荷花NnγGCS基因的克隆及表達(dá)分析

張阿慧， 劉兆磊,①， 顧春筍， 陳發(fā)棣， 蔣甲福， 陳素梅

〔1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院， 江蘇 南京 210095； 2. 江蘇省·中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014〕

荷花NnγGCS基因的克隆及表達(dá)分析

張阿慧1， 劉兆磊1,①， 顧春筍2， 陳發(fā)棣1， 蔣甲福1， 陳素梅1

〔1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院， 江蘇 南京 210095； 2. 江蘇省·中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014〕

以荷花品種‘臺(tái)城拂翠’(Nelumbonucifera‘Taicheng Focui’)嫩葉為材料，采用簡(jiǎn)并引物PCR和RACE技術(shù)得到荷花γGCS基因的全長(zhǎng)cDNA序列，命名為NnγGCS。序列分析結(jié)果表明：NnγGCS基因cDNA序列的全長(zhǎng)為1 801 bp，其開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為1 569 bp，編碼522個(gè)氨基酸殘基。NnγGCS蛋白質(zhì)的理論相對(duì)分子質(zhì)量為59 159.0，理論等電點(diǎn)為pI 6.27，穩(wěn)定指數(shù)為39.60；該蛋白質(zhì)無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，但具有1個(gè)保守的GCS2結(jié)構(gòu)域，并被定位于細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中，說(shuō)明NnγGCS蛋白質(zhì)較穩(wěn)定，并屬于谷氨酰半胱氨酸連接酶家族。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明：荷花NnγGCS氨基酸序列與龍眼(DimocarpuslonganLour.)和黃瓜(CucumissativusLinn.)等雙子葉植物γGCS氨基酸序列的親緣關(guān)系較近，與水稻(OryzasativaLinn.)等單子葉植物γGCS氨基酸序列的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示：NnγGCS基因在荷花各器官中均能表達(dá)，且在嫩葉中的相對(duì)表達(dá)量最高、在莖中的相對(duì)表達(dá)量最低。不同濃度鎘脅迫條件下，NnγGCS基因在荷花嫩葉和須根中的相對(duì)表達(dá)量及表達(dá)趨勢(shì)差異較大；NnγGCS基因的相對(duì)表達(dá)量在嫩葉中總體表現(xiàn)為隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)先下降后上升，在須根中表現(xiàn)為200 μmol·L-1鎘脅迫1 h和400 μmol·L-1鎘脅迫12 h時(shí)顯著高于初始水平、而在其他脅迫時(shí)間與初始水平差異不明顯。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示：NnγGCS基因能夠在洋蔥(AlliumcepaLinn.)表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，說(shuō)明該基因編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。研究結(jié)果顯示一定濃度的鎘脅迫能夠誘導(dǎo)NnγGCS基因的表達(dá)。

荷花;NnγGCS基因; 克隆; 相對(duì)表達(dá)量; 鎘脅迫; 亞細(xì)胞定位

荷花，學(xué)名蓮(NelumbonuciferaGaertn.)，為中國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，花大色艷，且地下莖和蓮子均能夠食用[1]，觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值具佳；此外，荷花還具有降低水體污染[2]和積累重金屬[3-4]的潛能。

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γGCS)是谷胱甘肽(GSH)合成過(guò)程中的限速酶，能夠調(diào)節(jié)GSH的合成并受GSH的反饋調(diào)節(jié)[5]，編碼該合成酶的基因即為γGCS基因。GSH能夠參與調(diào)節(jié)植物的多種抗逆過(guò)程[6]，γGCS基因在植物的抗逆過(guò)程中也有所響應(yīng)，例如受干旱、低溫和過(guò)氧化脅迫等非生物脅迫誘導(dǎo)后γGCS基因的表達(dá)水平發(fā)生明顯變化[7-9]；過(guò)量表達(dá)γGCS基因的芥菜〔Brassicajuncea(Linn.) Czern.〕較其野生型具有更強(qiáng)的鎘積累能力，而且對(duì)重金屬脅迫的耐受力也有所增強(qiáng)[10]；鎘脅迫下番茄(LycopersiconesculentumMiller)[11]和玉米(ZeamaysLinn.)[12]植株的γGCS酶活性分別增強(qiáng)2和8倍，且隨著鎘濃度升高γGCS酶活性逐漸增強(qiáng)。

