表達US3基因腺病毒載體下調(diào)CTL和NK細胞對其轉(zhuǎn)染肝細胞殺傷活性的影響

王 鵬，李 玲，闞全程，潘 雪，余祖江，張振香，馮 婷

（1.鄭州大學護理學院基礎(chǔ)教研室，河南鄭州 450052；2.鄭州市第九人民醫(yī)院姑息治療暨安寧療護病區(qū)，河南鄭州 450052；3.鄭州大學第一附屬醫(yī)院感染科，河南鄭州 450052）

表達US3基因腺病毒載體下調(diào)CTL和NK細胞對其轉(zhuǎn)染肝細胞殺傷活性的影響

王 鵬1，李 玲2，闞全程3，潘 雪1，余祖江3，張振香1，馮 婷1

（1.鄭州大學護理學院基礎(chǔ)教研室，河南鄭州 450052；2.鄭州市第九人民醫(yī)院姑息治療暨安寧療護病區(qū)，河南鄭州 450052；3.鄭州大學第一附屬醫(yī)院感染科，河南鄭州 450052）

目的 研究表達US3基因重組腺病毒載體對其轉(zhuǎn)染肝細胞介導的免疫逃逸活性。方法 首先構(gòu)建表達US3基因腺病毒載體，擴增純化后轉(zhuǎn)染HL-7702肝細胞，利用細胞毒性T細胞（CTL）殺傷實驗和自然殺傷細胞（NK）殺傷實驗，檢測表達US3基因重組腺病毒載體的免疫活性。結(jié)果 表達US3基因的重組腺病毒r-US3成功構(gòu)建，r-US3能夠明顯降低CTL和NK細胞對轉(zhuǎn)染肝細胞的殺傷活性。結(jié)論 表達US3基因腺病毒載體在一定程度上能夠介導轉(zhuǎn)染肝細胞的免疫逃逸，降低機體免疫系統(tǒng)對轉(zhuǎn)染肝細胞的排斥反應。

免疫逃逸；重組腺病毒；US3；細胞毒性T淋巴細胞（CTL）；自然殺傷細胞（NK）

肝細胞移植（hepatocyte transplantation，HT）是從20世紀70年代開始發(fā)展起來的一項細胞工程技術(shù)，是將正常成年的或不同發(fā)育階段的肝細胞、肝潛能細胞、基因修飾型肝細胞以及相關(guān)的肝臟生長刺激因子，在一定條件下通過不同途徑，將其移植到受體適當?shù)陌形唬怪谙鄳牟课欢ň?、存活、增殖、修復或重建肝組織結(jié)構(gòu)，發(fā)揮正常肝臟功能，用以治療急、慢性肝功能衰竭或某些代謝性疾病造成的各種終末期肝病的一種肝臟組織工程學手段［1］。相對于原位肝移植（orthotopic liver transplantation，OLT），HT可一肝多用，重復移植，在一定程度上能夠緩解供肝短缺的問題，也可起到臨時過渡作用，為肝臟移植爭取時間，且創(chuàng)傷小、操作安全簡單、費用低廉。因此，近年來HT越來越受到國內(nèi)外學者的廣泛重視，具有廣闊的臨床應用前景，但免疫排斥問題仍是HT面臨的一個主要問題。

隨著高效轉(zhuǎn)染基因工程的發(fā)展，基因治療被系統(tǒng)地引入器官移植［2］，并滲入到器官移植領(lǐng)域的各個分支，肝細胞具有了基因修飾的可能性［3-4］。將治療基因?qū)敫渭毎笠浦灿谑荏w，既能滿足移植的需要，又能通過轉(zhuǎn)染、基因干擾或敲除等技術(shù)使肝細胞獲得所需的特性，達到防治肝臟疾病的目的。通過基因修飾使移植肝細胞獲得免疫逃逸的活性已成為目前國內(nèi)外HT的研究熱點。

