Wolbachia對蘋果蠹蛾生殖調(diào)控的作用

馮宏祖，曹 玉，楊明祿，劉慧敏，許建軍塔里木大學/新疆建設兵團南疆特色果樹生產(chǎn)工程實驗室/農(nóng)業(yè)部阿拉爾作物有害生物科學觀測實驗站/塔里木大學南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室,新疆阿拉爾 843300；新疆農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所,新疆烏魯木齊 83009

Wolbachia對蘋果蠹蛾生殖調(diào)控的作用

馮宏祖1，曹 玉1，楊明祿1，劉慧敏1，許建軍2?
1塔里木大學/新疆建設兵團南疆特色果樹生產(chǎn)工程實驗室/農(nóng)業(yè)部阿拉爾作物有害生物科學觀測實驗站/塔里木大學南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室,新疆阿拉爾 843300；2新疆農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所,新疆烏魯木齊 830091

【背景】蘋果蠹蛾是重要的果樹害蟲和檢疫對象。研究顯示，蘋果蠹蛾體內(nèi)所含的Wolbachia屬于具有誘導胞質(zhì)不親和(CI)現(xiàn)象的A組中Dor亞組。本研究目的在于摸清蘋果蠹蛾體內(nèi)的Wolbachia對宿主的生殖調(diào)控是否具有誘導胞質(zhì)不親和的功能。【方法】通過飼喂抗生素消除蘋果蠹蛾體內(nèi)的Wolbachia，比較感染與消除Wolbachia的蘋果蠹蛾生態(tài)適合度以及Wolbachia感染對蘋果蠹蛾生殖的影響?！窘Y果】消除Wolbachia后，蘋果蠹蛾F1、F2代各蟲態(tài)的發(fā)育歷期、產(chǎn)卵量、孵化率和蛹的存活率與對照無顯著差異；Wolbachia對蘋果蠹蛾成蟲的壽命、產(chǎn)卵前期、平均產(chǎn)卵量和性別比例均無影響。不同處理蘋果蠹蛾之間的雜交試驗結果表明，4種雜交的蘋果蠹蛾都能產(chǎn)卵，且卵可以正常孵化。【結論與意義】在自然狀態(tài)下蘋果蠹蛾體內(nèi)的Wolbachia不能誘導其宿主的胞質(zhì)不親和現(xiàn)象。

Wolbachia；蘋果蠹蛾；生殖調(diào)控；胞質(zhì)不親和

沃爾巴克氏體Wolbachia是一類呈母性遺傳的細胞內(nèi)寄生細菌，屬于變形菌綱Proteobacteria的a亞群。近年的研究表明，66%以上的節(jié)肢動物(包括昆蟲、螨類)種類都存在Wolbachia的感染(Hilgenboeckeret al.，2008)，并因其能操縱寄主的生殖而備受關注。Wolbachia對寄主生殖的調(diào)控主要包括胞質(zhì)不親和(Cytoplasmic incompatibility，CI)、孤雌生殖、雌性化和殺雄等，其中最常見的調(diào)控方式為誘導胞質(zhì)不親和(Serbuset al.，2008；Werrenet al.，2008)。Wolbachia導致寄主雜交細胞質(zhì)不親和現(xiàn)象在昆蟲進化和分類學研究中具有重要意義，也為通過遺傳操縱的方法防治昆蟲提供了新思路(董鵬和王進軍，2006)。近年來，我國在Wolbachia的分布和檢測方面做了大量的工作，已在很多昆蟲(螨)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了Wolbachia的感染，并對其系統(tǒng)發(fā)育進行了分析(甘波誼等，2002；苗慧等，2006；宋社吾等，2002；王歡等，2006)。這些研究對全面掌握Wolbachia在我國昆蟲中的感染情況以及分析其對節(jié)肢動物生殖的影響奠定了基礎。

