人鼻咽癌放射抗拒性腫瘤干細胞的分離、篩選與鑒定

王亞利，王中衛(wèi)，任洪濤，金迎迎，李 毅

（西安交通大學醫(yī)學部第二附屬醫(yī)院腫瘤科放療中心，陜西西安 710004）

人鼻咽癌放射抗拒性腫瘤干細胞的分離、篩選與鑒定

王亞利，王中衛(wèi)，任洪濤，金迎迎，李 毅

（西安交通大學醫(yī)學部第二附屬醫(yī)院腫瘤科放療中心，陜西西安 710004）

目的 分離、篩選、鑒定人鼻咽癌CNE-2及放射耐受CNE-2R的腫瘤干細胞。方法 免疫磁珠技術分選CNE-2及CNE-2R中鼻咽癌CD133+干細胞，分別用無血清培養(yǎng)法、平板克隆法、裸鼠成瘤試驗檢測分選的CD133+細胞體外增殖能力、克隆形成能力及成瘤能力，HE染色和電鏡超微結構觀察形態(tài)學變化。結果 CNE-2及CNE-2R細胞中CD133+表達分別為（1.79±0.16）%和（2.63±0.72）%；CNE-2-CD133+細胞及CNE-2R-CD133+細胞形成腫瘤干細胞球及體外增殖能力遠高于CD133-表達者；CNE-2R-CD133+細胞克隆形成能力較CNE-2-CD133+細胞明顯升高，而且CNE-2R-CD133+細胞的克隆形態(tài)與CNE-2-CD133+細胞相比較明顯增大；形態(tài)學發(fā)現(xiàn)CNE-2R-CD133+細胞核大，異型，核仁大，細胞器肥大。結論 分離、篩選出的鼻咽CNE-2R-CD133+腫瘤干細胞能形成干細胞球，其增殖能力、裸鼠成瘤能力更強，能為進一步探討鼻咽癌放射抗拒的機制提供研究基礎。

鼻咽癌；放射抗拒性；腫瘤干細胞

腫瘤干細胞是一種極少數(shù)的增殖特性失控、可形成腫瘤、具有干細胞特性的腫瘤細胞。是形成不同分化程度腫瘤細胞和腫瘤增長、復發(fā)及轉移的根源［1］。腫瘤干細胞（tumor stem cell，TSC）的存在被認為是鼻咽癌局部復發(fā)及放射治療失敗的關鍵原因［2］。我們在前期已經成功在人鼻咽癌細胞株CNE-2基礎上建立放射抗拒性人鼻咽癌細胞株CNE-2R，并對鼻咽癌放射抗拒性在基因組學及蛋白組學方面作了初步探討。本研究用免疫磁珠法分離、篩選鑒定人鼻咽癌CNE-2及放射耐受CNE-2R的CD133+細胞，并對其干細胞特性通過裸鼠成瘤實驗、電鏡超微結構觀察及特異性蛋白表達等試驗予以驗證。為進一步探討鼻咽癌放射抗拒的機制，闡明其分子調控途徑和基因表達譜，為調控鼻咽癌的放射治療敏感性提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)CNE-2及放射耐受CNE-2R培養(yǎng)于100 m L/L胎牛血清、30 m L/L谷氨酰胺的DMEM/E12（Gibco）培養(yǎng)基，50 m L/L CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