植物螯合素(phytochelatins，PC)又稱植物螯合肽，是GSH衍生的金屬離子結(jié)合肽，能夠螯合環(huán)境中的重金屬離子，有效降低重金屬對(duì)植物的毒害作用[13]。馮保民等[14]將從荷花中克隆獲得的植物螯合素基因NnPCs轉(zhuǎn)化到擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕中進(jìn)行異源表達(dá)，結(jié)果顯示鎘脅迫下轉(zhuǎn)NnPCs基因的擬南芥中該基因的表達(dá)增強(qiáng)，且其生長(zhǎng)狀況優(yōu)于野生型，體內(nèi)的鎘積累量也顯著高于野生型，說(shuō)明NnPCs基因能夠提高擬南芥植株的重金屬耐受能力和鎘積累能力。

GSH是PC合成的前體，因此，明確荷花γGCS基因的結(jié)構(gòu)和功能對(duì)于研究該基因在積累重金屬和解除重金屬毒害中的作用具有重要意義。鑒于此，作者以荷花品種‘臺(tái)城拂翠’(‘Taicheng Focui’)的嫩葉為實(shí)驗(yàn)材料，采用簡(jiǎn)并引物PCR和RACE技術(shù)獲得荷花γGCS基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)該基因進(jìn)行序列特征、表達(dá)模式和表達(dá)定位分析，以期為進(jìn)一步闡明在荷花積累重金屬的過(guò)程中γGCS基因的作用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試荷花品種‘臺(tái)城拂翠’來(lái)源于南京藝蓮苑有限公司；實(shí)驗(yàn)于2013年4月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉遺傳與育種實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。取長(zhǎng)約15 cm的根狀莖，用等量沙土種植于長(zhǎng)50 cm、寬38 cm、高29 cm的周轉(zhuǎn)箱中，每個(gè)周轉(zhuǎn)箱種植1株；注入自來(lái)水，直至水面超過(guò)沙土表面15 cm；將周轉(zhuǎn)箱置于避雨溫室內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)水面低于沙土表面時(shí)及時(shí)補(bǔ)充水分。

實(shí)驗(yàn)用RNA快速提取試劑盒購(gòu)自北京原平皓生物技術(shù)有限公司，DNA片段純化回收試劑盒(Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2.0)、Real-Time PCR Kit(SYBR Green)、DNaseⅠ、SalⅠ、NotⅠ、PvuⅠ、T4DNA連接酶、LR重組酶和pMD19-T載體均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，cDNA合成試劑盒(SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase)、5′RACE 試劑盒(5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Kit Version 2.0)、pENTR1A載體和pMDC43載體均為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品，大腸桿菌DH5α購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；所有引物的合成和測(cè)序均委托上海捷瑞生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 培養(yǎng)7至8周后，任意選取1株具7或8枚葉片的健康荷花植株，采集鮮嫩葉片并包于錫紙內(nèi)，液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。稱取0.1 g嫩葉樣品，參照RNA快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)上的操作流程提取獲得總RNA樣品，并用DNaseⅠ去除總RNA中殘留的少量DNA；用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA樣品的完整性。按照cDNA合成試劑盒說(shuō)明書(shū)上的操作流程合成cDNA，并使用荷花內(nèi)參基因NnActin檢測(cè)cDNA質(zhì)量。

1.2.2 荷花γGCS基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的洋蔥(AlliumcepaLinn.)、黃瓜(CucumissativusLinn.)、擬南芥和百脈根(LotuscorniculatusLinn.)等植物的GCS氨基酸序列的保守序列設(shè)計(jì)1對(duì)簡(jiǎn)并引物GCS-F和GCS-R，引物序列分別為5′-CCCTCTGGAGACCCTCAYCARACNTG-3′和5′-GAAGATGGTGGTCAGGTGGTTYTCCCARTC-3′；以荷花葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系總體積25 μL，包括1.0 μg·μL-1cDNA模板1.0 μL、10×PCR buffer 2.5 μL、10.0 mmol·L-1Mg2+1.5 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs 2.0 μL、10.0 mmol·L-1正向和反向引物各1.0 μL及5.0 U·μL-1rTaqDNA聚合酶0.2 μL，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體積。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃延伸10 min。

