嗜水氣單胞菌鞭毛蛋白基因flaB的克隆、表達及其免疫原性分析

沈雪飛，翟新新，溫振才，孫 真，賈生美，盧 強

嗜水氣單胞菌鞭毛蛋白基因flaB的克隆、表達及其免疫原性分析

沈雪飛，翟新新，溫振才，孫 真，賈生美，盧 強

目的 克隆、表達及純化嗜水氣單胞菌鞭毛FlaB蛋白，比較了它與天然鞭毛蛋白的抗原性，為以后魚類弧菌病的防治及其疫苗的制備奠定了基礎。方法 利用PCR擴增出嗜水氣單胞菌鞭毛蛋白基因flaB，經確定后將該基因克隆到原核表達載體pET-30a中，在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得了表達，并用電洗脫法對表達的蛋白進行純化，用純化的重組蛋白免疫家兔制備抗血清，并進行Western-blot分析。結果 嗜水氣單胞菌鞭毛蛋白flaB基因全長912 bp，編碼303個氨基酸，預測分子量為32 kDa，Western-blot結果表明兔抗FlaB血清不僅能與重組鞭毛蛋白發(fā)生反應，而且能與天然鞭毛蛋白發(fā)生反應。結論 鞭毛蛋白FlaB可能是嗜水氣單胞菌的重要保護抗原之一，為下一步疫苗的制備奠定了基礎。

嗜水氣單胞菌；鞭毛；蛋白

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)屬于弧菌科、氣單胞菌屬，是水生環(huán)境中普遍存在的一種細菌，能夠感染多種水生和陸生動物，是一種重要的人-獸-魚共患的細菌病原菌[1]。嗜水氣單胞菌可以使淡水魚類發(fā)生癤病和敗血癥，給水產養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重危害[2]。人感染致病性嗜水氣單胞菌后會發(fā)生腹瀉、食物中毒、繼發(fā)感染的臨床癥狀，嚴重威脅到人類公共衛(wèi)生安全[3-5]。

與其他生物一樣，嗜水氣單胞菌的致病性與其產生多種毒力因子有著直接關系，毒素是其致病的物質基礎。細菌粘附于宿主細胞表面是對機體感染致病的先決條件，對細菌侵入宿主并有效發(fā)揮毒素等作用具有重要的意義[6]。鞭毛就是一種重要的粘附因子，它在黏附、生物膜形成以及病原菌定植過程中起著重要作用[7-8]。

鞭毛的形成過程是一個復雜的一連串的事件，需要協(xié)調表達超過50個基因編碼的結構亞單位、調節(jié)蛋白和化學傳感器。根據(jù)在組裝蛋白時間順序可以把這些基因分為3類：早期、中期和晚期基因[9-10]。早期基因編碼的調節(jié)蛋白，控制整個調節(jié)子的表達；中期基因編碼鉤狀體、基礎小體、傳輸結構和誘導晚期表達的調節(jié)蛋白；晚期基因表達包括絲狀體、鞭毛馬達和趨化蛋白因子。

鞭毛由基體、鉤狀體和絲狀體三部分組成[11]。(1)基體：基體由MS-C環(huán)、轉動桿和LP環(huán)組成。位于鞭毛根部，嵌在細胞壁和細胞膜中，其功能是一個可逆旋轉馬達，給鞭毛的運動提供動力。(2)鉤狀體：鞭毛伸出細胞壁后的部分稱為鉤狀體，高度彎曲的管狀結構，可以改變鞭毛運動方向。(3)絲狀體：絲狀體呈絲狀連接在鉤狀體后面，由FlaA和FlaB兩個鞭毛蛋白單體緊密纏繞而成。其中鞭毛絲狀體蛋白基因位于Region2區(qū)上，主要有FlaA和FlaB兩個蛋白單體組成。本研究克隆和表達了嗜水氣單胞菌鞭毛FlaB蛋白，用純化的鞭毛蛋白免疫家兔制備了抗血清，Western-blot對其免疫原性進行了分析，為嗜水氣單胞菌疫病的防治及其疫苗的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新西蘭大白兔，購自長春生物制品所。

1.2 菌株和質粒 嗜水氣單胞菌AHCS-02和嗜水氣單胞菌鞭毛蛋白由本實驗室保存，嗜水氣單胞菌天然鞭毛蛋白由本實驗室純化保存，E.coliDH5α、BL21(DE3)、表達載體pET-30a均有本實驗室保存，克隆載體pUC18購自TaKaRa公司。

