疫苗規(guī)?；蛛x純化研究進展

朱俊穎, 孫 曄, 蔣麗華, 邱勇雋, 趙黎明

華東理工大學發(fā)酵工業(yè)分離提取技術(shù)研發(fā)中心, 生物反應器國家重點實驗室, 上海 200237

疫苗規(guī)?；蛛x純化研究進展

朱俊穎, 孫 曄, 蔣麗華, 邱勇雋, 趙黎明*

華東理工大學發(fā)酵工業(yè)分離提取技術(shù)研發(fā)中心, 生物反應器國家重點實驗室, 上海 200237

隨著我國疫苗行業(yè)的不斷發(fā)展及人們對疫苗安全性和副作用認識的加深，經(jīng)簡單提純的疫苗已不能滿足人們的需求，因此分離純化在疫苗制備和生產(chǎn)中尤為重要。綜述了各類疫苗分離純化技術(shù)方法的研究進展，介紹了國內(nèi)外疫苗分離純化的新趨勢和發(fā)展方向。離心和沉淀作為傳統(tǒng)的分離方法已在各類疫苗中得到廣泛地應用，膜分離技術(shù)和層析技術(shù)以及與其他方法的結(jié)合已經(jīng)成為疫苗分離純化的主要方向；而整體柱、膜色譜以及模擬移動床技術(shù)作為新興技術(shù)正在疫苗的分離純化中逐漸興起。

疫苗；分離純化；層析；膜分離

疫苗是生物制品，是應用傳統(tǒng)方法或基因工程等生物技術(shù)，針對病原體或其相關(guān)的蛋白(多肽、肽)、多糖或核酸，以一種或多種成分，直接或間接通過載體經(jīng)免疫接種進入機體后，能誘導產(chǎn)生特異性的液體和(或)細胞免疫，從而使機體獲得預防該病的免疫力,主要用于疾病的預防和治療[1]。據(jù)古籍記載，我國在公元10世紀就曾采用接種人痘(天花病原體)的方法來預防天花。近年來，隨著生物、化學技術(shù)的迅猛發(fā)展，尤其是基因工程技術(shù)的興起，疫苗已不是完整的病原體，滅活和減毒的概念亦模糊不清。疫苗的應用已從預防疾病發(fā)展到治療疾病，因而有預防性疫苗和治療性疫苗之分。目前大多數(shù)疫苗產(chǎn)品，都是用于預防病毒或細菌的感染。根據(jù)制備技術(shù)可分為傳統(tǒng)疫苗和新型疫苗(或高技術(shù)疫苗)。傳統(tǒng)疫苗包括滅活疫苗、減毒活疫苗和從微生物及其衍生物分離提取的亞單位疫苗，如蛋白疫苗和多糖疫苗；新型疫苗包括基因工程亞單位疫苗、重組載體活疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗、遺傳重配疫苗以及合成肽疫苗等。

隨著我國疫苗市場規(guī)模的持續(xù)快速增長、科學技術(shù)的發(fā)展以及人們對疫苗安全性和副作用認識的加深，經(jīng)簡單提純的疫苗已不能滿足人們對疫苗的純度、無菌性和安全性等的要求，在歷史上曾因疫苗提取后仍含有過高的宿主蛋白，去除雜蛋白率不高，影響疫苗的產(chǎn)品質(zhì)量，導致疫苗在臨床使用后有較大的副作用，這促使人們對疫苗的純度、無菌性和安全性等提出了更高的要求。研究者期望通過以下兩個方向的研究得到純度高、無菌和安全的疫苗制品：①從疫苗開發(fā)的技術(shù)路線出發(fā)研制更高效、安全的新疫苗；②從分離純化工藝出發(fā)提高疫苗的純度。過去，人們認為只有亞單位疫苗和菌體分離才需要精制純化設(shè)備，大多數(shù)疫苗僅進行初步純化，但現(xiàn)在越來越多的疫苗是精制純化疫苗。同時，疫苗在來源、組分、物化性質(zhì)以及生產(chǎn)方式等方面存在著一定差異性，因此不同疫苗的分離方法也存在相對特異性。而目前疫苗分離純化的主要研究方向為在盡可能保證疫苗生物活性不受損失的情況下，提高分離效率，提高回收率和產(chǎn)品純度等幾個分離純化關(guān)鍵共性問題。

