銀川 750021

銀柴胡離體培養(yǎng)與毛狀根誘導(dǎo)技術(shù)初步研究

胡海英1, 吳曉玲2

1.寧夏大學(xué)科技處, 銀川 750021;2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 銀川 750021

以銀柴胡莖段為外植體，經(jīng)消毒獲得無菌再生材料后，篩選發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)毛狀根誘導(dǎo)產(chǎn)生的最適條件。結(jié)果顯示：最適的無菌消毒方法為：70%酒精浸5 s，0.1%升汞消毒3 min，獲得了銀柴胡離體培養(yǎng)材料；以發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株介導(dǎo)的銀柴胡毛狀根誘導(dǎo)過程中，與葉片和不帶腋芽莖段相比，帶腋芽莖段為最適轉(zhuǎn)化外植體，用OD600=0.8的菌液侵染莖段15 min，共培養(yǎng)3 d，800 mg/L頭孢噻肟鈉除菌，其誘導(dǎo)率及誘導(dǎo)密度最高，分別為100%和4.7，為最適誘導(dǎo)條件。研究結(jié)果說明在適合條件下，銀柴胡帶腋芽莖段適于誘導(dǎo)毛狀根。

銀柴胡；離體培養(yǎng)；發(fā)根農(nóng)桿菌；毛狀根；誘導(dǎo)

銀柴胡(StellariadichotomaL. var.laceolataBge)別名銀胡、山菜根，是被子植物石竹科(Garyophyllaceae)繁縷屬(Stellaria)多年生草本植物，屬于寧夏的道地性中藥材，根入藥，性微寒味甘，無毒，歸肝經(jīng)胃經(jīng)，具有清虛熱、除疳熱等功效[1]。近年來隨著對(duì)其活性成分甾體類、皂苷類、環(huán)肽類的深入研究，發(fā)現(xiàn)銀柴胡根提取物具有解熱、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗變態(tài)反應(yīng)等作用[2]。隨著對(duì)銀柴胡開發(fā)的不斷深入，國(guó)內(nèi)外需求量大增，其野生資源已近枯竭，而人工栽培技術(shù)還不夠成熟，栽培生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，難以達(dá)到推廣種植的目的，產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需求[1～3]。通過組織培養(yǎng)等無性繁殖技術(shù)培育中藥材可以保證其優(yōu)良的性狀及遺傳穩(wěn)定性，并能縮短生產(chǎn)周期。吳曉玲等[4,5]篩選出了誘導(dǎo)銀柴胡愈傷組織的最佳培養(yǎng)基配方，并對(duì)其細(xì)胞培養(yǎng)調(diào)控條件進(jìn)行了研究。毛狀根(hairy roots)是發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)感染植物后，在植株創(chuàng)傷表面誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種特殊表現(xiàn)型，其生長(zhǎng)速度快，遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)，因此，毛狀根培養(yǎng)技術(shù)在一些價(jià)格高、產(chǎn)量低、需求量大的藥物成分研究方面應(yīng)用廣泛[6,7]。國(guó)內(nèi)外目前已有近百種藥用植物成功誘導(dǎo)出了毛狀根，部分已建立了長(zhǎng)期的毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)并獲得了次生代謝產(chǎn)物[8～13]。但目前利用此項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行銀柴胡毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)方面的研究還未見報(bào)道。本文利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)銀柴胡不同外植體產(chǎn)生毛狀根，篩選出了適合的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件和方法，為銀柴胡毛狀根的大量培養(yǎng)和有效成分利用提供前期實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

銀柴胡種子由寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院彭勵(lì)教授提供；發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所。

1.2 方法

1.2.1 銀柴胡無菌苗的獲得 將銀柴胡種子種植于花盆內(nèi)，種子發(fā)芽獲得帶4～5個(gè)葉腋的幼苗，用洗衣粉水反復(fù)沖洗，再用蒸餾水沖洗2～3次，用無菌水反復(fù)浸泡12 h以上。在超凈工作臺(tái)上，將幼苗切段，用0.1%的升汞和70%的酒精配合消毒后，切成0.5～1 cm帶葉莖段，接種在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)不定芽分化，待腋芽長(zhǎng)至3～4 cm，將其切下，再接種在MS+0.5 mg/L IBA培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，獲得銀柴胡組培無菌苗。光照16 h/d，光照強(qiáng)度2 000 lx，溫度25±1℃。

