促肝細(xì)胞再生磷酸酶-3及整合素β1在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

陳 星，成爭艷，王 凱，孫明偉

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院城東病區(qū) a.創(chuàng)傷外科，b.病理科，四川 成都 610101)

促肝細(xì)胞再生磷酸酶-3及整合素β1在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

陳 星a，成爭艷b，王 凱a，孫明偉a

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院城東病區(qū) a.創(chuàng)傷外科，b.病理科，四川 成都 610101)

目的 探討促肝細(xì)胞再生磷酸酶-3(phosphatase of regenerating liver-3，PRL-3)及整合素β1(integrinβ1，Intβ1)在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義。方法 采用免疫組織化學(xué)法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測食管癌組織、癌旁組織和正常組織中PRL-3 和Intβ1的表達(dá)水平。結(jié)果 在蛋白水平和基因水平檢測均發(fā)現(xiàn)癌組織中PRL-3 和Intβ1的表達(dá)高于癌旁組織(P< 0.05)和正常組織。結(jié)論 PRL-3 和Intβ1在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)增高，可能作為腫瘤標(biāo)志物來監(jiān)控食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移。

食管鱗狀細(xì)胞癌；促肝細(xì)胞再生磷酸酶3；整合素β1

食管癌世界標(biāo)準(zhǔn)化死亡率為23.40/10萬，占各種癌癥死亡的23.53%，僅次于肺癌、胃癌，居第三位[1]。。但是其發(fā)病的分子機(jī)制仍不清楚[2]。促肝細(xì)胞再生磷酸酶-3(phosphatase of regenerating liver-3，PRL-3)有促進(jìn)細(xì)胞的生長、遷移和浸潤的作用[3]，特別是在腫瘤的轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。整合素β1(integrinβ1，Intβ1)可使細(xì)胞間的黏附能力下降[4]，從而促進(jìn)腫瘤組織的浸潤轉(zhuǎn)移。目前PRL-3及Intβ1與食管癌的關(guān)系研究較少，而兩者在食管癌中基因和蛋白水平的定量分析及兩者的相關(guān)性在國內(nèi)鮮有報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測PRL-3及Intβ1在食管癌組織、癌旁組織和正常組織中的表達(dá)，觀察其在食管癌發(fā)生、發(fā)展、黏附和浸潤轉(zhuǎn)移中的作用，為臨床預(yù)測食管癌轉(zhuǎn)移潛能和預(yù)后及治療提供客觀有效的指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 用于免疫組化檢測的40例食管鱗狀細(xì)胞癌組織來源于我院病理科2010年1月至2013年12月胸外科手術(shù)切除標(biāo)本。其中高分化鱗狀細(xì)胞癌20例，中分化鱗狀細(xì)胞癌13例，低分化鱗狀細(xì)胞癌7例。并且取相應(yīng)的癌旁組織(距腫瘤邊緣1.0 cm處黏膜組織)及正常組織(距腫瘤邊緣5.0 cm處黏膜組織，經(jīng)鏡下觀察未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞)。用于Real-time PCR的12例新鮮食管癌組織、癌旁組織及正常組織取自2012年1月至2013年11月我院胸外科手術(shù)切除標(biāo)本。其中高分化鱗狀細(xì)胞癌5例，中分化鱗狀細(xì)胞癌4例，低分化鱗狀細(xì)胞癌3例。所有患者術(shù)前均未接受任何治療，平均年齡61.2歲(45～76歲)。12例新鮮組織切除后立即放入-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 免疫組化 按照免疫組化二步法檢測試劑盒說明進(jìn)行操作，測定PRL-3和 Intβ1的表達(dá)。切片常規(guī)脫蠟至水，高壓抗原修復(fù)，PRL-3單克隆抗體及Intβ1單克隆抗體(美國Santa Cruz公司鼠抗人)4 ℃孵育過夜，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。用PBS代替一抗作為陰性對照。在高倍鏡下觀察切片，隨機(jī)選取5～6個(gè)視野拍照，結(jié)果采用Image Pro 6.0圖像分析系統(tǒng)分析，測量平均光密度值(IOD)，各組進(jìn)行比較。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.3.1 總RNA的提取 ①組織勻漿后加0.2 ml氯仿，劇烈搖蕩離心管15 s，室溫放置3 min后12 000 r/min 4 ℃離心10 min；②取上層水于新的離心管，加等體積異丙醇混勻，室溫放置10 min；③ 12 000 r/min離心10 min，棄上清液并以75%乙醇洗滌沉淀；④離心棄上清液后室溫干燥10 min，加50 μl RNase-free ddH2O充分溶解RNA備用。