本文對目前國內(nèi)外疫苗的分離純化策略、方法和規(guī)?；瘧矛F(xiàn)狀進行了歸納，介紹了膜分離、色譜技術(shù)以及膜色譜、整體柱、模擬移動床等疫苗純化技術(shù)的發(fā)展新趨勢，以期為疫苗大規(guī)模分離純化技術(shù)的研究和應用提供思路和方向。

1 疫苗純化策略及工藝

大多數(shù)疫苗的抗原成分是細菌、病毒或是他們的亞單位抗原、基因工程表達產(chǎn)物等，這些物質(zhì)就是疫苗目的產(chǎn)物。而在大規(guī)模培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生許多非目的產(chǎn)物，例如培養(yǎng)基固有成分(血清類、激素多肽等)、細菌酵母菌的菌體成分以及其他分泌物、細胞碎片和微生物的溶解物等。在疫苗純化制備過程中，需要將所需的目的產(chǎn)物如微生物本身或亞單位等成分從培養(yǎng)物中分離出來，并進一步純化，去除雜質(zhì)，使最終的目標疫苗成分純度達到90%～95%以上。

除多糖類疫苗以及核酸類疫苗外，現(xiàn)階段廣泛研發(fā)和使用的疫苗主要成分為蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，故可參照蛋白質(zhì)的分離純化方法。但與蛋白純化不同的是，疫苗的普及率高、用量大，且使用對象多為嬰幼兒和兒童，其分離純化相應要求更高；很多疫苗(如乙肝表面抗原)由多聚亞基組成，其免疫原性大于各單個亞基的免疫原性之和，分離純化過程更為復雜；而最大的不同之處在于：一般基因工程的疫苗蛋白分子量超過幾十萬，可達數(shù)百萬道爾頓(Da)。因此，與一般蛋白的分離純化相比，疫苗的提純又具有特殊性。

但由于不同疫苗在其組成成分及理化性質(zhì)等方面都具有一定差異，因此可以利用這些特異性進行分離。例如：有些產(chǎn)物可以采用化學促沉降法去除雜質(zhì)，再以差異離心沉降法[2,3]等技術(shù)分離，另外一些則可先以差異離心技術(shù)分離，后再以液相色譜層析技術(shù)分離純化；或者以不同類型的液相色譜層析技術(shù)交替或重復進行純化。有些以超濾技術(shù)去除小分子雜質(zhì)；有些則以超濾技術(shù)進行分子洗凈等。如果目標產(chǎn)物是較小的分子，如多肽抗原，則可以收獲超濾的濾液，輔以液相色譜層析等。對疫苗成分的純化，在經(jīng)澄清處理后，某些疫苗收取上清，而對于另一些不同的疫苗則可能是收取沉淀物；有些則采用離子層析加凝膠過濾層析串聯(lián)處理方法[4,5]；有些則采用超濾技術(shù)加超速離心技術(shù)[6,7]；反之亦然。

雖然不同疫苗具體的分離純化路線有所不同，但總體純化策略大體一致，分為初步分離和后期精制。初步分離的目的是將目標粗產(chǎn)物與培養(yǎng)液分離，包括細胞破碎技術(shù)，濃縮以及利用膜分離技術(shù)初步除雜；而后期精制階段的主要目的在于在保證其活性的前提下，利用超速離心、層析技術(shù)等方法，進一步提高目標產(chǎn)物的純度，使其達到疫苗行業(yè)標準。同時也要兼顧生產(chǎn)規(guī)模、制備要求等條件，進而確定純化工藝條件。表1概括了在實驗室規(guī)模和大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)病毒性疫苗的一般純化方案。在實驗室規(guī)模的病毒純化操作通常使用超速離心法為基礎(chǔ)方法；而在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)病毒的純化方法中，更傾向于采用易放大的技術(shù)如膜過濾及層析技術(shù)。