蘋果蠹蛾Cydia pomonella(L.)原產(chǎn)于歐洲，是我國重要的進境植物檢疫性害蟲。目前，在我國新疆全境，甘肅、內(nèi)蒙古、寧夏、黑龍江和吉林等部分地區(qū)發(fā)生，對我國東部蘋果產(chǎn)業(yè)安全生產(chǎn)構成嚴重威脅(張潤志等，2012)。作者前期的研究顯示：蘋果蠹蛾體內(nèi)所含的Wolbachia與膜翅目細蜂科的錘角細蜂Trichopria drosophilae(Perkins)所感染的Wolbachia具有較近的親緣關系(馮宏祖等，2014)，而錘角細蜂所含的Wolbachia屬于具有誘導CI現(xiàn)象的A組中Dor亞組。本研究目的在于摸清蘋果蠹蛾體內(nèi)的Wolbachia對宿主的生殖調(diào)控是否具有誘導胞質(zhì)不親和的功能，以明確此共生細菌對蘋果蠹蛾的生殖調(diào)控產(chǎn)生的作用及影響。

1 材料與方法

1.1 無Wolbachia蘋果蠹蛾品系的培育

蘋果蠹蛾成蟲飼喂1.2～3.0 mg·mL－1頭孢氨芐蜂蜜水溶液，幼蟲飼喂含同樣濃度抗生素的人工飼料，在25℃培養(yǎng)(RH：75%±5%)，16 h光/8 h暗，連續(xù)喂食3代，各代取20頭經(jīng)PCR檢測(馮宏祖等，2014)體內(nèi)有無Wolbachia的存在。

1.2 不同蘋果蠹蛾品系雜交后的繁殖力、卵孵化率和性別比例

將消除共生微生物Wolbachia的蘋果蠹蛾進行4組雜交試驗(1.1結果表明，抗生素飼喂2代后已檢測不出該共生菌，雜交試驗蟲源為飼喂抗生素的第3代蘋果蠹蛾)：♀w－×♂w－、♀w－×♂w＋、♀w＋×♂w－和♀w＋×♂w＋，每個雜交組都配30對剛羽化為成蟲的蘋果蠹蛾，放入直徑為10 cm的無色塑料杯中進行單對飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度為(25±0.5)℃、75%～80%RH。觀察記錄不同雜交組的產(chǎn)卵量、卵孵化率和性別比例。

1.3 消除Wolbachia后蘋果蠹蛾F1、F2代的生態(tài)適合度

在養(yǎng)蟲籠內(nèi)放入蠟紙并接入若干蘋果蠹蛾成蟲，飼喂含抗生素的蜂蜜水溶液，在(25±0.5)℃、75%～80%RH的條件下讓其產(chǎn)卵。24 h后移去養(yǎng)蟲籠中的成蟲，將粘附有卵的蠟紙剪成若干小片，每一小片上只保存1粒卵，置于直徑為10 cm的無色塑料杯中進行單頭飼養(yǎng)；卵孵化后，在杯中加入少量的人工飼料(含抗生素)繼續(xù)培養(yǎng)，羽化為成蟲后雌雄配對，雌蟲產(chǎn)卵后，挑取一定數(shù)量的卵，繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)觀察。試驗一直進行到第1、2代成蟲全部死亡為止。以共生有Wolbachia的蘋果蠹蛾為對照，在不含抗生素人工飼料上飼養(yǎng)。每個處理挑取卵135頭，重復3次。觀察記錄各蟲態(tài)的發(fā)育歷期、產(chǎn)卵量、孵化率、幼蟲和蛹存活率及雌雄壽命和性別比例。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)按項目進行加權平均，用SPSS軟件進行方差分析、顯著性測驗及模型擬合等，并組建實驗種群生命表。

2 結果與分析

2.1 蘋果蠹蛾體內(nèi)Wolbachia的消除

在蜂蜜水和人工飼料中添加抗生素能去除蘋果蠹蛾體內(nèi)的Wolbachia。蘋果蠹蛾經(jīng)抗生素處理后，F(xiàn)1代20頭中只有2頭檢測到Wolbachia的存在，但PCR電泳檢測條帶的亮度不及對照(即田間自然種群)，F(xiàn)2和F3代沒有擴增出相應的條帶，表明Wolbachia已消除。