1.3 主要試劑 T4 連接酶，Taq plus聚合酶，限制性內切酶EcoR I、XhoI，DNA Marker DL 5 000 bp/2 000 bp 均購自TaKaRa公司、細菌基因組提取試劑盒 購自北京康為世紀生物科技公司、DNA凝膠回收試劑盒，質粒提取試劑盒 均購自杭州愛思進生物公司、蛋白Marker購自北京全式金生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌基因組DNA的提取 用康為世紀公司細菌基因組DNA提取試劑盒提取嗜水氣單胞菌基因組DNA，操作步驟按照說明書進行。

1.2.2 目的基因flaB的擴增 根據(jù)GenBank中登錄的嗜水氣單胞菌AH-1鞭毛基因flaB的序列(DQ650656.1)，利用Primer Premier 5.0設計一對引物上游引物：上游引物：5′-CGGAATTCATGGCCATGTACATCAAC-3′(下劃線為EcoR I酶切位點)，下游引物：5′-CGCTCGAGACCCAGCAGGGACAG-3′(下劃線為XhoI酶切位點)，以上引物由華大基因公司合成。擴增條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，51 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s。30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定并回收目的條帶。

1.2.3 構建原核表達載體 用EcoR I和XhoI雙酶切PCR產物和表達載體pET-30a，將膠回收的PCR酶切產物和載體酶切產物進行連接，構建融合表達質粒pET30a-flaB，轉入感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)細胞中，涂于含有20 μg/mL的卡那霉素LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取陽性克隆進行雙酶切鑒定，并送至長春庫美生物公司測序。

1.2.4 誘導表達條件的優(yōu)化 取測序正確的陽性菌液50 μL接種到若干個5mLKan+(50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)1～1.5 h至OD600值0.6～0.8時，取出一管作未誘導對照，然后進行表達條件的優(yōu)化：實驗組加入IPTG終濃度為(mmol/L)一次為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0在37 ℃，160 r/min誘導6 h；同時空載體pET-30a(+)轉化的E.coliBL21(ED3)作誘導和未誘導對照。

1.2.5 表達形式的鑒定 將表達菌以1∶100的比例加入Kan+(50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩揺菌至OD值為0.6～0.8時，加入終濃度為0.6 mmol/L的IPTG誘導表達，6 h后收集菌液。4 ℃,5 000 r/min離心20 min，用PBS懸浮沉淀，置冰浴中，超聲破碎使菌液變的清亮，離心分別收集上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳。

1.2.6 重組蛋白的純化及Western-blot鑒定 重組質粒pET30a-flaB轉化E.coliBL21(ED3)菌后，經終濃度為0.6 mmol/L的IPTG誘導6 h后，超聲裂解提取包涵體經SDS-PAGE電泳后，用KCI染色，切取目的條帶后，利用電洗脫法將目的蛋白洗脫出來，后經透析、濃縮純化出重組鞭毛蛋白，用抗His標簽的二抗對目的蛋白進行Western鑒定。

1.2.7 抗體的制備 以純化的重組鞭毛蛋白包為抗原，免疫家兔，具體免疫方案如下：初次免疫用500 μg的抗原和等體積的弗氏完全佐劑進行乳化，采取背部皮下多點免疫，12 d后耳靜脈采血測效價；二免，用250 μg的抗原與等體積的弗氏不完全佐劑進行乳化，背部皮下多點免疫，12 d后耳靜脈采血測效價；第4次免疫后的第7 d進行心臟采血，37 ℃靜置1 h后，4 ℃靜置過夜，10 000 g離心10 min，上清即為兔抗重組鞭毛蛋白的免疫血清，吸取上清分裝于1.5 mL的離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 重組蛋白的免疫原性分析 將誘導后的重組鞭毛蛋白和天然鞭毛蛋白進行SDS-PAGE電泳后，將其上的蛋白轉移到NC膜，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜。加入抗血清(兔抗FlaB血清)，室溫孵育1～2h，用TBST洗3次(5 min/T)，加入1∶10 000倍稀釋的HRP標記的二抗(羊抗兔)，室溫孵育1 h；用TBST洗3次(5 min/T)，蛋白檢測。

2 結 果

2.1 目的基因電泳分析 PCR產物進行瓊脂糖核酸電泳，發(fā)現(xiàn)有912 bp大小的特異性條帶，與預期相符，見圖1；重組表達載體pET-30a-flaB雙酶切電泳，發(fā)現(xiàn)有912 bp大小的目的條帶，見圖1，說明目的基因成功的連接到表達載體上。

1：flaB基因PCR產物；

2.2flaB的誘導表達及表達條件的優(yōu)化 pET30a-flaB質粒轉入BL21(DE3)宿主菌后，用不同濃度的IPTG誘導后，進行全菌SDS-PAGE電泳分析，結果表明：IPTG誘導后的工程菌目的蛋白均有表達，在38 kDa處有一新的蛋白帶與預期的分子量相符。而未誘導的陽性菌和未誘導的空載體轉化的BL21(DE3)菌均沒有相應的蛋白帶，見圖3。