表1 病毒性疫苗純化的一般方法

2 疫苗分離純化技術(shù)

2.1 細胞破碎

細胞破碎是針對目標產(chǎn)物存在于細胞內(nèi)部的預處理方法，經(jīng)過破碎處理后，細胞內(nèi)部的目標產(chǎn)物釋放到培養(yǎng)液中，進而通過離心沉淀將產(chǎn)物與培養(yǎng)液進行固液相分離的方法。表2是細胞破碎常用的方法。對于較難破碎的細胞，通常采用表中兩種方法或幾種方法連用的手段。其后為澄清處理，通過過濾、離心沉降等技術(shù)去除細胞碎片、非目的菌體片段和培養(yǎng)基成分等。

表2 細胞破碎常用方法

在完成發(fā)酵培養(yǎng)物固液分離得到含有目的抗原的澄清提取液后，在純化前可對目的產(chǎn)物進行濃縮，此過程可通過采用透析袋外加強吸水物、超速過濾、速率區(qū)帶離心等技術(shù)完成。其后進行純化步驟，可以采用速度區(qū)帶離心、液相色譜層析、等密度區(qū)帶離心等。其后是再次對目的產(chǎn)物進行濃縮或者這些步驟的重復。

2.2 離心與超速離心

離心沉淀是將細胞培養(yǎng)后的目標產(chǎn)物與培養(yǎng)液進行固液相分離的重要步驟。在實驗室規(guī)模純化病毒性疫苗主要采用超速離心法，其中最常用的為梯度密度離心法。其原理是通過在溶液中加入少量大分子物質(zhì)，改變?nèi)芤好芏?，在離心力的作用下，密度較大的物質(zhì)下沉，密度小的物質(zhì)上浮，最終達到重力與浮力平衡，形成大分子帶狀物，進而達到分離效果。常用的梯度材料為蔗糖[15]、氯化銫[16]和碘克沙醇等[17]。但此法對儀器的要求很高，轉(zhuǎn)速至少為30 000 r/min，在這個轉(zhuǎn)速下要求離心7～8 h。

從收獲的上清液或細胞裂解物中除去細胞和細胞碎片通常通過間歇離心來實現(xiàn)。這種簡單的操作讓病毒顆粒從大多數(shù)細胞碎片中分離出來。通過調(diào)整離心的時間、離心力等因素，可以提高產(chǎn)品得率。

2.3 膜過濾技術(shù)

過濾是指在一定的壓力下，利用特定的分離介質(zhì)將不同大小的物質(zhì)分離。分離介質(zhì)可以是濾板或是微孔過濾膜。過去將濾板過濾技術(shù)稱為深層過濾技術(shù)。濾板是由特殊纖維組成，具有一定的厚度，一般認為它們難以確定被過濾物質(zhì)的大小限度；而且對于過濾物的一些成分具有吸附作用。因此，目前大多數(shù)情況下它們只用于澄清過濾；主要用于除去細菌和亞細胞成分，不適用于細菌的回收。而隨著膜過濾技術(shù)的發(fā)展，其在生物制品中的應用也越來越廣泛。膜過濾技術(shù)，按照截留顆粒尺寸可以分為反滲透、納濾、超濾、微濾等[18]，表3為幾種常用的膜組件及其優(yōu)缺點。