1.3.2 cDNA的合成 取總RNA 500 ng進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，用美國Bio-Rad公司iScriptTM cDNA Synthesis Kit試劑盒，總體系10 μl：5×PrimeScript Buffer 2 μl，PrimeScript RT Enzyme Mix 10.5 μl，Oligo dT Primer(50 μmol/L)0.5 μl，Random 6 mers(100 μmol/L)0.5 μl，補(bǔ)DEPC水至10 μl；上PCR儀反轉(zhuǎn)錄，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1.3.3 PCR擴(kuò)增 引物序列如下：PRL-3上游引物5′-GGGACTTCTCAGGTCGTG TC-3′，下游引物5′-AGCCCCGTACTTCTTCAGGT-3′。Intβ1上游引物5′-ACGAGGTCATGGTTCATGTTG-3′，下游引物5′-CCTCATACTTCGGATTG ACCA-3′。GAPDH上游引物5′-ATGCTGGCGCTGAGTACGTC-3′，下游引物5′-GGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3′。引物由上海生工合成，用大連寶生物TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒，反應(yīng)體系25 μl。其中cDNA 2 μl，SYBR Premix Ex Taq(2×)12.5 μl，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.5 μl，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.5 μl，dH2O 9.5 μl。將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，循環(huán)條件：①95 ℃預(yù)變性10s后開始循環(huán)；②95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。檢測樣本PRL-3和 Intβ1的Ct值。根據(jù)其Ct值，用軟件ABI StepOne，按公式2-△△Ct計(jì)算出相對表達(dá)量，各組進(jìn)行比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用軟件包SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；各組內(nèi)表達(dá)的差異應(yīng)用重復(fù)測量的方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Pearson相關(guān)分析檢驗(yàn)相關(guān)性，P< 0.05為有相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 PRL-3及Intβ1蛋白表達(dá)水平與陽性細(xì)胞定位 40例食管癌組織中PRL-3陽性27例(67.5%)，Intβ1陽性29例(72.5%)的癌細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)淺黃色至棕褐色顆粒樣物，間質(zhì)無著色(圖1a、圖2a)；相應(yīng)的癌旁組織中PRL-3陽性表達(dá)15例(37.5%)，且陽性細(xì)胞均集中在不典型增生區(qū)域的細(xì)胞質(zhì)中(圖1b)，Intβ1陽性表達(dá)16例(40%)(圖2b)；正常組織中PRL-3散在陽性13例(32.5%)(圖1c)，Intβ1散在陽性15例(37.5%)(圖2c)。PRL-3在癌組織、癌旁組織及正常組織中的IOD值依次降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。Intβ1在癌組織中IOD值高于癌旁組織及正常組織IOD值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)，見表1。

圖1 PRL-3的表達(dá) a：癌組織；b：癌旁組織；c：正常組織(×400) 圖2 Intβ1的表達(dá) a：癌組織；b：癌旁組織；c：正常組織(×400)

組織類型nPRL-3Intβ1癌組織400.185±0.004*0.187±0.003*癌旁組織400.179±0.0060.180±0.004正常組織400.173±0.0040.179±0.004

與癌旁組織及正常組織比較，*P<0.01

2.2 PRL-3和Intβ1的基因表達(dá)水平 PRL-3 mRNA在癌組織中相對表達(dá)量明顯高于癌旁組織及正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)。Intβ1 mRNA在癌組織、癌旁組織及正常組織中的相對表達(dá)量也依次降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 食管癌中PRL-3和 Intβ1基因表達(dá) (%)

與癌旁組織及正常組織比較，*P<0.01

2.3 PRL-3和Intβ1表達(dá)的相關(guān)性 在蛋白表達(dá)水平，癌組織中PRL-3 和Intβ1表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.412，P= 0.024)，癌旁組織中PRL-3和Intβ1表達(dá)亦呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.446，P= 0.049)。在基因表達(dá)水平，癌組織及癌旁組織中PRL-3 與Intβ1表達(dá)均無相關(guān)性(r=-0.349，r=-0.137，P> 0.05)。

