細粒棘球蚴自發(fā)熒光觀察及光譜特征分析

楊 寧，張 雪，張傳山，呂國棟，李 亮，劉歡元，王 慧

細粒棘球蚴自發(fā)熒光觀察及光譜特征分析

楊 寧，張 雪，張傳山，呂國棟，李 亮，劉歡元，王 慧

目的 研究細粒棘球蚴的自發(fā)熒光現(xiàn)象及共聚焦λ掃描特點，豐富細粒棘球蚴光譜學(xué)和生物學(xué)信息，為后期免疫熒光及醫(yī)學(xué)光子學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。方法 采集自然感染細粒棘球蚴的綿羊肝臟,在無菌條件下收集包囊內(nèi)的原頭蚴進行體外培養(yǎng)，亞甲基藍染色確定原頭蚴活力。激光掃描共聚焦顯微鏡下分別以405 nm、488 nm、514 nm、561 nm等不同激發(fā)光激發(fā)觀察蟲體自發(fā)熒光，并分別對這5種激發(fā)光激發(fā)的細粒棘球蚴做自發(fā)熒光λ掃描分析，同時采用全波長多功能酶標儀下分別以405 nm、488 nm、514 nm、563 nm、633 nm等5種激發(fā)光激發(fā)細粒棘球蚴，繪制其自發(fā)熒光曲線。結(jié)果 經(jīng)亞甲基藍染色測定原頭蚴活力為100%。共聚焦顯微鏡觀察不同激發(fā)光照射下細粒棘球蚴蟲體能發(fā)出多種不同顏色的自發(fā)熒光。在相同的激發(fā)強度及探測器電壓的情況下，以405 nm激光激發(fā)的藍色熒光效果最佳，蟲體大體結(jié)構(gòu)清晰；λ掃描分別以405 nm、488 nm、514 nm、561 nm、633 nm等5種激發(fā)光激發(fā)樣品，相應(yīng)敏感的發(fā)射波長分別為490～520 nm、520 nm及580 nm左右、580～600 nm、610～630 nm和650 nm左右，其中405 nm、488 nm和561 nm激發(fā)效果較好，514 nm、633 nm激發(fā)效果欠佳。全波長多功能酶標儀檢測細粒棘球蚴做自發(fā)熒光曲線與共聚焦顯微鏡結(jié)果基本一致，但所測定的蟲體自發(fā)熒光強度較共聚焦顯微鏡偏低。結(jié)論 激光掃描共聚焦顯微鏡下可觀察到細粒棘球蚴蟲體自發(fā)熒光，其中以405 nm激發(fā)的藍色熒光最強；細粒棘球蚴蟲體自發(fā)熒光光譜較寬，490～520 nm、610～630 nm，405 nm、488 nm和561 nm為較適宜的激發(fā)波長。

細粒棘球蚴；自發(fā)熒光；共聚焦顯微鏡

包蟲病又稱棘球蚴病，是棘球絳蟲寄生于人體及某些動物體內(nèi)所致的一種人獸共患慢性寄生蟲病，嚴重危害人民身體健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。根據(jù)多地的醫(yī)院資料統(tǒng)計，人體包蟲病中大約97%是由感染細粒棘球蚴(Echinococcusgranulosus, Eg)引起的囊性包蟲病(Cystis Echinococcosis, CE)，而泡型包蟲病不超過3%[1]。目前，囊型包蟲病的治療以外科手術(shù)為主，藥物為輔，但手術(shù)對人體損傷大且復(fù)發(fā)率高，長期服用阿苯噠唑等藥物可產(chǎn)生嚴重的不良反應(yīng)，針對細粒棘球蚴的候選抗原分子誘導(dǎo)的保護效果仍不夠理想。因此，通過對細粒棘球蚴的自發(fā)熒光特性的研究和分析進一步發(fā)現(xiàn)其在免疫學(xué)水平或醫(yī)學(xué)光子學(xué)的變化規(guī)律，對于研發(fā)新的檢測或治療方法是非常必要的。