采用何種形式的膜組件取決于待處理物料的性質(zhì)及膜材料性能。待處理的疫苗料液多包含細胞碎片、大分子蛋白及微生物等成分，這些成分極易造成膜表面污染和膜孔堵塞。傳統(tǒng)的過濾方式為死端過濾，即料液流動方向朝向膜表面，所有截留物均堆積于膜表面，從而造成膜過濾效率下降和嚴重的膜污染，不適用于大規(guī)模高固形物含量的物料分離。錯流過濾或稱切向流過濾是目前主流的物料膜分離方式，待分離物料流動方向切向于膜表面(與過濾方向相垂直)，液體流動在膜表面產(chǎn)生剪切力，減小了濃差極化及沉積帶來的不利影響。

表3 各種膜組件性能的比較

膜過濾技術(shù)可廣泛應用于疫苗制備。微濾可以取代離心機從發(fā)酵罐中收集細胞及去除細胞碎片，在細胞連續(xù)培養(yǎng)的無菌換液中也有一定應用。超濾主要應用于產(chǎn)品濃縮、透析(脫鹽，脫醇等)以及置換緩沖液等方面。

2.3.1 微濾 實驗室規(guī)模的梯度超速離心法和沉淀法不適用于較大規(guī)模的疫苗分離純化過程，特別是減毒、滅活的病毒和病毒樣顆粒(VLP)，因為它們極端脆弱和敏感，分子的完整性易受到不恰當操作條件的破壞。故采用較低剪切力的中空纖維膜微濾對病毒性疫苗如乙肝病毒、流感病毒、狂犬病毒和HPV疫苗等進行澄清。

微濾廣泛用于發(fā)酵液澄清過濾及細胞裂解物的大規(guī)模澄清過濾。微濾膜孔徑在0.05～10 μm之間。細胞和細胞碎片等尺寸大于膜孔徑的物質(zhì)將被微濾膜截留，抗原組分尺寸小于微濾膜孔徑而透過微濾膜。濾膜孔徑大于0.45 μm的濾膜，大多用于澄清過濾；孔徑為0.45 μm的濾膜可用于除去一般細菌；而較小的孔徑，如0.22 μm，可能會導致早期膜封鎖和抗原組分的失活，只能用于溶液、培養(yǎng)基以及產(chǎn)品的最終除菌過濾。Merck公司[23]采用0.65 μm中空纖維濾膜澄清酵母細胞的表達體系，發(fā)現(xiàn)其回收率和處理速度遠遠好于平板式膜。Negrete[24]在兩步切向流澄清和濃縮HIV病毒樣顆粒時，第一步采用0.45 μm中空纖維膜在跨膜壓差0.125 MPa、6 000/s的剪切力下微濾，然后采用超濾技術(shù)，在6 h內(nèi)可處理2 L細胞懸浮液，為進一步大規(guī)模純化工藝開發(fā)艾滋病毒樣顆粒等生物制品提供了極有價值的支持。因此，微濾膜適合用于大規(guī)模疫苗分離純化，膜孔徑和剪切力是關(guān)鍵選擇條件。

2.3.2 超濾 在疫苗生產(chǎn)過程中，超濾技術(shù)逐步取代了傳統(tǒng)的透析技術(shù)，可用于濃縮、透析或分子洗凈。超濾分離主要是基于篩分原理，但有些情況下受到粒子荷電性的影響。超濾膜的孔徑范圍為0.001～0.05 μm，它可以分離分子量從1～1 000 kDa的可溶性大分子物質(zhì)，操作壓力范圍為0.1～1 MPa[25，26]。經(jīng)過超濾，在較短的時間內(nèi)可完成抗原組分富集于截留液中，而水和小分子雜質(zhì)在透過液中。膜分離條件溫和，特別適合用于病毒顆粒的濃縮。

一般采用300 kDa的超濾膜進行狂犬病疫苗濃縮；用于流感疫苗超濾濃縮的超濾膜則為50 kDa；采用30～50 kDa的超濾膜進行流腦球菌多糖的分子清洗和濃縮，肺炎球菌多糖的分子洗凈和濃縮采用100 kDa的超濾膜。例如Peter等[27]分別用分子量為30 kDa、50 kDa、100 kDa和300 kDa的超濾膜，采用切向流超濾濃縮埃及伊蚊(Aedesaegypti)病毒顆粒，發(fā)現(xiàn)在100 kDa下，病毒顆粒能夠最大程度的保留在截留液中，同時部分宿主蛋白能夠透過超濾膜，達到初步分離的效果。

