貢山厚樸多酚含量的測定及其抗氧化活性研究

李世源，王 韋，戴建輝，蔣孟圓，曾曉麗，李新明，黃相中,2，田 凱

(1.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省生物高分子功能材料工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650500；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050)

貢山厚樸多酚含量的測定及其抗氧化活性研究

李世源1，王 韋1，戴建輝1，蔣孟圓1，曾曉麗1，李新明1，黃相中1,2，田 凱1

(1.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省生物高分子功能材料工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650500；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050)

采用冷浸提取法、回流提取法及超聲提取法對貢山厚樸皮進(jìn)行提取，對提取物中的多酚類化合物含量進(jìn)行了測試，結(jié)果表明回流提取法的多酚提取率最高，為10.2%. 利用微生物紙片法、DPPH法以及連苯三酚紅褪色光度法對貢山厚樸乙醇提取物的抗氧化性能進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)該提取物對活性氧(主要是1O2)有中等強(qiáng)度的清除活性，對DPPH自由基和羥自由基有較好的清除活性，其半數(shù)清除濃度分別為0.744 mg/mL及1.805 mg/mL.

貢山厚樸；多酚類；抗氧化活性；微生物紙片法

貢山厚樸 (MagnoiarostrataW.W.Smith ) 又名云樸、騰沖厚樸，為木蘭科木蘭屬(Magnolia)落葉喬木，在我國只分布在云南和西藏，通常生長于海拔400～2 800 m的山地闊葉林中[1]. 貢山厚樸在云南和西藏是常用的中藥材品種，根據(jù)中華草本記載，其主要用于溫中化濕，行氣消積[2]，目前，還沒有對其化學(xué)成分研究的相關(guān)報道. 植物多酚是一種植物體內(nèi)的多元酚類次生代謝產(chǎn)物，主要存在于植物體的皮、根、葉、殼和果實(shí)中[3-4]. 研究表明植物中多酚類成分具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗微生物、調(diào)血脂和降血糖等活性[5-9]. 為了更好的開發(fā)利用貢山厚樸，對貢山厚樸中多酚含量及抗氧化性能進(jìn)行了研究.

1 材料與儀器

貢山厚樸樣品于2010年9月采自云南保山，經(jīng)云南民族大學(xué)楊青松副教授鑒定為貢山厚樸(MagnoiarostrataW.W.Smith)，標(biāo)本存于云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院標(biāo)本室. 枯草桿菌，實(shí)驗(yàn)室提供；玫瑰紅，購于昆明化玻站；貢山厚樸樣品粉碎備用；沒食子酸，北京市通廣精細(xì)化工公司生產(chǎn)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，日本東京化成株式會社生產(chǎn)；連苯三酚為北京利德曼公司生產(chǎn)；丙酮、三氯化鐵、鐵氰化鉀，無水乙醇，三氯化鐵，鐵氰化鉀均為分析純. WFJ-7200型分光光度計(jì)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 貢山厚樸中多酚類化合物的提取

取貢山厚樸樣品粉碎物3份，每份10 g，分別用冷浸提取法、加熱回流提取法和超聲提取法進(jìn)行提取.3種提取方法均是采用工業(yè)乙醇連續(xù)提取3次，減壓濃縮得到浸膏，放于室內(nèi)使其自然晾干.

2.2 多酚含量的測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密稱取沒食子酸對照品25 mg于50 mL容量瓶中，60%的乙醇溶解并加之刻度，得到0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液. 精密吸取該溶液2.5 mL于25 mL的容量瓶中，加入60%的乙醇至刻度，配成50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液. 參照文獻(xiàn)[9]，精密吸取沒食子酸對照品溶液0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mL于25 mL比色管中，依次加入0.5 mL的0.100 mol/L三氯化鐵，0.50 mL的008 mol/L鐵氰化鉀0.5 mL的0.10 mol/L鹽酸，用60%乙醇定容，得到不同濃度的對照品溶液. 置于暗處15 min后，以蒸餾水為參比液，用WFJ-7200型分光光度計(jì)于695 nm處測定吸光度，以沒食子酸質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2.2.2 樣品的測定

取適宜體積貢山厚樸樣品的各種方法提取液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備操作步驟于695 nm波長進(jìn)行吸光度的測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每種提取方法多酚類化合物的含量及提取率.

2.3 抗氧化活性的測定

2.3.1 微生物法分析樣品對活性氧(主要是1O2)的清除能力

1) 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備.以無水乙醇為溶劑，配制質(zhì)量濃度為c0=3.60 mg/mL，c1=1.80 mg/mL，c2=0.90 mg/mL的玫瑰紅溶液，避光保存. 同樣，配制質(zhì)量濃度為0.150 mg/mL，0.075 mg/mL，0.038 mg/mL的貢山厚樸的乙醇溶液. 按照體積比1∶1配制不同濃度的玫瑰紅和提取物乙醇溶液的混合溶液，玫瑰紅與無水乙醇的混合溶液，避光保存. 圓形濾紙片(直徑9 mm)，配制細(xì)菌培養(yǎng)基.