回收擴(kuò)增產(chǎn)物并將其連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃振蕩培養(yǎng)1.5 h；將感受態(tài)細(xì)胞涂布在含有50 μmol·mL-1氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)；挑取單克隆菌落，接種至含有50 μmol·mL-1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)2 h；對(duì)菌液DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，選取含有目的條帶(即γGCS基因保守序列)的單個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

根據(jù)上述克隆獲得的荷花γGCS基因的中間保守序列設(shè)計(jì)2條5′RACE反向引物GCS-51和GCS-52，引物序列分別為5′-CCTTCGCCTTACAACCAGAG-3′和5′-AGCATCATCTGTAGGGGGGC-3′；接頭引物為AAP和AUAP，引物序列分別為5′-GGCCACGCGTCG ACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3′和5′-GGCCACGC GTCGACTAGTAC-3′。并設(shè)計(jì)2條3′RACE正向引物GCS-31和GCS-32，引物序列分別為5′-ATGAGAAG CCACATTTGGACCGACAC-3′和5′-TGGGTTTGAGCA GTATGTGGA-3′；接頭引物為Jiang-T和Jiang-R，引物序列分別為5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTT-3′ 和 5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCC-3′。5′RACE的2輪擴(kuò)增程序均為：94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s、 55 ℃退火30 s、 72 ℃延伸1 min， 共35個(gè)循環(huán)； 最后于72 ℃延伸10 min。 3′RACE的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃延伸7 min。分別對(duì)5′RACE和3′RACE擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收，將其連接到pMD19-T載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞；按照上述篩選方法用Amp進(jìn)行篩選，挑取單個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

將測(cè)序得到的3′RACE片段、5′RACE片段及中間保守片段進(jìn)行拼接，得到荷花γGCS基因的全長(zhǎng)序列，并根據(jù)拼接結(jié)果設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物GCS-WF和GCS-WR，引物序列分別為5′-ATTCTATCACTCGACACTCAAAGCC-3′和5′-TCAATATAACAGCTCCTCAAAAATGGGATCCACGCATTGACCCC-3′。使用上述引物對(duì)荷花γGCS基因的全長(zhǎng)序列進(jìn)行驗(yàn)證，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s、 55 ℃退火30 s、 72 ℃延伸2 min， 共35個(gè)循環(huán)； 最后于72 ℃延伸7 min?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物，將其與pMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞；按照上述篩選方法用Amp進(jìn)行篩選，挑取單個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 序列分析 利用GenBank內(nèi)的ORF finder工具查找序列的開(kāi)放閱讀框(ORF)；采用BLASTp軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，選擇與荷花γGCS氨基酸序列同源的其他植物的γGCS氨基酸序列、用ClustalX 1.83軟件進(jìn)行多重比對(duì)，利用MEGA 5.1軟件中的neighbor-joining (NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。利用在線工具ProtParam(http:∥web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)荷花γGCS基因編碼的蛋白質(zhì)的理論相對(duì)分子質(zhì)量及理論等電點(diǎn)(pI)；采用TMHMM Sever v. 2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域；采用wolf PSORT(http:∥wolfpsort.seq.cbrc.jp/)對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；采用SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)分析該蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.4 荷花γGCS基因的表達(dá)分析 任意選取長(zhǎng)勢(shì)一致的3株荷花，分別采集各單株的劍葉(剛萌出、未展開(kāi)的葉片)、嫩葉(剛剛展開(kāi)的葉片)、成熟葉、葉柄(成熟葉的葉柄)、莖和須根，各稱取0.1 g，用于γGCS基因的組織定量表達(dá)分析，每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)。

在塑料花盆(上口徑25 cm、高28 cm)中分別裝入200和400 μmol·L-1CdCl2溶液2 L，植入正常生長(zhǎng)的荷花植株進(jìn)行脅迫培養(yǎng)，每盆1株；于脅迫培養(yǎng)0、1、3、6、12和24 h時(shí)每處理各選取3株樣株，分別采集每株樣株的嫩葉和須根各0.1 g，經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃保存、備用。