2.2 Wolbachia對蘋果蠹蛾生殖的影響

雜交試驗結果(表1)表明，4種雜交的蘋果蠹蛾都能產(chǎn)卵，且卵可以正常孵化。根據(jù)細胞質(zhì)不親和的理論，雜交♀w－×♂w＋不能產(chǎn)卵或所產(chǎn)卵不能正常孵化，說明蘋果蠹蛾體內(nèi)的Wolbachia不能誘導其宿主的細胞質(zhì)不親和現(xiàn)象。在所有的雜交組合中，當蘋果蠹蛾雌雄個體同時共生有Wolbachia時產(chǎn)卵量最多(31.6粒)，卵的孵化率最高(84.71%)，產(chǎn)卵期最長(4.2 d)，產(chǎn)卵前期最短(2.9 d)，但與其他組合均無顯著差異(P＞0.05)，說明當蘋果蠹蛾雌雄個體同時被Wolbachia共生時才能達到產(chǎn)卵的最優(yōu)化，可能有利于Wolbachia在該宿主種群的穩(wěn)定存在和傳播。而雜交組♀w－×♂w－的產(chǎn)卵量、孵化率最低。

表1 Wolbachia的感染對蘋果蠹蛾生殖的影響Table 1 Effect of Wolbachia on the reproduction of C.pomonella

2.3 消除Wolbachia后蘋果蠹蛾F1、F2代的生態(tài)適合度

結果表明，消除Wolbachia后蘋果蠹蛾F1、F2代各蟲態(tài)的發(fā)育歷期、產(chǎn)卵量、孵化率和蛹的存活率與對照均無顯著差異，而幼蟲存活率與對照差異顯著(表2)。這主要是由于對照的人工飼料中沒有加抗生素，極易霉變，導致幼蟲死亡率升高。Wolbachia對蘋果蠹蛾的成蟲壽命、產(chǎn)卵前期和性別比例均無影響(表3)。

表2 消除Wolbachia后蘋果蠹蛾各蟲態(tài)的發(fā)育歷期和存活率Table 2 The development duration and survival of C.pomonella after eliminating Wolbachia

表3 消除Wolbachia后蘋果蠹蛾的雌性比、壽命和產(chǎn)卵前期Table 3 The female ratio，life span，preoviposition period of C.pomonella after eliminating Wolbachia

2.4 消除Wolbachia后蘋果蠹蛾F1、F2代的種群生命表

根據(jù)蘋果蠹蛾種群的存活率和成蟲繁殖力，分別組建消除Wolbachia后蘋果蠹蛾F1、F2代的實驗種群特定年齡生命表(表4)，表中的起始卵數(shù)為假定數(shù)，各發(fā)育階段的存活率、雌成蟲比例、單雌產(chǎn)卵量均為實際觀察值。下代產(chǎn)卵量由起始數(shù)量、世代存活率、雌性比和平均產(chǎn)卵量的乘積求得，種群趨勢指數(shù)是預計下代卵量與當代實際卵量的比值。結果表明，CK、F1、F2代的種群趨勢指數(shù)分別為2.73、3.73、2.89，均大于1，表明下代種群數(shù)量都呈增長趨勢。由于人工飼料飼養(yǎng)蘋果蠹蛾中，產(chǎn)卵量低、幼蟲死亡率高(尤其是不加抗生素的對照)的問題未得到解決，3個處理的種群趨勢指數(shù)均比較小。以凈增殖率為指標，感染和未感染W(wǎng)olbachia的蘋果蠹蛾種群的適合度無顯著差異。

表4 消除Wolbachia后蘋果蠹蛾F1、F2代的種群生命表Table 4 The life table of C.pomonella eliminating Wolbachia from F1，F(xiàn)2generation