1.2.2 發(fā)根農(nóng)桿菌的活化 活化培養(yǎng)采用YEB培養(yǎng)基，成分為：蛋白胨5 g/L、酵母粉5 g/L、蔗糖5 g/L、MgSO42 mmol/L，pH 7.2?；罨瘯r(shí)將A4菌株在YEB培養(yǎng)基上劃線，28℃培養(yǎng)，直到長(zhǎng)出單個(gè)菌落。挑取單菌落于5 mL YEB培養(yǎng)液中，120 r/min震蕩36 h，按1%的量將搖好的菌液接種于YEB培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8。

1.2.3 抗菌素的篩選 將已經(jīng)活化好的發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株分別接種于含不同濃度(1 000 mg/L、800 mg/L、600 mg/L)的頭孢塞污鈉和不含頭孢塞污鈉的MS固體培養(yǎng)基上，7 d后觀察篩選最適的抗菌素濃度。

1.2.4 轉(zhuǎn)化外植體和共培養(yǎng)時(shí)間的篩選 轉(zhuǎn)化用菌液于6 000 r/min離心5 min，棄上清液，用MS液體培養(yǎng)基懸浮，使其OD600=0.8。無菌條件下，將銀柴胡無菌苗葉片、帶腋芽莖段和不帶腋芽莖段分別切成0.5～1 cm的小段，將材料小心地劃些傷口平放于MS+0.5 mg/L IBA培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)2 d后，菌液侵染15 min，共培養(yǎng)2～3 d。預(yù)培養(yǎng)條件：暗培養(yǎng)，溫度25±1℃。共培養(yǎng)條件：每天光照16 h，光照強(qiáng)度2 000 lx，溫度25±1℃。

1.2.5 菌液濃度和侵染時(shí)間的篩選 預(yù)培養(yǎng)的植物材料分別放入4種不同濃度的菌液(OD600分別為0.6、0.8、1.0、1.2)中進(jìn)行侵染，設(shè)計(jì)不同的侵染時(shí)間，分別為5 min、10 min、15 min和20 min，侵染后，取出外植體置于MS固體培養(yǎng)基共培養(yǎng)，以未感染的莖切段作對(duì)照。同時(shí)以激素誘導(dǎo)離體根為對(duì)照(培養(yǎng)基：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA)。共培養(yǎng)3 d后，除菌培養(yǎng)3～5次，30 d后統(tǒng)計(jì)。光照時(shí)間16 h/d，光照強(qiáng)度2 000 lx，溫度25±1℃。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

腋芽發(fā)生率(%)=發(fā)出腋芽的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%；污染率(%)=污染的培養(yǎng)基瓶數(shù)/接種的培養(yǎng)基總瓶數(shù)×100%；毛狀根誘導(dǎo)率=產(chǎn)生毛狀根外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100%；毛狀根誘導(dǎo)密度=產(chǎn)生毛狀根的總數(shù)/產(chǎn)生毛狀根的外植體數(shù)。采用方差分析法分析培養(yǎng)條件對(duì)銀柴胡毛狀根誘導(dǎo)率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀柴胡外植體無菌消毒方法的選擇

本研究預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，銀柴胡種子無菌播種發(fā)芽率極低，且容易污染，不易得到無菌苗，影響后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行。故采用栽培幼苗作為外植體，因銀柴胡幼苗嫩弱，消毒后幼苗基本脫水死亡。由表1可知，最適0.1%升汞和70%酒精結(jié)合消毒的條件為：70%酒精中浸5 s(或者不浸)，0.1%升汞消毒3 min，然后立即用無菌水沖洗4～5次，培養(yǎng)材料污染率能控制在30%以下，腋芽發(fā)出率達(dá)50%。