按照RNA快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)上的操作流程分別提取嫩葉和須根樣品的總RNA，取1 μg 總RNA、按照cDNA合成試劑盒說(shuō)明書(shū)上的操作流程合成cDNA第1鏈；將獲得的cDNA稀釋30倍，采用設(shè)計(jì)的定量引物GCS-RTF和GCS-RTR進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，引物序列分別為5′-GCTTATTTCCCAGCCAAGTC-3′和5′-TCTCGGCACTCCATAACAAG-3′，反應(yīng)體系總體積20 μL。參考張計(jì)育等[15]的方法和條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，并用7300 Real Time PCR System軟件和2-ΔΔCt法[16]進(jìn)行分析。

1.2.5 荷花γGCS基因表達(dá)載體的構(gòu)建和亞細(xì)胞定位 以正確提取的質(zhì)粒DNA為模板，采用含酶切位點(diǎn)的引物GCS-SalⅠ和GCS-NotⅠ(引物序列分別為5′-CGCGTCGACATGATGGCGCTTATTTCCCAGCCAAGTCC-3′和5′-AAAGCGGCCGCGATCAATATAACAGCTCCTCAAAAATGGGAT-3′)擴(kuò)增荷花γGCS基因的ORF；回收擴(kuò)增產(chǎn)物，分別用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和NotⅠ對(duì)擴(kuò)增出的目的片段進(jìn)行雙酶切，并利用T4DNA連接酶將其連接到pENTR1A載體中；轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，按照上述篩選方法用Amp進(jìn)行篩選，挑取單個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。提取測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆菌液中的質(zhì)粒DNA，使用PvuⅠ進(jìn)行單酶切后得到線性化產(chǎn)物；利用LR重組酶與pMDC43載體進(jìn)行重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并按照上述篩選方法用Amp進(jìn)行篩選；挑取單個(gè)陽(yáng)性克隆，采用pMDC43載體引物pMDC43-Test-F和pMDC43-Test-R(引物序列分別為5′-CGTCGTCCTTGAAGAAGATGG-3′和5′-TGAATTAGATGGTGATGTTAATGGG-3′)以及γGCS基因特異引物GCS-T-F和GCS-T-R(引物序列分別為5′-CCCTCTGGAGACCCTCAYCARACNTG-3′和5′-GAAGATGGTGGTCAGGTGGTTYTCCCARTC-3′)進(jìn)行PCR檢測(cè)，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證載體構(gòu)建的正確性。

構(gòu)建的pMDC43-γGCS表達(dá)載體含2個(gè)35S啟動(dòng)子和GFP熒光信號(hào)(見(jiàn)圖1)，利用基因槍轟擊法[17]將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到在MS高滲培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 h的洋蔥表皮細(xì)胞中，獲得高效瞬時(shí)表達(dá)，暗培養(yǎng)16 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光。

圖1 荷花γGCS基因表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)圖

Fig. 1 Structure chart of expression vector ofγGCSgene fromNelumbonuciferaGaertn.

2 結(jié)果和分析

2.1 荷花γGCS基因全長(zhǎng)序列分析

利用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增獲得荷花γGCS基因的保守中間片段，長(zhǎng)度為619 bp；其3′RACE和5′RACE片段長(zhǎng)度分別為596和668 bp。將中間片段、3′RACE和5′RACE片段進(jìn)行拼接，得到總長(zhǎng)度為1 801 bp的片段，即為荷花γGCS基因的全長(zhǎng)cDNA序列。序列分析結(jié)果(圖2)表明：該序列包含194 bp的3′非編碼區(qū)、38 bp的5′非編碼區(qū)以及1 569 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)，共編碼522個(gè)氨基酸殘基。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：荷花γGCS基因編碼的蛋白質(zhì)的理論相對(duì)分子質(zhì)量為59 159.0；理論等電點(diǎn)為pI 6.27，穩(wěn)定指數(shù)為39.60，表明該蛋白質(zhì)較穩(wěn)定?？缒そY(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：荷花γGCS蛋白質(zhì)無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，且該蛋白質(zhì)位于細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中。通過(guò)保守結(jié)構(gòu)域分析可知，荷花γGCS蛋白質(zhì)具有1個(gè)保守的GCS2結(jié)構(gòu)域，屬于谷氨酰半胱氨酸連接酶家族。

多重比對(duì)結(jié)果顯示(圖3)：根據(jù)獲得的基因序列推導(dǎo)出的氨基酸序列與百脈根、洋蔥、龍眼(DimocarpuslonganLour.)、巴西橡膠樹(shù)〔Heveabrasiliensis(Willd. ex A. Juss.) Müll. Arg.〕、黃瓜和擬南芥的γGCS氨基酸序列的一致性分別為87%、85%、81%、 80%、78%和76%。據(jù)此確定獲得的序列為荷花γGCS基因，命名為NnγGCS。

*: 終止密碼子 Stop codon.