2.3 表達形式的鑒定 誘導8 h后的培養(yǎng)基，菌體離心、超聲破碎后，經SDS-PAGE電泳分析。結果表明：經0.6 mmol/L IPTG，37 ℃誘導表達8 h，重組蛋白絕大部分以包涵體形式存在，可溶性蛋白較少，見圖4。

2.4 FlaB蛋白的純化及鑒定 見圖5。

1：pET-30a-flaB的雙酶切產物

M：蛋白marker(14-100kDa)；1：未誘導的pET-30a2：誘導的pET-30a；3：未誘導的30a-flaB4-8：不同IPTG濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L)誘導的30a-flaB

M：蛋白marker(14-100 kDa)；1：誘導上清 2：誘導包涵體沉淀

2.5 重組蛋白免疫原性分析 見圖6。

3 討 論

嗜水氣單胞菌在自然環(huán)境中分布很廣，尤其是在水環(huán)境中最多。嗜水氣單胞菌疾病的頻發(fā)不僅給我國淡水養(yǎng)殖業(yè)帶來了重大經濟損失，而且還嚴重威脅到人類公共衛(wèi)生安全。目前，對該病的防治主要依靠化學藥物和抗生素，盡管抗生素可以用于細菌性魚病的治療，但是重復使用抗生素可產生耐藥性致病菌或抑制魚的免疫系統(tǒng)[12]。此外，藥物的殘留危害到消費者的飲食健康，因而開發(fā)高效、安全的疫苗成為今后防治嗜水氣單胞菌疾病的重要方向。Snieszko和Schaperclaus早期嘗試用疫苗免疫防治魚類細菌性疾病。在20世紀60年代， Klontz和Fryer通過口服免疫防治虹鱒魚的“紅嘴病”[13]。嗜水氣單胞菌有極生單鞭毛，其主要成分是蛋白，在感染與免疫以及細菌分類鑒定等方面發(fā)揮重要的作用，特別是鞭毛蛋白的免疫原性在疫苗開發(fā)及疫病防控方面有重要的實際意義。

本研究擴曾出嗜水氣單胞菌鞭毛flaB全長基因，并成功誘導表達出FlaB鞭毛蛋白，制備了兔抗FlaB多克隆抗體，初步探討了重組鞭毛蛋白FlaB的免疫原性，為新型抗菌素及疫苗研發(fā)奠定基礎，對魚類疾病的防治具有一定的指導意義。

M：蛋白Marker(14-100kDa);1：全菌蛋白；2：純化后的包涵體3：純化后蛋白Western-blot

M：蛋白Marker；1：陰性對照;2：重組鞭毛蛋白FlaB；3：天然鞭毛蛋白

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Cloning, expression and antigenicity analysis of recombinantAeromonashydrophilaflagellar FlaB protein

SHEN Xue-fei,ZHAI Xin-xin,WEN Zhen-cai,SUN Zhen,LU Qiang

(KeyLaboratoryforZoonosis,MinistryofEducation,InstituteofZoonosis,JilinUniversity,Changchun130062,China)

We expressed flagellar FlaB protein ofAeromonashydrophilainE.coliand analyzed its immunogenicity. In this study, the flagellar geneflaBofAeromonashydrophilawas amplified by PCR from theAeromonashydrophilagenome, and cloned into the prokaryotic expression vector pET30a. After being sequenced, the recombinant plasmid pET30a-flaBwas transformed into strain BL21 (DE3), and FlaB protein was expressed by the recombinant strain after IPTG induction. By SDS-PAGE and electrophoresis elution purification, the purificated recombinant protein was inoculated to New Zealand rabbits. The full-length ofAeromonashydrophilaFlaB flagellin genes was 912 bp, which encodes 303 amino acids. The molecular weight of the induced protein was about 32 kDa as expected. Our result showed that the rabbit antibodies raised against the recombinant could recognize the natural flagellin and the recombinant protein, suggesting flagellin FlaB may be an important protective antigen ofAeromonashydrophilaand has potential for a novel target for vaccine development.

Aeromonashydrophila; flagellar; protein

Lu Qiang, Email: qlu@jlu.edu.cn

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.002

國家自然科學基金項目(30972277)；吉林大學基本科研業(yè)務費項目(200903250)

盧強， Email: qlu@jlu.edu.cn

吉林大學人獸共患病研究所，長春 130062；

R378.3

A

1002-2694(2015)03-0199-04

Supported by the National Science Foundation of China(30972277)；the Fundamental Research of Jilin University(200903250)

2014-05-20；

2014-07-31