研究發(fā)現(xiàn)，人類巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）編碼的具有免疫調(diào)控基因片段US3基因與HCMV病毒的免疫逃逸活性關(guān)系密切［5］。本研究構(gòu)建表達US3基因的腺病毒載體，轉(zhuǎn)染HL-7720肝細胞，通過細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）殺傷實驗和自然殺傷細胞（natural killer，NK）殺傷實驗，研究表達US3基因腺病毒載體介導轉(zhuǎn)染肝細胞的免疫逃逸活性，為肝細胞移植和基因治療提供新的探索方向。

1 材料與方法

1.1 細胞株293T細胞株，HL-7702肝細胞株購自中國科學院細胞庫。

1.2 試劑瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉購自英國OXOID公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國GIBCO公司。限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自New England Biolab公司，高保真Pfu DNA Polymerase酶購自美國Promega公司。質(zhì)粒提取試劑盒、PCR清潔試劑盒、膠回收試劑盒購自北京transgen公司。其余試劑購自Sigma公司。

1.3 US3-His-tag融合基因的擴增臨床采集HCMV型陽性標本，提取病毒DNA，PCR擴增US3基因，上游引物含有Hin dⅢ酶切位點，下游引物含有Eco RⅤ：sense：5＇-CCGAAGCTTATGAAGCCGGTGTTGGTGCTCGC-3＇，antisense：5＇-GCCGATATCAATAAATCGCAGACGGGCGCTCAC-3＇，依照說明書要求，依次加入模板DNA、上下游引物、Pfu DNA Polymerase、d NTPs、10×PCR Buffer及適量的dd H2O，建立50μL PCR反應體系，95℃預變性2 min后，95℃30 s，60℃30 s，72℃2 min，進行35個循環(huán)后，72℃延伸5 min。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產(chǎn)物并測序。

測序正確的序列通過PCR擴增，鏈接His-tag序列，得到US3-His-tag融合基因。引物為：sense：5＇-CCGAAGCTTATGAAGCCGGTGTTGGTGCTCGC-3＇，antisense：5＇-GCCGATATCTTAATGATGATGATGATGATGAAT-3＇。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產(chǎn)物，測序鑒定。

1.4 重組腺病毒r-US3載體的構(gòu)建擴增好的US3-His-tag融合基因與提取的p Ad Track-CMV質(zhì)粒的酶切片段用T4DNA Ligase酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，篩選陽性克隆，酶切鑒定后，測序鑒定。測序正確的克隆命名為p Ad Track-US3載體。

p Ad Track-US3載體PmeⅠ單酶切線性化后，加入含p AdEasy-1質(zhì)粒的感受態(tài)BJ5183細菌中同源重組，進行酶切鑒定和測序，構(gòu)建成功的重組腺病毒載體命名為p AdEasy-US3。PacⅠ單酶切后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法在293T細胞中進行包裝，構(gòu)建重組腺病毒r-US3，并進行CsCl梯度純化和滴度測定。同樣的方法構(gòu)建空載體重組腺病毒r-Track，作為生物活性鑒定實驗的對照。

1.5 重組腺病毒對HL-7720肝細胞的感染效率培養(yǎng)生長狀況良好的HL-7702細胞計數(shù)后接種于12孔板，每孔接種細胞105個，50 m L/L CO2，37℃培養(yǎng)。24 h后用MOI分別為50、100和200的重組腺病毒液r-US3感染各孔細胞，每個濃度接種3個平行孔。培養(yǎng)6 h換液后，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，熒光顯微鏡下計數(shù)熒光細胞數(shù)和細胞總數(shù)，計算感染效率，相同實驗重復3次。以同樣的方法，測定重組腺病毒r-Track的感染效率。

1.6 重組腺病毒對肝細胞HL-7702生長活性的影響培養(yǎng)生長狀況良好的HL-7702細胞分別轉(zhuǎn)染r-Track和r-US3重組腺病毒（MOI為100）后，分別在0、24、48、72 h加入5 mg/m L MTT溶液，37℃孵育4 h，小心吸取孵育液后，加入1 m L DMSO混合均勻，10 min后，測定吸光度（A）值。每組細胞測定3個平行孔，相同實驗重復3次。