2) 實(shí)驗(yàn)過程.參照文獻(xiàn)[10]微生物紙片法，將直徑9 mm 的濾紙片浸入混合液片刻后取出，揮盡溶劑后避光保存，將固體培養(yǎng)基加熱熔化，冷卻至 50 ℃ 左右接入枯草桿菌菌種，攪拌均勻至自然冷卻，制成帶菌平整培養(yǎng)面，把浸過混合液的紙片放在培養(yǎng)皿中，使其保持一定距離，放妥后用無菌鑷子輕壓，使緊貼培養(yǎng)基表面，并用 200 W 可見光燈在距培養(yǎng)皿 20 cm 處光照75 min后，再放于 35 ℃ 恒溫箱培養(yǎng) 18 h，取出培養(yǎng)皿，準(zhǔn)確測量抑菌圈直徑. 上述操作除引入、培養(yǎng)細(xì)菌外，均在無菌條件下進(jìn)行.

定義抗氧劑對活性氧表觀抗氧化率S：

2.3.2DPPH法[11]分析樣品對自由基的清除能力

往10mL比色管中依次加入4mLpH6.88 標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽緩沖溶液，4mL0.1777mmol/LDPPH溶液，混勻，再加入一定量質(zhì)量濃度為 1.00mg/mL的抗氧化劑溶液，用蒸餾水補(bǔ)至刻線，充分混勻，10min后在520nm處測量吸光度. 定義抗氧化劑對DPPH自由基的清除率(K)：

式中：Ai為加抗氧化劑反應(yīng)后DPPH溶液吸光度；Aj為不加DPPH，只加抗氧化劑及水的溶液的吸光度；Ac為未加抗氧化劑，只加DPPH及水的溶液的吸光度. 按實(shí)驗(yàn)方法加入不同體積的抗氧化劑(質(zhì)量濃度均為1.25mg/mL)，測出Ai, Aj, Ac，據(jù)此計(jì)算出其相應(yīng)的自由基清除率(K).

2.3.2 連苯三酚紅褪色光度法[11]

往10mL具塞比色管中，依次加入2mLpH9.1 的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液，0.7mL0.0038mol/LEDTA-Fe2+溶液，3.5mL0.000 1mol/L連苯三酚紅溶液，0.7mL體積分?jǐn)?shù)0.6%H2O2溶液，蒸餾水補(bǔ)充至刻線后在25 ℃保溫反應(yīng)30min后(加入以上面各溶液時均需搖勻)，測544nm處的吸光度.設(shè)不加H2O2時的吸光度為A0，加入H2O2后的吸光度為Ab，則羥自由基產(chǎn)生量可用ΔA=A0-Ab來表示. 在體系中加H2O2之前加入一定量的抗氧化劑，測定其吸光度As，則抗羥自由基氧化率為S：

S=(As-Ab)/(A0-Ab)×100 %.

按實(shí)驗(yàn)方法加入不同體積的抗氧化劑(質(zhì)量濃度均為1.05mg/mL)測出As, Ab, A0，計(jì)算出(As-Ab)/(A0-Ab)值，據(jù)此再計(jì)算出其相應(yīng)的抗羥自由基氧化率(S).

3 結(jié)果與分析

3.1 多酚化合物含量測定結(jié)果

3.1.1 用沒食子酸為參比標(biāo)準(zhǔn)來衡量樣品提取液中的多酚類化合物含量

以沒食子酸質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，695nm處吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得的線性回歸方程為y=0.374 4x+0.004，R2=0.999 1，結(jié)果表明沒食子酸在0.4～2.0μg/mL時呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1.

3.1.2 貢山厚樸中多酚含量的測定

冷浸提取法、回流提取法、超聲提取法的結(jié)果見表1.

表1 貢山厚樸中多酚的冷浸提取、回流提取、 超聲提取法含量的測定

從表中可以看出，回流提取法的提取率優(yōu)于冷浸提取法和超聲提取法.

3.2 抗氧化活性的測定

3.2.1 貢山厚樸中多酚類化合物對活性氧(主要是1O2)的清除作用

光敏劑與抗氧劑對表觀清除率的影響見表2. 由表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，貢山厚樸提取物表現(xiàn)出了良好的活性氧清除能力，在實(shí)驗(yàn)所涉及的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)貢山厚樸提取物所表現(xiàn)出的抗氧化能力均與其本身質(zhì)量分?jǐn)?shù)成量效關(guān)系，貢山厚樸提取物清除活性氧的能力優(yōu)于天然抗氧化劑抗壞血酸. 本法重現(xiàn)性好，可作為分析天然抗氧化劑在生物體系中表現(xiàn)的抗氧化性能的一種分析方法.