3 討論

PRL屬于酪氨酸蛋白磷酸酶家族成員，包括PRL-1、PRL-2、 PRL-3。PRL在正常組織中有不同程度的表達(dá)，但更多研究表明其與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5，6]。目前已發(fā)現(xiàn)PRL-3在胃癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌，肝癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要作用[7～9]。PRL-3可通過調(diào)節(jié)酪氨酸的磷酸化和去磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、信息傳遞等活動(dòng)。同時(shí)PRL-3可通過激活細(xì)胞內(nèi)的Rho、MAPK信號通路使細(xì)胞增殖和分化，提高浸潤轉(zhuǎn)移能力[10]。本實(shí)驗(yàn)在蛋白和基因水平檢測了PRL-3 在正常食管黏膜組織、食管鱗狀細(xì)胞癌原發(fā)灶及癌旁組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明在食管鱗狀細(xì)胞癌中PRL-3 蛋白和基因在原發(fā)灶中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，說明高表達(dá)的PRL-3 可能在食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生轉(zhuǎn)移中起作用。

整合素是黏附分子五大家族成員之一，對細(xì)胞及其外基質(zhì)的黏附起主要介導(dǎo)作用[11]。Intβ1是介導(dǎo)ECM信號的主要細(xì)胞表面受體，與其配體相結(jié)合可以促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖和遷移等作用。研究表明，Intβ1與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[12，13]。本實(shí)驗(yàn)檢測了Intβ1在蛋白和基因水平的表達(dá)情況，結(jié)果表明在食管鱗狀細(xì)胞癌中Intβ1 蛋白和基因在原發(fā)灶中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，證明了Intβ1的高表達(dá)可能與食管鱗狀細(xì)胞癌黏附及侵襲增強(qiáng)有關(guān)。

PRL-3和Intβ1各種細(xì)胞外信號傳遞至細(xì)胞內(nèi)主要依靠MAPK通路介導(dǎo)[14]，有研究顯示PRL-3可通過正調(diào)控PRL-3-整合素β1-ERK1/2-MMP-2信號傳導(dǎo)通路[15]增強(qiáng)Intβ1的表達(dá)，使腫瘤組織的活動(dòng)性、侵襲性和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在蛋白表達(dá)水平癌組織和癌旁組織中PRL-3 和Intβ1表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系，說明其機(jī)制PRL-3可能通過活化通路提高Intβ1表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)胞間質(zhì)侵襲轉(zhuǎn)移的能力。在基因表達(dá)水平PRL-3 和Intβ1表達(dá)無相關(guān)性，可能由于mRNA翻譯成蛋白的滯后性及mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制的影響。綜上所述，PRL-3和Intβ1在食管鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，且在食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移起關(guān)鍵作用，可能作為腫瘤標(biāo)志物來監(jiān)測腫瘤、判斷預(yù)后，也有望成為治療腫瘤的靶點(diǎn)。

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Expression and significance of phosphatase of regenerating liver-3 and integrinβ1 in esophageal squamous cell carcinoma

CHENXinga，CHENGZheng-yanb，WANGKaia，SUNMing-weia

(a.DepartmentofThoracicSurgery，b.PathologyDepartment，EasternDistrict，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610101，China)

SUNMing-wei

Objective To investigate the expression and significance of phosphatase of regenerating liver-3(PRL-3)and integrinβ1(Intβ1)in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC).Methods The expression of PRL-3 and Intβ1 in esophageal squamous cell carcinoma，adjacent non-tumor tissues and normal esophageal tissues were detected by using an immunohistochemical analysis and a real-time PCR analysis.Results The mRNA and protein expressions of PRL-3 and Intβ1 were higher in the esophageal squamous cell carcinoma than that in the adjacent non-tumor tissues(P< 0.05).The lowest expressions of the two factors were found in the normal esophageal tissues.Conclusion PRL-3 and Intβ1 may be used as tumor markers in progression，invasion and metastasis of the disease.

Esophageal squamous cell carcinoma；Phosphatase of regenerating liver-3；Integrin β1

四川省衛(wèi)生廳2013年科研項(xiàng)目(編號：130142)

孫明偉

R735.1；R365

A

1672-6170(2015)01-0049-03

2014-09-17；

20104-11-04)