1.7 重組腺病毒對淋巴細胞特異性CTL殺傷活性的影響將培養(yǎng)生長狀況良好的HL-7702細胞，接種于12孔板，每孔106個，50 m L/L CO2，37℃培養(yǎng)24 h。細胞分為3個組，分別為r-US3組、r-Track組和正常對照組。各組細胞分別加入MOI為100的重組腺病毒r-H-ICP47、r-Track和RPMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)6 h換液后，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。各組加入終質(zhì)量濃度為50μg/m L的絲裂霉素C，培養(yǎng)45 min，棄上清，PBS清洗，調(diào)整細胞濃度作為靶細胞。

采集健康人志愿者外周抗凝血，梯度密度沉淀法分離外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），調(diào)整細胞密度為5×106個/m L，接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)4 h。吸出未貼壁細胞（富含大量的T淋巴細胞）作為效應細胞。按照效靶比20∶1混合效應細胞與各組靶細胞。另以效應細胞自身為空白對照。每組均做3個平行孔，MTT法測定CTL殺傷活性。將正常對照組CTL殺傷活性設(shè)為100%調(diào)整各組結(jié)果，相同實驗重復3次。

1.8 NK細胞殺傷活性的影響梯度密度沉淀法常規(guī)分離PBMCs，PBS洗滌后計數(shù)，每107個細胞加入80μL緩沖液和20μL抗CD56免疫磁珠，4℃孵育15 min，加入1 m L的緩沖液，1 500 r/min離心10 min，棄上清，緩沖液重懸后加入Mini MACS磁場中，進行磁珠分離，分選的CD56+細胞即為NK細胞，培養(yǎng)24 h后作為效應細胞。培養(yǎng)生長狀況良好的HL-7702細胞接種于12孔板，分為r-US3組、r-Track組和正常對照組，各組分別加入MOI為100的重組腺病毒r-H-ICP47、r-Track和RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后作為靶細胞。按照效靶比20∶1混合效應細胞和靶細胞，另以效應細胞自身為空白對照。每組均做3個平行孔，NK細胞殺傷活性采用乳酸脫氫酶釋放法測定。將正常對照組CTL殺傷活性設(shè)為100%調(diào)整各組結(jié)果，相同實驗重復3次。

1.9 統(tǒng)計學方法結(jié)果以均數(shù)±標準差（±s）表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行，多組間比較進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗后，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 pAdTrack-US3酶切鑒定結(jié)果載體p Ad Track-US3用Hin dⅢ和Eco RⅤ雙酶切后，約在590 bp處有一明顯條帶，而單酶切時未見此條帶（圖1），證明U3-His-tag融合基因成功連接于p Ad Track-CMV載體。

2.2 重組腺病毒載體p Ad Easy-US3載體的測序結(jié)果表達US3-His-tag融合基因的腺病毒載體測序結(jié)果見圖2，與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，證明成功構(gòu)建了表達US3-His-tag融合基因的腺病毒載體。

圖1 p Ad Track-US3載體酶切鑒定結(jié)果Eig.1 Analysis of p Track-ICP47 with Hin dⅢand Eco RV l：p Track-US3/Hin dⅢ；2：p Track-US3/Eco RV；3：p Track-US3/ Hin dⅢ和Eco RV；4：DNA Marker DL15000。

2.3 重組腺病毒載體對肝細胞HL-7702的轉(zhuǎn)染效率隨著MOI的加大，重組腺病毒r-US3和r-Track對HL-7702細胞的感染效率逐漸增加（圖3）。當MOI為100時，重組腺病毒載體r-US3和r-Track對HL-7702細胞的感染效率分別為（87.35±3.22）%和（85.46±2.42）%，均明顯高于MOI為50時的感染效率即（32.55±5.02）%和（28.17±2.32）%（P＜0.05），而與MOI為200時的感染效率即（93.56± 3.35）%和（88.86±3.86）%差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。為了盡可能降低重組腺病毒對轉(zhuǎn)染細胞的毒性，本研究在隨后的實驗過程中采用了MOI為100的感染劑量。