表1 銀柴胡外植體最適消毒條件

2.2 銀柴胡不同外植體誘導(dǎo)毛狀根的效果比較

采用葉片、帶腋芽莖段和不帶腋芽莖段作為外植體，比較毛狀根的誘導(dǎo)效果，結(jié)果(表2，圖1,彩圖見圖版一)表明，發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的銀柴胡帶腋芽莖段毛狀根的誘導(dǎo)率最高，達(dá)100%，誘導(dǎo)密度為4.7，且有側(cè)芽長(zhǎng)出；不帶腋芽莖段為外植體時(shí)，其誘導(dǎo)率為12.5%，誘導(dǎo)密度為2.1，出現(xiàn)毛狀根時(shí)間晚，無明顯分枝，生長(zhǎng)緩慢；而葉片誘導(dǎo)率為0，無毛狀根出現(xiàn)，葉片逐漸變軟，變黃，最終死亡。因此，銀柴胡帶腋芽莖段為最佳外植體。

表2 銀柴胡不同外植體誘導(dǎo)毛狀根的效果比較

圖1 發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)莖段產(chǎn)生的毛狀根

2.3 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)銀柴胡毛狀根誘導(dǎo)的影響

在創(chuàng)傷部位生存8～16 h之后的菌株才能誘發(fā)毛狀根，因此篩選合適的農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)時(shí)間也是非常重要的環(huán)節(jié)。將銀柴胡帶腋芽莖段與菌液共培養(yǎng)不同時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)3 d，毛狀根誘導(dǎo)率最高,為51%(表3)。共培養(yǎng)時(shí)間過短，誘導(dǎo)率低;共培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)促進(jìn)農(nóng)桿菌的過度生長(zhǎng)而使植物細(xì)胞受到毒害，使外植體生活力下降，誘導(dǎo)率也下降，且對(duì)除菌培養(yǎng)造成困難，因此，共培養(yǎng)3 d為最適選擇。

表3 不同共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)銀柴胡毛狀根誘導(dǎo)的影響

2.4 菌液濃度與侵染時(shí)間對(duì)銀柴胡毛狀根誘導(dǎo)的影響

銀柴胡帶腋芽莖段發(fā)根誘導(dǎo)率隨侵染時(shí)間和侵染菌液濃度的不同發(fā)根效果不同。如表4所示，在濃度為OD600=0.8的菌液侵染15 min后，共培養(yǎng)3 d，毛狀根誘導(dǎo)率最高，達(dá)100%，誘導(dǎo)密度最高為4.7。方差分析結(jié)果(表5)可知侵染菌液濃度組間無顯著差異，侵染時(shí)間的F=4.720(P<0.05)，差異顯著。結(jié)果顯示，侵染時(shí)間超過10 min后，毛狀根的誘導(dǎo)率都顯著降低，說明侵染時(shí)間延長(zhǎng)，菌液對(duì)外植體會(huì)造成負(fù)面影響，導(dǎo)致毛狀根誘導(dǎo)率降低。誘導(dǎo)的毛狀根(圖2，彩圖見圖版一)具有大量的白色發(fā)狀根，分支多，貼壁向上或者沿著培養(yǎng)基水平生長(zhǎng)，失去向地性。含激素培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA)誘導(dǎo)生根數(shù)量少，伸長(zhǎng)生長(zhǎng)不明顯，容易褐化，生根率只有26.7%。

表4 不同侵染菌液濃度與侵染時(shí)間對(duì)銀柴胡毛狀根誘導(dǎo)產(chǎn)生的影響

表5 方差分析結(jié)果

注：a.R2=0.737(調(diào)整的R2=0.561)；*表示P<0.05水平上差異顯著。

2.5 最適抗菌素濃度的篩選

不同濃度頭孢噻肟鈉除菌效果不同，培養(yǎng)7 d之后，在不含抗菌素的YEB平板上，發(fā)根農(nóng)桿菌生長(zhǎng)良好(圖3A，彩圖見圖版一)，而在含有頭孢噻污鈉的YEB平板上，未見生長(zhǎng)(圖3B)。培養(yǎng)14 d后，抗菌素濃度達(dá)1 000 mg/L對(duì)植物材料生長(zhǎng)有影響，含600 mg/L抗菌素的平板上肉眼可見菌落，含800 mg/L抗菌素的平板上未見菌落，植物材料生長(zhǎng)正常。因此，選擇800 mg/L為最適抗菌素除菌濃度。