自發(fā)熒光是一種物理現(xiàn)象，當用一種波長的光(如紫外線)照射某物質(zhì)時，這種物質(zhì)會在極短的時間內(nèi)發(fā)射出較照射波長的光(可見光)，這種光被稱為自發(fā)熒光。組織經(jīng)物理或化學(xué)脅迫后發(fā)出的自發(fā)熒光，稱為誘導(dǎo)自發(fā)熒光；而固有的非脅迫的自發(fā)熒光稱為自然自發(fā)熒光?，F(xiàn)今關(guān)于生物組織自發(fā)熒光的研究多集中在植物學(xué)[2]。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，自發(fā)熒光的研究目前主要集中在視網(wǎng)膜疾病和惡性腫瘤的輔助診斷領(lǐng)域[3-5]，有關(guān)動物組織自發(fā)熒光的研究較少[6]。目前，國內(nèi)外關(guān)于棘球絳蟲及棘球蚴組織的自發(fā)熒光尚未見報道。隨著近年來生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)的驟然興起，亟待開展該領(lǐng)域相關(guān)研究工作。本研究借助全波長多功能酶標儀和激光共聚焦掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)對細粒棘球蚴蟲體的自然自發(fā)熒光(以下簡稱自發(fā)熒光)特性進行描述和分析，為后期免疫熒光及醫(yī)學(xué)光子學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑及耗材 徠卡TCS-SP8激光掃描共聚焦顯微鏡、賽默飛世爾Varioskan Flash全波長多功能酶標儀。細粒棘球蚴培養(yǎng)液組分：改良型RPMI-1640培養(yǎng)基(購自Hyclone公司，貨號SH30809.01B)、胎牛血清(FBS，購自Hyclone公司，貨號SV30184.01)、酵母(yeast extract,購自O(shè)XOID公司，貨號LP0021)、葡萄糖(D-glucose anhydrous，購自Solarbio公司，貨號G8150)、磷酸鹽緩沖液(PBS，購自Hyclone公司，貨號SH30256.01B)。所有培養(yǎng)基組分均通過0.22 μm濾器過濾除菌。玻底小皿(購自NEST公司，貨號801001)、96孔細胞培養(yǎng)板(購自Costar公司，貨號3599)。

1.2 細粒棘球蚴的分離培養(yǎng) 細粒棘球蚴包囊采自新疆烏魯木齊市屠宰場包蟲自然感染細粒棘球蚴的新鮮綿羊肝臟，從完整的包囊中，無菌條件下抽取囊液，分離原頭蚴(PSC)[7]，經(jīng)胃蛋白酶37℃消化15～30 min，用無菌PBS洗3遍后，待其自然沉淀，將上清盡量棄去，亞甲基藍染色鑒定蟲體活力，計數(shù)后按2000 PSCs/mL密度進行培養(yǎng)。

1.3 自發(fā)熒光的共聚焦成像 取適量PSC于玻底小皿中，在共聚焦顯微鏡下分別通過藍色(DAPI通道，激發(fā)波長405 nm，檢測波長430～550 nm)、綠色(FITC通道，激發(fā)波長488 nm，檢測波長500～550 nm)、黃色(EYFP通道，激發(fā)波長514 nm、檢測波長525～600 nm)、紅色(TRITC通道、激發(fā)波長561 nm、檢測波長570～700 nm)4個通道進行拍攝，各通道拍攝參數(shù)均保持一致，分別為Zoom factor 放大系數(shù)1.00，掃描頻率200 HZ，Line average 3次，激光強度50%，采用HyD探測器進行信號檢測，探測器電壓200%。

1.4 自發(fā)熒光變化曲線的共聚焦測定 利用玻底小皿在共聚焦顯微鏡下以5種激發(fā)光激發(fā)細粒棘球蚴做自發(fā)熒光λ掃描分析繪制自發(fā)熒光曲線。①激發(fā)波長405 nm，檢測波長430～700 nm；②激發(fā)波長488 nm，檢測波長500～700 nm；③激發(fā)波長514 nm，檢測波長540～700 nm；④激發(fā)波長561 nm，檢測波長580～700 nm；⑤激發(fā)波長633 nm，檢測波長650～750 nm。各通道掃描參數(shù)均保持一致，分別為Detection band width 20 nm，λ-Detection stepsize 20 nm，Line average 3次，掃描頻率600 HZ，激光強度50%，采用HyD探測器進行信號檢測，探測器電壓200%并根據(jù)蟲體形態(tài)劃定ROI。