2.4 重組腺病毒對肝細胞HL-7702生長活性的影響MOI為100的重組腺病毒轉(zhuǎn)染HL-7702肝細胞后，采用MTT法測定肝細胞HL-7702生長活性的結(jié)果（圖4）顯示，與正常對照組相比，r-Track組和r-US3組對轉(zhuǎn)染肝細胞的生長活性沒有明顯影響，3組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.5 重組腺病毒對特異性CTL殺傷活性的影響MOI為100的重組腺病毒轉(zhuǎn)染HL-7702肝細胞后，進行CTL殺傷活性實驗，將正常對照組CTL殺傷活性設(shè)為100%調(diào)整各組的結(jié)果（圖5）顯示，r-US3組能明顯降低CTL對轉(zhuǎn)染肝細胞的特異性殺傷活性［（90.33 ±4.04）%］，與正常對照組［（100.00±0.00）%］和r-Track組［（105.00±2.65）%］相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而正常對照組和r-Track組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.6 重組腺病毒對NK細胞殺傷活性的影響MOI為100轉(zhuǎn)染HL-7702肝細胞后，進行NK細胞殺傷活性實驗，將正常對照組CTL殺傷活性設(shè)為100%調(diào)整各組的結(jié)果（圖6）顯示，r-US3組能明顯降低NK細胞對轉(zhuǎn)染肝細胞的特異性殺傷活性［（88.63± 2.06）%］，與正常對照組［（100.00±0.00）%］和r-Track組［（101.27±1.62）%］相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而正常對照組和r-Track組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 重組腺病毒載體p AdEasy-US3載體的測序結(jié)果Eig.2 The sequencing identification of p Ad Easy-US3

圖3 重組腺病毒載體對肝細胞HL-7702的轉(zhuǎn)染效率Eig.3 Efficiency of transfection with r-US3/r-Track in HL-7702 cells（n=9）

圖4 重組腺病毒對肝細胞HL-7702生長活性的影響Eig.4 Effects of transfection with r-US3/r-Track on cell viability（n=9）

圖5 重組腺病毒對CTL殺傷活性的影響Eig.5 Cytotoxicity of CTL activated by HL-7702 cells transfected with r-US3/r-Track（n=9）

3 討 論

圖6 重組腺病毒對NK細胞殺傷活性的影響Eig.6 Cytotoxicity of NK cells activated by HL-7702 cells transfected with r-H-ICP47/r-Track（n=9）

免疫排斥問題仍是目前器官移植和基因治療有待解決的一個主要問題［6-7］。隨著高效轉(zhuǎn)染基因工程的發(fā)展，通過基因修飾使移植器官、組織或細胞獲得免疫逃逸的活性成為研究熱點。過去曾一度認為主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類分子僅能遞呈內(nèi)源性抗原肽，即引起CD8+T細胞活化的APCs（antigen presenting cells）只是能產(chǎn)生內(nèi)源性抗原的靶細胞，然而，越來越多的證據(jù)表明，MHC-Ⅰ類分子也能夠遞呈外源性抗原誘導反應，具有吞噬功能的APC在激活CTL的應答過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。因此，MHC-Ⅰ類抗原呈遞途徑在器官移植免疫排斥方面的研究中越來越引起人們的關(guān)注［8］。

病毒是典型的胞內(nèi)感染，干擾感染細胞表面MHC-Ⅰ類分子抗原呈遞途徑來逃避免疫清除的策略被許多病毒所利用。病毒可運用各種機制干擾MHC-Ⅰ類分子的成熟、組裝和輸出，作用于MHC-Ⅰ類抗原肽復合物形成的各環(huán)節(jié)，在其生活周期的不同階段均可以干擾MHC-Ⅰ類抗原呈遞，從而產(chǎn)生病毒逃逸，減少機體對病毒的清除。有研究表明，表達E3-gp19k基因的腺病毒載體可加強外源基因的表達活性和延長外源基因表達的持續(xù)時間，而不需要免疫抑制劑［9］。例如，艾倫·P·埃舍爾等［10］研究構(gòu)建了可以編碼E3-gp19k基因的質(zhì)粒并給NOD小鼠接種，可導致糖尿病的發(fā)病延遲，發(fā)病率降低，用于預防或治療包括Ⅰ型糖尿病在內(nèi)的多種自身免疫性疾病。