此外，由于膜分離過程很容易按比例放大，可用于GMP生產(chǎn)。無細胞百日咳疫苗的生產(chǎn)中，普遍采用離心共純化工藝，但該工藝中使用的傳統(tǒng)流式透析操作時間長、效率低，不利于品質(zhì)控制。而目前新版的GMP對產(chǎn)品在生產(chǎn)中的質(zhì)量控制又提出了更高的要求，因此若采用中空纖維超濾膜對脫毒后的抗原進行純化，回收率、純度及效價等方面是透析法的5～7倍[28]，方便品質(zhì)控制。

膜污染是在超濾過程中所面臨的主要問題，膜污染會造成膜通透性能降低。實際生產(chǎn)過程中需要對膜材料，操作工藝等進行選擇，同時采用機械性能強且耐清洗的膜來獲得穩(wěn)定的膜通量[29]。

超濾技術(shù)雖然可以用于疫苗的分離純化，但分離精度不高，只有當疫苗與雜質(zhì)的分子量差別達到一個數(shù)量級以上時，才可能用超濾技術(shù)實現(xiàn)有效分離。在實際生產(chǎn)過程中，膜分離技術(shù)往往與層析技術(shù)等工藝耦合應用[30]。

2.4 層析技術(shù)

層析技術(shù)在生物制品的分離純化中扮演著不可或缺的角色，因為它克服了普通實驗室規(guī)模的技術(shù)瓶頸，很容易按比例放大，并且分離速度快，具有高度重現(xiàn)性，分離系統(tǒng)密閉無菌，符合所有GMP法規(guī)要求。根據(jù)分離介質(zhì)的特性和樣品分配交換原理不同，可以分為離子交換層析、凝膠過濾層析(分子篩)和親和層析，這3種層析是分離蛋白質(zhì)的經(jīng)典層析技術(shù)[31]。離子交換層析、分子篩常用于疫苗分離純化，而針對不同目標產(chǎn)物的性質(zhì)以及不同的分離階段可選用相應的層析技術(shù)(表4)。

表4 常用層析技術(shù)的特征與應用階段

2.4.1 離子交換 離子交換是基于帶電荷的分子與帶相反電荷的固化離子交換基團之間選擇性地、可逆地結(jié)合的原理,離子交換介質(zhì)由共價結(jié)合帶電荷基團的固體多孔基質(zhì)構(gòu)成。根據(jù)交換介質(zhì)所帶電荷可分為陰離子交換和陽離子交換。在層析過程中，帶電相反的料液與基質(zhì)結(jié)合，被吸附留在層析柱內(nèi)，而未結(jié)合的料液被流穿液體洗脫，進而達到分離的目的。Raksha等[32]僅采用一步陰離子交換色譜法純化Nipah病毒中的糖蛋白，其純度可達90%。

2.4.2 親和層析 親和層析是利用目標產(chǎn)物的特殊物理化學性質(zhì)，設(shè)計特異性配體，利用親和作用力，將其從體系中分離出來的層析技術(shù)。該技術(shù)可有效濃縮稀溶液，純化大分子物質(zhì)，尤其是含量極低且穩(wěn)定性差的活性物質(zhì)，例如利用鎳基對組氨酸的親和性質(zhì)，鎳基親和層析可以分離純化帶有組氨酸標簽的重組表達產(chǎn)物；能夠通過免疫作用吸附能與其配位的生物大分子[33,34]。但同時由于親和配體成本較高，本身需要高度純化又極不穩(wěn)定，導致在純化過程中，配體易失活，增加了分離難度。