3 討論

近年來的研究表明，Wolbachia除具有調(diào)控宿主生殖的作用外，對宿主適合度也有不同程度的影響，但其能夠在寄主種群中穩(wěn)定遺傳，更多地依賴于其對寄主產(chǎn)生的生殖調(diào)控作用(潘雪紅等，2007；楊克冬等，2008；Serbuset al.，2008；Werrenet al.，2008)。一些Wolbachia品系能夠提高節(jié)肢動物雌性宿主的生殖力，而雙翅目和膜翅目昆蟲中的Wolbachia能夠降低宿主的生命周期、存活率和運動能力等(Fryet al.，2004)。目前，昆蟲等節(jié)肢動物受Wolbachia感染后，是否存在CI現(xiàn)象、CI產(chǎn)生的機理等是Wolbachia研究最熱門的領域之一。本研究采用抗生素處理的方法去除了蘋果蠹蛾體內(nèi)的Wolbachia，進而研究Wolbachia感染對蘋果蠹蛾生殖及適合度的影響。結果表明，經(jīng)抗生素處理后，F(xiàn)2和F3代中的Wolbachia已清除。消除Wolbachia后蘋果蠹蛾F1、F2代各蟲態(tài)的發(fā)育歷期、產(chǎn)卵量、孵化率和蛹的存活率與對照無顯著差異；Wolbachia對蘋果蠹蛾成蟲壽命、產(chǎn)卵前期和性別比例均無影響。此外，4種雜交的蘋果蠹蛾都能產(chǎn)卵，且卵可以正常孵化，說明在自然狀態(tài)下蘋果蠹蛾體內(nèi)的Wolbachia不能誘導其宿主的細胞質(zhì)不親和現(xiàn)象。這與同蘋果蠹蛾具有親緣關系的錘角細蜂受Wolbachia的影響截然不同，是否與蘋果蠹蛾的生存環(huán)境、共生菌消除方式有關，還需進一步研究。同時，本試驗只對4組蘋果蠹蛾每雌平均產(chǎn)卵量、孵化率進行了統(tǒng)計分析，而Wolbachia對蘋果蠹蛾的影響是否會在其繼代中表現(xiàn)或累計表現(xiàn)，也需要進一步驗證。既然Wolbachia不能誘導蘋果蠹蛾的細胞質(zhì)不親和現(xiàn)象，那么其對蘋果蠹蛾起何作用仍亟待研究。

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楊克冬，張海燕，錢海濤，董輝，張瑩，叢斌.2008.沃爾巴克氏體感染對松毛蟲赤眼蜂生殖力、發(fā)育歷期和存活的影響.中國生物防治，24(3)：210－214.

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(責任編輯：楊郁霞)

The effects of Wolbachia on the reproduction of Cydia pomonella(L.)

Hong-zu FENG1，Yu CAO1，Ming-lu YANG1，Hui-min LIU1，Jian-jun XU2?
1Tarim University/Engineering Laboratory of Featured Fruit Tree in Southern Xinjiang，XPCC/Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pests in Alar，Ministry of Agriculture，P.R.China/Southern Xinjiang Key Laboratory of IPM of Tarim University，Alar，Xinjiang 843300，China；2Institute of Plant Protection，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences，Urumqi，Xinjiang 830091，China

【Background】Codling moth(Cydia pomonella)is the most serious fruit tree and quarantine pest in Chinese orchards. The species is host toWolbachia，Dor subgroup of the A group，which induce cytoplasmic incompatibility.The aim of this study is to find out if theWolbachiainduce cytoplasmic incompatibility to reproductive regulation inC.pomonella.【Method】The relative fitness ofC.pomonellawith activeWolbachiawas compared to individuals in whichWolbachiawas eliminate by antibiotics.【Result】We found no significant differences in development duration，fecundity，hatchability and pupal survival of the F1，and F2generations between the two groups.Wolbachiainfection had no effect on adult life span，the pre-oviposition period，fecundity and female ratio inC.pomonella.Hybridization tests showed that hybrids could lay eggs，and these eggs were normal.【Conclusion and significance】WolbachiainC.pomonelladid not induce host cytoplasmic incompatibility.

Wolbachia；Cydia pomonella(L.)；reproduction manipulation；cytoplasmic incompatibility

10.3969/j.issn.2095-1787.2015.04.009

2015－05－12 接受日期(Accepted)：2015－09－28

國家自然科學基金(31060242)；新疆維吾爾自治區(qū)財政林業(yè)科技專項(新林計發(fā)[2014]40號文)

馮宏祖，男，教授。研究方向：害蟲綜合治理。E-mail：fhzzky＠163.com

?通訊作者(Author for correspondence)，E-mail：xjj＠163.com