單純皰疹病毒Ⅰ型基因序列編碼的立即早期感染性細胞蛋白47（infected cell protein 47，ICP47）能與抗原多肽競爭抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運子（transporter associated with antigen presentation，TAP）的肽結(jié)合位點，阻礙了抗原多肽和MHC-Ⅰ類分子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的結(jié)合，有效地降低CTL的識別和殺傷活性，逃逸宿主的免疫清除［11］。作者前期將ICP47基因連接于腺病毒載體，構(gòu)建了表達ICP47的重組腺病毒［12-13］，分別轉(zhuǎn)染了HL-7702肝細胞株、DCs和淋巴細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表達ICP47基因的重組腺病毒能夠降低CTL對轉(zhuǎn)染HL-7702肝細胞的特異性殺傷活性，降低DCs刺激淋巴細胞增殖的能力。這些結(jié)果在一定程度上提示：表達ICP47基因的腺病毒載體能夠介導其轉(zhuǎn)染細胞的免疫逃逸，降低CTL對轉(zhuǎn)染細胞和腺病毒載體的識別和殺傷，達到外源基因長期表達的目的。

但是，病毒感染細胞表面MHC-Ⅰ類分子的表達與其對NK細胞的敏感性成反比。病毒感染細胞在破壞或下調(diào)MHC-Ⅰ類分子的同時，卻成了NK細胞的攻擊目標。因此，單純降低病毒感染細胞表面MHC-Ⅰ類分子表達達不到理想的免疫逃逸效果。研究報道，HCMV病毒編碼的具有免疫調(diào)控的基因片段US3基因，既可以選擇性下調(diào)NK細胞興奮性受體的優(yōu)勢配體MHC-Ⅰ-A和MHC-Ⅰ-B，又可對NK細胞抑制性受體的優(yōu)勢配體MHC-Ⅰ-C和MHC-Ⅰ-E不產(chǎn)生影響，在逃逸CTL殺傷的同時，還可避免NK細胞的免疫殺傷，能夠更有效地逃逸宿主的免疫清除［5］。

本研究在已有的理論依據(jù)和前期實驗的基礎(chǔ)上，在腺病毒載體上連接US3-His-tag融合基因，構(gòu)建可介導免疫逃逸的腺病毒載體，轉(zhuǎn)染HL-7702肝細胞株，通過CTL殺傷試驗和NK細胞殺傷實驗，研究表達US3基因腺病毒載體的免疫逃逸活性。結(jié)果成功構(gòu)建了表達US3基因的腺病毒載體，并在轉(zhuǎn)染HL-7702細胞后，重組腺病毒載體r-US3能明顯地降低CTL和NK細胞對轉(zhuǎn)染肝細胞的殺傷活性。這些結(jié)果在一定程度上提示表達US3基因的腺病毒載體能夠介導轉(zhuǎn)染細胞的免疫逃逸，降低機體免疫系統(tǒng)對基因轉(zhuǎn)染細胞的排斥反應。本研究為基因治療、細胞移植或器官組織移植提供一種新的探索方向，拓展了病毒免疫學的研究領(lǐng)域，為器官衰竭甚至自身免疫性疾病的預防和治療帶來廣闊的前景。

［1］NAKAMURA Y，MIZUGUCHI T，TANIMIZU N，et al.Preoperative hepatocyte transplantation improves the survival of rats with nonalcoholic steatohepatitis-related cirrhosis after partial hepatectomy［J］.Cell Transplant，2014，23（10）：1243-1254.

［2］郭峰，盧永剛，何建平.肝細胞移植研究進展［J］.中國普通外科雜志，2007，16（8）：803-805.

［3］劉世呈，李靖.肝細胞移植的研究進展［J］.中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2008，15（2）：109-111.

［4］MURASAWA S，ASAHARA T.Gene modified cell transplantation for vascular regeneration［J］.Curr Gene Ther，2007，7（1）：1-6.

［5］O'CONNELL KA，HAN YF，THOMAS M，et al.Role of natural killer cells in a cohort of elite suppressors：Low frequency of the protective KIR3DS1 allele and limited inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in vitro［J］.J Virol，2009，83（10）：5028-5034.