2.4.3 疏水層析 由于蛋白質(zhì)與多肽在其疏水性方面各不相同，這種差異構(gòu)成了疏水層析(HIC)分離的基礎(chǔ)。鹽溶液用于調(diào)節(jié)樣品分子與結(jié)合在親水基質(zhì)上的疏水配體間的吸附。由于其具有高選擇性，疏水層析在疫苗的中間純化步驟中有廣泛的應用。其速度、分辨率和載量與離子交換層析相當；并且可作為離子交換和分子排阻層析的替換。不過，介質(zhì)因配給類型、置換程度和基質(zhì)不同而不同。只有通過實驗才能確定最佳的選擇性和結(jié)合強度，同時也取決于操作的規(guī)模和在純化工藝中的位置。Diogo[35]采用經(jīng)丁二醇二縮水甘油醚衍生的瓊脂糖凝膠樹脂從狂犬病毒中分離DNA疫苗，進行60倍放大后發(fā)現(xiàn)疫苗質(zhì)量及生物活性不會隨放大倍數(shù)的增加而改變。

2.4.4 凝膠過濾層析 凝膠過濾層析，又稱分子大小排阻層析，與離子交換、疏水層析及親和層析不同的是，其分離機理是通過分子篩原理，根據(jù)分子大小來分離生物分子[36,37]。常用的凝膠如葡聚糖凝膠(dextran)、聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide)、瓊脂糖凝膠(agarose)以及聚丙烯酰胺和瓊脂糖之間的交聯(lián)物。其中最常用的載體為葡聚糖凝膠中的Sephadex系列。在疫苗純化中，凝膠過濾多用于精制純化或最終純化階段，凝膠過濾主要用于產(chǎn)品脫鹽、更換緩沖溶液，或者去除分子量大于或小于所需產(chǎn)品的雜質(zhì)。

3 疫苗分離純化技術(shù)新趨勢

采用膜分離與層析技術(shù)對疫苗進行分離純化使得傳統(tǒng)分離純化行業(yè)得到了長足發(fā)展，同時與之相關(guān)的新老技術(shù)的結(jié)合及新技術(shù)之間的融合也引起了人們的重視。目前，國內(nèi)外學者在整體柱、移動模擬床色譜、膜色譜等步驟更為簡化、實用性更高的新興技術(shù)研究方面也取得了顯著成果。

3.1 整體柱

整體柱(monolithic column)又稱連續(xù)床(continuous bed)，出現(xiàn)于20世紀80年代末。按制備材料可分為硅膠整體柱、有機聚合物整體柱和無機硅膠-有機聚合物混合基質(zhì)整體柱3類，并且還可以通過進行化學修飾或改變進而得到不同用途的整體柱。

整體柱是通過柱管內(nèi)原位聚合或固化的方法制備得到的具有高度多孔、且相互連通形成通道網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的整體棒狀固定相。這種獨特的結(jié)構(gòu)能夠最大程度的減弱擴散阻力。因其與填充柱相比具有簡單、通透性好和傳質(zhì)快等諸多優(yōu)點而被廣泛應用于電色譜、液相色譜及固相萃取等生物分離分析方面。近年來，整體柱在生物大分子如蛋白、DNA和病毒的分離中也得到一定應用。Banjac等[38]分別采用甲基丙烯酸基質(zhì)的強陰離子型QA、弱陰離子型DEAE以及陽離子型SO3的離子交換整體柱分離流感病毒，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過強陰離子型QA整體柱后，能得到高回收率的流感病毒，同時能夠?qū)⑺拗骷毎械腄NA去除，這為大規(guī)模生產(chǎn)減毒的流感疫苗奠定了基礎(chǔ)。劉海燕等[39]采用原位聚合法制備poly(VC-co-EDMA)整體柱。并通過衍生后處理，加硫酸制成親水柱，能夠成功分離血漿和雞卵黃中的免疫球蛋白。Soares等[40]采用固定了精氨酸配體的整體柱，從蛋白、內(nèi)毒素及RNA中，分離純化質(zhì)粒DNA。通過與普通精氨酸-瓊脂糖親和色譜比較，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA與整體柱的結(jié)合力比普通親和色譜高10%。