AC: 洋蔥AlliumcepaLinn.; AT: 擬南芥Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.; BJ: 芥菜Brassicajuncea(Linn.) Czern.; CS: 黃瓜CucumissativusLinn.; LC: 百脈根LotuscorniculatusLinn.; NN: 荷花NelumbonuciferaGaertn.; HB: 巴西橡膠樹(shù)Heveabrasiliensis(Willd. ex A. Juss.) Müll. Arg.

圖3 荷花與其他6種植物的γGCS基因編碼的氨基酸序列的比對(duì)分析

Fig. 3 Comparison analysis on amino acid sequences encoded byγGCSgene fromNelumbonuciferaGaertn. and other six species

2.2 基于γGCS氨基酸序列的荷花與其他植物的系統(tǒng)進(jìn)化分析

基于GenBank中龍眼、百脈根和玉米等15種植物的γGCS氨基酸序列及本研究預(yù)測(cè)的荷花NnγGCS氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖4)。這些植物的γGCS氨基酸序列在進(jìn)化過(guò)程中比較保守，主要分為雙子葉植物和單子葉植物2個(gè)大類，其中，荷花與龍眼和百脈根等10個(gè)種類聚為一組，均為雙子葉植物，與水稻和玉米等5種單子葉植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖中數(shù)據(jù)為置信度 Datums in the figure are confidence. LC: 百脈根LotuscorniculatusLinn.; PV: 菜豆PhaseolusvulgarisLinn.; PS: 豌豆PisumsativumLinn.; CB: 高山離子芥ChorisporabungeanaFisch. et C. A. Mey.; AT: 擬南芥Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.; DL: 龍眼DimocarpuslonganLour.; PC: 豆梨PyruscalleryanaDec.; CS: 黃瓜CucumissativusLinn.; HB: 巴西橡膠樹(shù)Heveabrasiliensis(Willd. ex A. Juss.) Müll. Arg.; ZE: 百日菊Z(yǔ)inniaelegansJacq.; NN: 荷花NelumbonuciferaGaertn.; AC: 洋蔥AlliumcepaLinn.; TA: 小麥TriticumaestivumLinn.; OS: 粳稻Oryzasativasubsp.japonicaKato; ZM: 玉米ZeamaysLinn.; PA: 蘆葦Phragmitesaustralis(Cav.) Trin. ex Steud.

圖4 基于γGCS氨基酸序列構(gòu)建的荷花與其他植物的NJ系統(tǒng)樹(shù)

Fig. 4 NJ phylogenetic tree ofNelumbonuciferaGaertn. and other species based on γGCS amino acid sequence

2.3 荷花NnγGCS基因的表達(dá)分析

以荷花的NnActin基因?yàn)閮?nèi)參，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析荷花NnγGCS基因在不同組織中的表達(dá)狀況，結(jié)果見(jiàn)圖5。分析結(jié)果顯示：荷花的NnγGCS基因在其須根、莖和葉片中均能夠表達(dá)，但表達(dá)量差異明顯，該基因在各組織中的相對(duì)表達(dá)量從高到低依次排序?yàn)槟廴~、葉柄、成熟葉、須根、劍葉、莖。

不同濃度鎘脅迫條件下荷花嫩葉和須根中NnγGCS基因的表達(dá)特征見(jiàn)圖6。由圖6-A可見(jiàn)：在200 μmol·L-1Cd脅迫條件下，嫩葉中NnγGCS基因的相對(duì)表達(dá)量在脅迫1 h時(shí)略升高，脅迫3 h時(shí)明顯下降，脅迫6、12和24 h逐漸升高，脅迫24 h時(shí)較初始水平(脅迫0 h)明顯升高；在400 μmol·L-1Cd脅迫條件下，嫩葉中NnγGCS基因的相對(duì)表達(dá)量在脅迫1和3 h時(shí)持續(xù)下降，脅迫6和12 h時(shí)逐漸升高，脅迫24 h時(shí)又略有下降且低于初始水平。

ML: 成熟葉 Mature leaf; St: 莖 Stem； FL: 劍葉 Flag leaf； TL: 嫩葉 Tender leaf； Pe： 葉柄 Petiole; FR: 須根 Fibrous root.