［6］MATSUMOTO S.Clinical allogeneic and autologous islet cell transplantation：update［J］.Diabetes Metab J，2011，35（3）：199-206.

［7］CANDIELLO JE，JARAMILLO M，GOH SK，et al.Role of substrates in diabetes therapy：stem cell differentiation and islet transplantation［J］.Crit Rev Biomed Eng，2011，39（6）：535-555.

［8］AISENBREY C，SIZUN C，KOCH J，et al.Structure and dynamics of membrane-associated ICP47，a viral inhibitor of the MHC I antigen-processing machinery［J］.J Biol Chem，2006，281（41）：30365-30372.

［9］HOLST PJ，?RSKOV C，THOMSEN AR，et al.Quality of the transgene-specific CD8+T cell response induced by adenoviral vector immunization is critically influenced by virus dose and route of vaccination［J］.J Immunol，2010，184（8）：4431-4439.

［10］艾倫·P·埃舍爾，李逢春.預防與治療自身免疫性疾病的物質(zhì)：中國.CN200710097957.2［P］.2007-10-24

［11］LAMPEN MH，VERWEIJ MC，QUERIDO B，et al.CD8+T cell responses against TAP-inhibited cells are readily detected in the human population［J］.J Immunol，2010，185（11）：6508-6517.

［12］WANG P，KAN QC，YU ZJ，et al.Construction and identification of a recombinant adenovirus vector expressing His-tag-ICP47 fusion gene［J］.Life Sci J，2012，9（1）：756-763.

［13］WANG P，KAN QC，YU ZJ，et al.Recombinant adenovirus expressing ICP47 gene suppresses the ability of dendritic cells by restricting specific T cell responses［J］.Cellular Immunol，2013，282（2013）：129-135.

（編輯 國 榮）

Attenuation on cytotoxic activities of T lymphocytes and NK cells against transgened hepatic cells by a recombinant adenovirus
vector expressing US3 gene

WANG Peng1，LI Ling2，KAN Quan-cheng2，PAN Xue1，YU Zu-jiang2，ZHANG Zhen-xiang1，EENG Ting1
（1.Basic Department，Nursing School of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052；2.Department of Palliative Care and Hospice Care，the Ninth People's Hospital of Zhengzhou，Zhengzhou 450052；3.Department of Infection，the Eirst Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China）

Objective To investigate the activity of immune evasion induced by a recombinant adenovirus vector expressing US3 gene in HL-7702 hepatic cells with transferred gene.Methods We first constructed an adenovirus vector expressing US3 gene and transferred it into HL7702 hepatic cells.Then immunological activities of US3 were determined by testing outivities of T lymphocytes（CTL）and natural killer（NK）cells.Results r-US3 and r-Track were successfully constructed.r-US3 could attenuate the activities of CTL and NK cells to HL-7720 cells with transferred gene.Conclusion The adenovirus vector expressing US3 gene might induce the activity of immune evasion in cells with transferred gene，attenuating immune rejection of host against transgened hepatic cells.

immune evasion；recombinant adenovirus vector；US3；cytotoxic T lymphocyte；natural killer cell

Q812

A

10.7652/jdyxb201505016

2014-11-03

2015-03-30

河南省科技廳項目（No.122300410338，132102310138）；河南省教育廳自然科學基金項目（No.12A310010）；河南省衛(wèi)生廳“5451”項目（No.201201065）；國家留學基金委項目（No.201207045015）；河南省骨干教師項目（No.2011GGJS-013）；鄭州市科技局項目（No. 10PTGS484-7，121PPTGG507-22）

Supported by the Eoundation of Science and Technology Planning Project of Henan Province（No.122300410338，132102310138），the Natural Science Eoundation of Henan Education Department（No.12A310010），“5451”Project of Henan Health Department（No.201201065），the Eoundation from China Scholarship Council（No.201207045015），the Eoundation for University Key Teachers of Henan Province（No.2011GGJS-013），and the Project of Science and Technology Planning Bureau of Zhengzhou（No.10PTGS484-7，121PPTGG507-22）

闞全程.E-mail：kanqczzu@163.com

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150803.1047.002.html（2015-08-03）