1.5 自發(fā)熒光變化曲線的全波長多功能酶標儀測定 利用96孔板在全波長多功能酶標儀下以5種激發(fā)光激發(fā)細粒棘球蚴繪制自發(fā)熒光曲線。①激發(fā)波長405 nm，檢測波長430～700 nm；②激發(fā)波長488 nm，檢測波長500～700 nm；③激發(fā)波長514 nm，檢測波長540～700 nm；④激發(fā)波長561 nm，檢測波長580～700 nm；⑤激發(fā)波長633 nm，檢測波長650～750 nm。各通道掃描參數(shù)均保持一致，分別為Measurement time 1000 ms，Excitation band width 5 nm，Optics模式為Bottom，每孔約為1 000個原頭蚴左右，2次重復(fù)。

2 結(jié) 果

2.1 細粒棘球蚴的分離培養(yǎng) 對新鮮采集的細粒棘球蚴進行亞甲基藍染色鑒定蟲體活力并計數(shù)，結(jié)果顯示蟲體活力為100%，每mL蟲體沉淀約達7萬枚PSC，見圖1。

2.2 自發(fā)熒光的共聚焦成像 共聚焦顯微鏡下通過藍色(DAPI通道，激發(fā)波長405 nm，檢測波長430～550 nm)、綠色(FITC通道，激發(fā)波長488 nm，檢測波長500～550 nm)、黃色(EYFP通道，激發(fā)波長514 nm、檢測波長525～600 nm)、紅色(TRITC通道、激發(fā)波長561 nm、檢測波長570～700 nm)4個通道進行拍攝，發(fā)現(xiàn)在相同的激發(fā)強度及探測器電壓的情況下，以405 nm激光激發(fā)的藍色熒光效果最佳，蟲體大體結(jié)構(gòu)清晰，561 nm激光激發(fā)的紅色熒光效果及488 nm激光激發(fā)的綠色熒光效果其次，514 nm激光激發(fā)的黃色熒光較弱，見圖2。

(10 × object glass)

(A)可見光；(B) 405 nm激發(fā)；(C) 488 nm激發(fā)；(D)514 nm激發(fā)；(E)561 nm激發(fā)

2.3 自發(fā)熒光變化曲線的共聚焦測定 共聚焦顯微鏡下掃描分別以5種激發(fā)光激發(fā)細粒棘球蚴做自發(fā)熒光λ掃描分析繪制自發(fā)熒光曲線。①激發(fā)波長405 nm，檢測波長430～700 nm；②激發(fā)波長488 nm，檢測波長500～700 nm；③激發(fā)波長514 nm，檢測波長540～700 nm；④激發(fā)波長561 nm，檢測波長580～700 nm；⑤激發(fā)波長633 nm，檢測波長650～750 nm。相應(yīng)敏感的發(fā)射波長分別為490～520 nm、520及580 nm左右、580～600 nm、610nm～630 nm和650 nm左右，其中405 nm、488 nm和561 nm激發(fā)效果較好。514 nm、633 nm激發(fā)效果欠佳，自發(fā)熒光曲線見圖3。

(藍色)405 nm激發(fā)；(綠色)488 nm激發(fā)；(黃色)514 nm激發(fā)； (紅色)561 nm激發(fā)；(紫色)633 nm激發(fā)