圖5 荷花不同器官中NnγGCS基因的相對(duì)表達(dá)量

Fig. 5 Relative expression ofNnγGCSgene in different organs ofNelumbonuciferaGaertn.

□: 200 μmol·L-1 Cd; ■: 400 μmol·L-1 Cd.

由圖6-B可見(jiàn)：不同濃度鎘脅迫條件下NnγGCS基因在須根中相對(duì)表達(dá)量的變化與嫩葉中存在較大差異。在200 μmol·L-1Cd脅迫條件下，須根中NnγGCS基因的相對(duì)表達(dá)量在脅迫1 h時(shí)顯著升高，隨后下降至初始水平，之后保持在穩(wěn)定狀態(tài)，變化幅度較??；而在400 μmol·L-1Cd脅迫條件下，須根中NnγGCS基因的相對(duì)表達(dá)量在脅迫1、3和6 h時(shí)均略低于初始水平，在脅迫12 h時(shí)顯著升高，脅迫24 h時(shí)雖有一定下降但仍高于初始水平。

2.4 荷花NnγGCS基因的表達(dá)定位分析

采用洋蔥表皮細(xì)胞對(duì)荷花NnγGCS基因表達(dá)進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果(圖7)顯示：該基因表達(dá)的蛋白質(zhì)熒光僅出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中，并呈分散狀態(tài)，而液泡和質(zhì)膜中沒(méi)有熒光，與該蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)結(jié)果部分一致。雖然該基因在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中均能表達(dá)[18]，但由于本研究所用材料為洋蔥表皮，無(wú)法觀察到葉綠體，因而僅在細(xì)胞質(zhì)中觀察到該基因的表達(dá)。

A，B，C. pMDC43載體 pMDC43 vector: A. 可見(jiàn)光 Visible light; B. GFP; C. 疊加 Merged.

3 討 論

序列分析結(jié)果顯示：荷花NnγGCS蛋白與其他植物的γGCS蛋白具有相同的GCS2結(jié)構(gòu)域，為谷胱甘肽合成過(guò)程中的限速酶。比對(duì)結(jié)果顯示：荷花NnγGCS蛋白的氨基酸序列與百脈根γGCS蛋白的氨基酸序列一致性最高(87%)，與擬南芥γGCS蛋白的氨基酸序列一致性最低(76%)。在進(jìn)化關(guān)系上，荷花γGCS基因?qū)儆陔p子葉植物類，與龍眼和百脈根等雙子葉植物的親緣關(guān)系較近，與水稻等單子葉植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明該基因在進(jìn)化過(guò)程中具有保守性。在進(jìn)化過(guò)程中，γGCS基因的C端氨基酸比較保守，而N端則約有100個(gè)氨基酸殘基存在較大差異。不同植物γGCS基因的ORF編碼的氨基酸殘基數(shù)變化較大(百脈根為435個(gè)、小麥為374個(gè)、荷花為522個(gè))，這種差異不僅體現(xiàn)了不同物種間的差異性，也體現(xiàn)了相同基因的多態(tài)性。

GSH廣泛存在于植物體中，參與調(diào)節(jié)植物的多種抗性機(jī)制[19]。γGCS蛋白為GSH合成過(guò)程中的限速酶，直接影響GSH的生物合成量。表達(dá)分析結(jié)果顯示：NnγGCS基因在荷花的各個(gè)組織器官中均能夠表達(dá)，說(shuō)明該基因在荷花中沒(méi)有組織特異性，能夠在荷花各組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。這一研究結(jié)果與巴西橡膠樹(shù)的相關(guān)研究結(jié)果一致[20]。