3.2 模擬移動床色譜

移動床分離技術(shù)(simulated moving bed, SMB)是基于色譜分離技術(shù)原理，將多根色譜柱串聯(lián)，通過閥切換技術(shù)，進而使流動相循環(huán)的色譜分離裝置。結(jié)合生成工藝，將設(shè)備、電器以及自動控制等多學科技術(shù)集于一身，技術(shù)含量高，設(shè)計復雜，能夠高效廉價地分離一般分離方法(如沉淀、萃取、膜過濾等)難以分離的一些物理性質(zhì)與化學性質(zhì)相似的混合物。評價模擬移動床的指標有：柱數(shù)、柱長、柱徑和柱壓降以及分離強度、純度、濃度、循環(huán)比和料劑比等。

20世紀60年代，Broughton[41]首次通過閥切換技術(shù)改變進樣、流動相注入點等實現(xiàn)逆流操作而設(shè)計出模擬移動床雛形，并應用其成功分離了二甲苯和C8化合物。隨后美國環(huán)球油品公司(UOP)將其商業(yè)化。20世紀90年代隨著工業(yè)自動化的發(fā)展，計算機控制技術(shù)與模擬移動床技術(shù)的結(jié)合，實現(xiàn)了自動化精準控制，技術(shù)更加成熟，逐步走向規(guī)?；?。模擬移動床技術(shù)經(jīng)過50多年的發(fā)展，已成功應用于許多領(lǐng)域，如石油化工行業(yè)以及糖醇行業(yè)。近幾年模擬移動床技術(shù)在生物大分子分離中也有新的進展。如采用模擬移動床技術(shù)能夠在廣泛條件下連續(xù)操作，分離純化流感病毒，產(chǎn)率比多柱串聯(lián)高3.8倍[42]。Piergiuseppe等[43]采用雙柱分子篩模擬移動床分離腺病毒并進行中試實驗，病毒回收率達86%。

與傳統(tǒng)制備色譜相比，移動床分離技術(shù)具有連續(xù)化操作的優(yōu)勢，為進一步自動化提供了可能。同時，其產(chǎn)量大、效率高，大型模擬移動床設(shè)備在生產(chǎn)過程中每年產(chǎn)量可達百萬噸級。

3.3 膜色譜

傳統(tǒng)的色譜分離所用的吸附介質(zhì)多為顆粒狀吸附劑，存在剛性不夠、處理速度低、有效配基的利用率低、吸附過程中色譜柱易堵塞和污染、只適合間歇操作和操作時間長等問題；而傳統(tǒng)的膜分離技術(shù)雖然具有分離速度快、操作壓力低、能耗低等優(yōu)點，但由于其依靠篩分機理，無法將與目標產(chǎn)物分子量相近的組分進行分離。因此膜色譜技術(shù)(membrane chromatography)是色譜技術(shù)與膜分離技術(shù)的結(jié)晶，融合了兩者之長，不但能特異性的分離純化抗體[44]、蛋白質(zhì)[45,46]、病毒以及質(zhì)粒DNA[47,48]，而且能夠?qū)α弦哼M行大規(guī)模處理，具有快速、選擇性強、通透性好、接觸面積大、易于放大等特點，在生物大分子[49,50]的分離與純化中的重要性日益增加。