2.4 自發(fā)熒光變化曲線的全波長多功能酶標儀測定 全波長多功能酶標儀以5種激發(fā)光激發(fā)細粒棘球蚴繪制自發(fā)熒光曲線。①激發(fā)波長405 nm，檢測波長430～700 nm；②激發(fā)波長488 nm，檢測波長500～700 nm；③激發(fā)波長514 nm，檢測波長540～700 nm；④激發(fā)波長561 nm，檢測波長580～700 nm；⑤激發(fā)波長633 nm，檢測波長650～750 nm。實驗中發(fā)現(xiàn)全波長多功能酶標儀測定的細粒棘球蚴的自發(fā)熒光曲線其變化趨勢與共聚焦顯微鏡測定的結(jié)果基本一致，但其測定得到的熒光強度與共聚焦顯微鏡測定的結(jié)果相比很弱，見圖4。

3 討 論

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。它在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)，是基礎(chǔ)研究中的一種很好的高靈敏度、高效的示蹤技術(shù)手段。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。然而生物體中自身具有的某些物質(zhì)可在一定波長的光刺激下發(fā)出熒光，稱為自發(fā)熒光。在實際研究中，經(jīng)常會發(fā)生自發(fā)熒光與所選用的熒光抗體之間出現(xiàn)串擾的情況，造成的假陽性及實驗結(jié)果的判讀上的困難，如果在選擇熒光抗體上合理的規(guī)避所要研究的生物體的自發(fā)熒光是每一位研究人員都需要考慮的問題。本文所得到細粒棘球蚴的蟲體自發(fā)熒光的變化規(guī)律將有助于指導(dǎo)囊性包蟲病基礎(chǔ)研究中熒光抗體的合理選擇。

生物組織自發(fā)熒光的主要物質(zhì)來源有氨基酸、結(jié)構(gòu)蛋白、酶和輔酶、維生素、類脂物和卟啉等，生物熒光光譜學(xué)性質(zhì)是不同組織、不同結(jié)構(gòu)、不同生化和物化特性等生物組織本質(zhì)信息的真實反映[8]。近年來，利用生物組織的光學(xué)特性來判別組織性質(zhì)和功能已成為生物醫(yī)學(xué)研究和診斷的一個重要手段[9-10]，在囊性包蟲病研究領(lǐng)域開展免疫學(xué)、生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)工作對包蟲病的診斷防治研究有著積極意義，細粒棘球蚴的不同應(yīng)激狀態(tài)或免疫狀態(tài)下的自發(fā)熒光有何變化規(guī)律，未來是否可能通過觀察蟲體自發(fā)熒光的變化而進行藥效學(xué)或醫(yī)學(xué)診斷學(xué)研究將是一個具有吸引力的切入點[11]。

(A) 405 nm激發(fā)；(B)488 nm激發(fā)；(C)514 nm激發(fā)；(D)561 nm激發(fā)；(E)633 nm激發(fā)；(F)陰性對照

自發(fā)熒光變化曲線是衡量生物體在受到一種激發(fā)光刺激后機體內(nèi)的某些熒光物質(zhì)在整個光譜中發(fā)射熒光的變化規(guī)律的一種方式。本實驗采用激光掃描共聚焦顯微鏡、全波長多功能酶標儀兩種不同儀器對細粒棘球蚴蟲體的自發(fā)熒光變化曲線進行了測定。測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種測定方式所得到的蟲體的自發(fā)熒光變化趨勢基本一致，但在同樣的激發(fā)波長下，激光掃描共聚焦顯微鏡所測定的自發(fā)熒光強度要遠高于全波長多功能酶標儀。通過對兩種儀器測定原理及參數(shù)設(shè)定的比較發(fā)現(xiàn)，在大部分測定參數(shù)水平上，兩個儀器是沒有太大區(qū)別的，但全波長多功能酶標儀的檢測帶寬(Detection band width)只能為1 nm的范圍，而激光掃描共聚焦顯微鏡則可以自由設(shè)定并且本實驗中所設(shè)定的檢測帶寬(Detection band width)為20 nm，由于生物體的自發(fā)熒光，特別是細粒棘球蚴的自發(fā)熒光發(fā)射波長分布范圍較寬，從430 nm至650 nm都有，并且有數(shù)個主要分布范圍。由此，我們考慮細粒棘球蚴的自發(fā)熒光基本上是平均分布于每nm的光譜范圍內(nèi)的，僅僅1 nm上的自發(fā)熒光強度并不高，因此，全波長多功能酶標儀在細粒棘球蚴的自發(fā)熒光強度的檢測上并不是很好的選擇，只能用作定性的熒光分析。激光掃描共聚焦顯微鏡下可觀察到細粒棘球蚴蟲體自發(fā)熒光，其中以405 nm激發(fā)的藍色熒光最強；細粒棘球蚴蟲體自發(fā)熒光光譜較寬，主要分布于490～520 nm、610～630 nm。在應(yīng)用免疫熒光技術(shù)研究細粒棘球蚴時應(yīng)避免選擇綠色熒光及淺紅色熒光(如FITC、TRITC、GFP等)，以免自發(fā)熒光與所選用的熒光抗體之間出現(xiàn)串擾，造成實驗結(jié)果的假陽性。