3.2.2 DPPH法分析樣品對自由基的清除能力

按實(shí)驗(yàn)方法加入不同質(zhì)量濃度的抗氧化劑，測出Ai,Aj,Ac, 據(jù)此計(jì)算出其相應(yīng)的自由基清除率(K)，結(jié)果見圖2. 貢山厚樸提取物質(zhì)量濃度對DPPH自由基的清除率與其使用的量呈正相關(guān)，當(dāng)其體積達(dá)到一定時，DPPH自由基清除率達(dá)到飽和，不再隨質(zhì)量 mg/mL濃度的增加而增加.

從表中可以看出，貢山厚樸4種不同溶劑提取物對DPPH自由基都有較好的清除能力，其中95%乙醇提取物清除DPPH自由基的能力與標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸相近，70%的丙酮提取物清除DPPH自由基的能力相對較弱.

3.2.3 連苯三酚紅褪色光度法

按實(shí)驗(yàn)方法加入不同質(zhì)量濃度的抗氧化劑，測出As,Ab,A0, 據(jù)此計(jì)算出其相應(yīng)的抗羥自由基氧化率(S)，結(jié)果見圖3. 貢山厚樸提取物的抗羥自由基氧化率隨提取物體積的增大而增大，當(dāng)達(dá)到一定體積的時候，其抗自由基氧化率平緩或基本不再變化，即該抗氧化劑的藥效趨勢已經(jīng)達(dá)到平衡.

從表中可以看出，貢山厚樸4種不同溶劑提取物對羥基自由基都有較好的清除能力，其中95%乙醇提取物清除羥基自由基的能力與標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸相近，70%的丙酮提取物清除DPPH自由基的能力相對較弱.

表2 光敏劑與抗氧劑對表觀抗氧化率(S)的影響 %

注：光敏劑為玫瑰紅.

表3 貢山厚樸不同溶劑提取物清除DPPH自由基的IC50值 mg/mL

表4 貢山厚樸不同溶劑提取物抗羥基自由基的IC50值 mg/mL

4 結(jié)語

本文分別采用冷浸提取法，回流提取法及超聲提取法對貢山厚樸皮進(jìn)行提取，并對多酚類化合物的含量進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示回流提取法的提取率最高，為10.2%. 同時，采用微生物紙片法、DPPH法及連苯三酚紅褪色光度法對貢山厚樸乙醇回流提取物的抗氧化活性進(jìn)行了評估，結(jié)果顯示貢山厚樸乙醇提取物對活性氧(主要是1O2)、DPPH自由基及羥自由基均有較好的清除活性，其中對DPPH自由基和羥自由基的清除能力尤其顯著，IC50值分別為0.744 mg/mL和1.805 mg/mL.

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(責(zé)任編輯 王 琳)

Studies on polyphenol content and antioxidant activity ofMagnoiarostrateW.W.Smith extracts

LI Shi-yuan1,WANG Wei1,DAI Jian-hui1,JIANG Meng-yuan1,ZENG Xiao-li1,LI Xing-ming1,HUANG Xiang-zhong1,2,TIAN Kai1

(1.Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources,State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education，Engineering Research Center of Biopolymer Functional Materials of Yunnan,Yunnan Minzu University,Kunming 650500,China;2.State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines,Institute of Materia Medica,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100050,China)

The barks ofMagnoiarostrataW.W.Smith were extracted with ethanol as a solvent by means of cold extraction, reflux extraction and ultrasonic extraction, respectively, and the polyphenol contents of these extracts were determined with gallic acid as a reference.The results showed that the maximum extraction rate of polyphenol compounds was obtained from the reflux extraction, which was 10.2%.The antioxidant activities of the ethanol extract from the plant were evaluated by the microbiological paper method, DPPH method, and pyrogallol method. The results showed that the extract had some moderate capability in scavenging1O2radicals, and had good capability in scavenging DPPH and hydroxyl radicals with the IC50 values of 0.744 mg/mL,1.805 mg/mL respectively.

MagnoiarostrataW.W.Smith;polyphenol;antioxidant activity;microbiological paper method

2014-04-18.

國家自然科學(xué)基金(21262047;838865)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(S2012FZ0227)；云南民族大學(xué)傳統(tǒng)傣藥研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目；SRT創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(2013HXSSRTY06).

李世源(1987-)，男，碩士研究生. 主要研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué).

田凱(1971-)，男，碩士生導(dǎo)師. 主要研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)與計(jì)算化學(xué).

R931.6

A

1672-8513(2015)01-0025-04