在傳統(tǒng)的分離過程中，抗原組分的分離通常采用色譜三步純化技術(shù)，如A型流感病毒一般采用陰離子交換色譜偶聯(lián)分子排阻色譜。而流感病毒顆粒較大，具有復雜的分子表面，在色譜柱中擴散速率較低，不利于傳質(zhì)。Kalbfuss等[51]比較了強陰離子交換和弱陰離子交換膜色譜，將流感病毒的回收率提高至80%。Wolff等[52]采用硫酸化的纖維素膜親和色譜，在分離純化牛痘病毒發(fā)酵液中，一步即可去除發(fā)酵液中90%以上的雜蛋白和宿主DNA，其后用偶聯(lián)疏水色譜，可去除99.9%的雜蛋白以及97.5%～99.99%的宿主DNA，雜質(zhì)含量遠低于世界衛(wèi)生組織的標準。Vicente等[53]研究了乙二胺基配體密度對采用離子交換膜色譜分離純化重組棒狀病毒(rBVs)的影響。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，配體密度的降低有利于rBVs在離子交換膜色譜上的吸附-解析，其原因主要為隨著配體密度的降低，洗脫液中的宿主蛋白、雙鏈DNA和非感染性的rBVs濃度也隨之降低，因此rBVs的總回收率比目前標準值提高了大約20%。Tan等[54]采用金屬親和膜色譜技術(shù)，一步法分離了黃病毒屬rDIII重組蛋白，如登革熱病毒(DENV)。相比傳統(tǒng)色譜，膜色譜的分離時間僅為其的三分之一不到，并發(fā)現(xiàn)登革熱病毒與膜色譜的親和力比傳統(tǒng)色譜略高，能夠高效特異性分離純化黃病毒屬rDIII重組蛋白。

4 展望

《中國藥典》(2015)新增多糖結(jié)合疫苗、亞單位疫苗等疫苗品種，對部分標準不完善，臨床不良反應多的生物制品品種加大了調(diào)整力度。這標志著新型疫苗生產(chǎn)技術(shù)在我國的應用和發(fā)展，同時對疫苗生產(chǎn)質(zhì)量控制有了更嚴格的規(guī)定，也體現(xiàn)了分離純化在疫苗制備和生產(chǎn)中的重要性。新型疫苗高純度的生產(chǎn)標準增加了純化技術(shù)路線的復雜性，對疫苗分離純化技術(shù)提出了更高要求。然而，目前大多純化技術(shù)均停留在實驗室規(guī)模，尤其是被廣泛采用的超速離心和親和層析為間斷性操作且造價較高，不適合規(guī)?；B續(xù)生產(chǎn)。此外，純化中采用的蛋白酶抑制劑、洗滌劑等化學或生物試劑，能否徹底去除以及是否會對疫苗的生物活性和免疫原性產(chǎn)生不利的影響也是潛在的問題。因此，現(xiàn)有疫苗分離純化技術(shù)并不能滿足新型疫苗規(guī)?；a(chǎn)的需要，并且目前尚無能單獨承擔疫苗分離純化過程的獨立技術(shù)，所以各種新老技術(shù)的組合，新技術(shù)與新技術(shù)的融合將成為疫苗分離純化的新趨勢。

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Overview of Current Scalable Methods for Vaccine Purification

ZHU Jun-ying, SUN Ye, JIANG Li-hua, QIU Yong-jun, ZHAO Li-ming*

StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering,R&DCenterofSeparationandExtractionTechnologyinFermentationIndustry,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237,China

With the development of the vaccine industry in our country and people’s deepening understanding of vaccine safety and side effects, extracted vaccine cannot satisfied the demand, therefore it is of vital importance to achieve high-purified vaccine. The review summed up the development of vaccine purification at present and its trend at home and abroad. Centrifugation and precipitation, as traditional methods, were widely used in vaccine production. Membrane and chromatography played a significant role in purification. Some novel methods, for instance, monolith, membrane chromatography and simulated moving bed, were highlighted and the work for future was discussed.

vaccine; purification; chromatography; membrane separation

2015-09-15; 接受日期：2015-10-15

國家863計劃項目(2014AA021005)資助。

朱俊穎，碩士研究生，研究方向為分離提取技術(shù)。*通信作者：趙黎明，教授，博士生導師，研究方向為分離提取技術(shù)、食品加工技術(shù)。E-mail:zhaoliming@ecust.edu.cn

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.06.01