綜上，本文首次描述了細粒棘球蚴體外培養(yǎng)條件下自發(fā)熒光及其共聚焦λ掃描特點，確定了細粒棘球蚴蟲體自發(fā)熒光在不同波長的光激發(fā)下的敏感范圍，為未來囊性包蟲病在生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)及熒光基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的工作奠定了基礎(chǔ)，同時對未來在囊性包蟲病研究中的熒光抗體的選擇具有重要的指導(dǎo)意義。

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Autofluorescence and spectrum characteristics ofEchinococcusgranulosusculturinginvitro

YANG Ning,ZHANG Xue,ZHANG Chuan-shan,LYU Guo-dong,LI Liang,LIU Huan-yuan,WANG Hui

(ClinicalMedicalResearchInstitute,FirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,XinjiangUygurAutonomousRegion,Urumqi830054,China)

The objective of this study was to illustrate the autofluorescence phenomenon and scanning confocal λ characteristics ofEchinococcusgranulosus(Eg) culturedinvitro, which can not only rich the spectroscopy and biological information ofEg, but also lay a foundation for study the immunofluorescence and medical photonics. Protoscoleces (PSC) ofEgwere aspirated and pooled from sheep liver hydatid cysts collected from a slaughterhouse. The PSC viability was determined by Methylene blue staining. The autofluorescence of endocyst were observed through the confocal microscope excited respectively by 405 nm, 488 nm, 514 nm, and 561 nm. The autofluorescence curve was measured by thermo Varioskan Flash respectively by 405 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, and 633 nm. The λ scanning analysis was executed by confocal respectively by 405 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, and 633 nm to measure the autofluorescence curve. TheEgexcited by different excitation light through confocal showed different colors autofluorescence. Under the same excitation intensity and detector voltage condition, blue fluorescence showed the best fluorescence effect and clearer structure which excited by 405 nm laser. Scanning respectively by five different excitation lights, the corresponding sensitive emission wave lengths scope were 490-520 nm, around 520 nm and 580 nm, 580-600 nm, 610-630 nm, and around 650 nm, respectively. The 405 nm, 488 nm and 561 nm excitation effect were better than that of the 514 nm and 633 nm. The autofluorescence curve detected by Microplate Reader were basically as same as that by confocal, although the intensity detected by Microplate Reader were lower. The results indicated that the best excitation light to detect the autofluorescence ofEgis 405 nm, which showed blue fluorescence. The autofluorescence spectrum ofEgis wide, mainly in 490-520 nm and 610-630 nm. The better excitation wave lengths are 405 nm, 488 nm and 561 nm.

Echinococcusgranulosus; autofluorescence; confocal

Wang Hui, Email: wang_hui6319@sina.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.007

國家自然科學(xué)基金項目(No. 81201304) ，新疆維吾爾自治區(qū)包蟲病基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)重點實驗室開放課題(XJDX0202-2013-9)聯(lián)合資助

王慧，Email: wang_hui6319@sina.com

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院，烏魯木齊 830054

R383.3+3

A

1002-2694(2015)03-0222-05

Funded by the National Natural Science Foundation of China (No. 81201304) and the Xinjiang Key Laboratory of Hydatid Fundamental Medicine (No. XJDX0202-2013-9)

2014-04-10；

2014-08-05