荷花NnγGCS基因的表達(dá)量對(duì)重金屬鎘脅迫有一定的響應(yīng)，大體表現(xiàn)為隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)NnγGCS基因的相對(duì)表達(dá)量先下降后升高，與鎘脅迫下番茄中γGCS酶活性的變化趨勢(shì)一致[11]，推測(cè)這可能是由于γGCS酶能夠催化合成GSH，繼而合成PC來(lái)抵御重金屬對(duì)植物的傷害，說(shuō)明鎘脅迫條件下PC合成受鎘脅迫誘導(dǎo)[21-22]。然而，在不同濃度鎘脅迫條件下，荷花須根中NnγGCS基因的表達(dá)模式不同，高濃度(400 μmol·L-1Cd)鎘脅迫條件下該基因的響應(yīng)時(shí)間反而延遲，其響應(yīng)機(jī)制有待深入研究。

利用基因槍轟擊法將NnγGCS基因表達(dá)的蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)中，說(shuō)明該蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮相應(yīng)的生理功能，與該蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)結(jié)果一致。其作用過(guò)程可能是該蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中催化合成GSH，進(jìn)而合成PC，PC與重金屬結(jié)合后被運(yùn)至液泡內(nèi)，從而降低重金屬對(duì)細(xì)胞的傷害[23]。雖然Hell等[24]證實(shí)γGCS基因表達(dá)的蛋白質(zhì)還存在于葉綠體內(nèi)，但是由于本研究所用材料為洋蔥表皮，無(wú)法觀察到該基因在葉綠體中的表達(dá)情況，因而，還需采用合適的材料對(duì)此進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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(責(zé)任編輯： 佟金鳳)

Cloning and expression analysis ofNnγGCSgene fromNelumbonucifera

ZHANG Ahui1, LIU Zhaolei1,①, GU Chunsun2, CHEN Fadi1, JIANG Jiafu1, CHEN Sumei1

(1. College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Institute of Botany, Jiangsu Province and ChineseAcademyofSciences, Nanjing 210014, China),

J.PlantResour. &Environ., 2015, 24(4): 1-9

Taking tender leaf ofNelumbonucifera‘Taicheng Focui’as materials, full-length cDNA sequence ofγGCSgene fromN.nuciferawas obtained by degenerate primer-PCR and RACE technologies, the cDNA sequence is named asNnγGCS. The results of sequence analysis show that full-length of cDNA sequence ofNnγGCSgene is 1 801 bp, its open reading frame (ORF) length is 1 569 bp, which encodes 522 amino acid residues. Theoreticalrelativemolecularmass of NnγGCS protein is 59 159.0, theoretical isoelectric point is pI 6.27, and stability index is 39.60. The protein has no transmembrane structure domain but with one conserved GCS2 domain and the protein is localized in cytoplasm and chloroplast, indicating that NnγGCS protein is stable and belonging to glutamate cysteine ligase modulatory family. The phylogenetic analysis result shows that NnγGCS amino acid sequence ofN.nuciferahas a close relationship with γGCS amino acid sequence of dicotyledon includingDimocarpuslonganLour. andCucumissativusLinn., etc, and has a distant relationship with γGCS amino acid sequence of monocotyledon includingOryzasativaLinn., etc. The amplification results of real-time fluorescence quantitative PCR show thatNnγGCSgene can be expressed in various organs ofN.nucifera, and the relative expression in tender leaf is the highest, that in stem is the lowest. Under cadmium stress with different concentrations, differences in relative expression and expression trend ofNnγGCSgene in tender leaf and fibrous root ofN.nuciferaare great. Relative expression ofNnγGCSgene in tender leaf generally appears firstly decreasing and then increasing with prolonging of stress time, that in fibrous root appears significantly higher than original level when 200 μmol·L-1Cd stress for 1 h and 400 μmol·L-1Cd stress for 12 h, while without obvious difference with the original level at other stress times. Subcellular localization result shows thatNnγGCSgene can express in cytoplasm of epidermal cells ofAlliumcepaLinn., meaning that the protein encoded by this gene plays a role in cytoplasm. It is suggested that Cd stress with a certain concentration can induceNnγGCSgene expression.

NelumbonuciferaGaertn.;NnγGCSgene; cloning; relative expression； Cd stress; subcellular localization

2015-03-17

國(guó)家教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(NCEI-11-0669)； 江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(BE2011325)

張阿慧(1988—)，女，安徽阜陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事荷花耐重金屬的分子生物學(xué)研究。

①通信作者 E-mail： lzl@njau.edu.cn

Q943.2； Q786； Q682.32

A

1674-7895(2015)04-0001-09

10.3969/j.issn.1674-7895.2015.04.01