圖2 發(fā)根農(nóng)桿菌(A)與植物激素(B)誘導(dǎo)毛狀根的生長(zhǎng)效果

圖3 不含抗菌素(A)和含抗菌素(B)的發(fā)根農(nóng)桿菌抑菌效果比較

3 討論

已有研究發(fā)現(xiàn)，在毛狀根誘導(dǎo)過程中，侵染部位對(duì)轉(zhuǎn)化效果的影響最大，而菌液濃度、侵染時(shí)間是影響轉(zhuǎn)化的次要因素[6,9～17]。侵染部位多為葉片、莖段和下胚軸，且材料越幼嫩其轉(zhuǎn)化效果越好[12,14～17]。本文所采用的侵染材料中，葉片細(xì)長(zhǎng)幼嫩，但無毛狀根產(chǎn)生，可能是轉(zhuǎn)接操作對(duì)材料有一定的傷害，造成材料失去活性而無轉(zhuǎn)化效果；不帶腋芽莖段也存在同樣問題，侵染后材料生活力不夠?qū)е罗D(zhuǎn)化效果不明顯；帶腋芽莖段的離體培養(yǎng)可能是由于去掉頂端優(yōu)勢(shì)促進(jìn)了腋芽萌發(fā)，生活力較強(qiáng)，使莖段切割處的植物細(xì)胞分裂活躍，易于農(nóng)桿菌的感染和轉(zhuǎn)化。因此，本文研究中只有帶腋芽莖段適合毛狀根的誘導(dǎo)。

在菌液濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間3個(gè)影響因素的篩選試驗(yàn)過程中，已有的研究報(bào)道中有不同的結(jié)果，李景濱等[14]研究發(fā)現(xiàn)，菌液OD600=0.8左右時(shí)，金鐵鎖毛狀根的誘導(dǎo)效果最佳，與本文研究結(jié)論一致；孫晶等[9]研究表明，北柴胡毛狀根誘導(dǎo)的最佳侵染時(shí)間為20 min，與本文得到適于銀柴胡毛狀根誘導(dǎo)的最佳侵染時(shí)間為15 min有偏差。因此，研究對(duì)象、使用菌株及外植體等條件的不同會(huì)使轉(zhuǎn)化條件略有不同，大多數(shù)藥用植物[6，9～18]毛狀根的誘導(dǎo)過程中其發(fā)根農(nóng)桿菌菌液濃度在OD600= 0.6～0.8、侵染時(shí)間為10～25 min、共培養(yǎng)時(shí)間為2～4 d。

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Studies on Isolated Culture and Hairy Roots Inducing ofStellariadichotomaL. var.laceolataBge

HU Hai-ying1, WU Xiao-ling2

1.ScienceandTechnologyDepartment,NingxiaUniversity,Yinchuan750021,China;2.LifeScienceCollege,NingxiaUniversity,Yinchuan750021,China

In this study, stems ofStellariadichotomaL. var.laceolataBge as explants were sterilized, and sterile culture material were acquired. Then its hairy roots were induced byAgrobacteriumrhizogenesA4 with Ri-plasmid. Results showed the method that the explants was soaked in 70% alcohol for 5 s and in 0.1% HgCl2for 3 min, was the optimal sterilized method, so sterile culture material were acquired. During the induction byAgrobacteriumrhizogenesA4, comparing with the leaves and stems with no axillary bub taking the stems with axillary bud was the best explant for transformation. The induction rate and the density was 100% and 4.7, respectively, when the stems with axillary bud were infected for 15 min and co-cultured for 3 days withAgrobacteriumrhizogenes(OD600=0.8), and sterilized by 800 mg/L cefotaxime sodium. So these were the optimized factors, and the stems with axillary bud were the optimized explants for transformation.

StellariadichotomaL. var.laceolataBge; isolated culture;Agrobacteriumrhizogenes; hairy roots; induction

2015-05-22; 接受日期：2015-06-12

寧夏自然科學(xué)研究基金項(xiàng)目(NZ13034)資助。

胡海英, 副教授，研究方向?yàn)橹参锷锛夹g(shù)。E-mail:haiying@nxu.edu.cn

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.06.06