1.2 分離、篩選鑒定人鼻咽癌CNE-2及放射耐受CNE-2R的腫瘤干細胞

1.2.1 免疫磁珠技術分選CNE-2及CNE-2R細胞株的CD133+細胞 按照說用明書操作，取指數(shù)生長期的CNE-2和CNE-2R制成單細胞懸液，進行CD133/2（293C3）-PE標記，加入包被有鼠抗人CD133抗體的磁珠，4℃，孵育30 min。通過磁珠分選柱分別收獲CD133-和CD133+細胞。將所收獲的CD133+和CD133-細胞，加入無血清培養(yǎng)基置于50 m L/L CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 檢測CNE-2-CD133+及CNE-2R-CD133+干細胞體外成球及增殖能力 ①干細胞體外成球能力。取分選的CD133+細胞和CD133-細胞在無血清培養(yǎng)液中，37℃、50 m L/L CO2飽和溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天加入0.25 m L無血清培養(yǎng)液，觀察腫瘤細胞克隆球形成過程，倒置顯微鏡觀察。②CD133+干細胞體外增殖能力。將分選的CD133+細胞，CD133-細胞以及未分選的細胞種植于96孔板內，每孔加入0.2 mL無血清培養(yǎng)液，無血清培養(yǎng)液含DMEM/E12（1∶1）、20μg/L堿性成纖維細胞生長因子（bEGE）、20μg/L表皮生長因子（EGE）、5 mg/L胰島素的無血清培養(yǎng)液，2 000細胞/孔。置于37℃、體積分數(shù)50 mL/L CO2飽和溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)第1、3、5、7天測定細胞的增殖狀態(tài)，以490 nm吸光度（A）值檢測存活活細胞數(shù)，每組所得數(shù)據取均值，繪制細胞生長曲線、比較各組細胞的增殖速度。

1.2.3 體外平板克隆形成實驗檢測CD133+干細胞克隆形成能力 將分選的CD133+及CD133-細胞進行細胞計數(shù)，以每200個細胞接種于含10 m L上述無血清培養(yǎng)液的6孔板中，置于37℃、體積分數(shù)50 m L/L CO2飽和溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3周。當6孔板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，純甲醇固定15 min。結晶紫室溫固定15 min。洗去染料后顯微鏡下計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)，然后計算克隆形成率。實驗重復3次?？寺⌒纬陕剩?）=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.2.4 裸鼠成瘤試驗 收集CNE-2-CD133-、CNE-2-CD133+、CNE-2R-CD133-、CNE-2R-CD133+各組細胞，冰預冷的PBS重懸，調整細胞濃度為1×104/μL。碘伏消毒后分別向裸鼠背部皮下注射CD133+和CD133-細胞0.2 m L。裸鼠飼養(yǎng)于高度潔凈無特殊病原體（specific pathogen free，SPE）無菌凈化室內。每周觀察1次，4周后處死，測量腫瘤大小，照相。

1.2.5 HE染色和電鏡超微結構觀察 取新鮮瘤組織剪碎，常規(guī)甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片。蘇木素染色，流水沖洗。伊紅染色，自來水沖洗。脫水，透明，中性樹膠封片。新鮮預冷的25 g/L戊二醛4℃固定新鮮瘤組織72 h，PBS漂洗4次，每次30 min；10 g/L鋨酸避光固定2 h；50%、70%、90%，100%丙酮梯度脫水各15 min；純丙酮：樹脂（1∶1）浸透1 h，純丙酮：樹脂（1∶2）浸透2 h，純樹脂過夜。膠囊內包埋后72℃烤箱聚合10 h。醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，透射電鏡觀察。

2 結 果

2.1 CD133+的表達率流式細胞分析結果顯示CNE-2及CNE-2R細胞中CD133+表達率分別為（1.79±0.16）%和（2.63±0.72）%，二者差異顯著（P＜0.05，圖1）。

2.2 CNE-2及CNE-2R CD133+腫瘤干細胞球的形成CNE-2及CNE-2R CD133+細胞在無血清條件下懸浮生長，培養(yǎng)12 d后開始形成干細胞球，球體大小不一（圖2）。CNE-2-CD133+細胞及CNE-2RCD133+細胞形成腫瘤干細胞球的能力遠高于CD133-表達者。

2.3 CD133+干細胞的體外增殖能力各組細胞照射24 h后，與未分選細胞相比，CNE-2-CD133+及CNE-2R-CD133+細胞增長幅度均大于CD133-（P＜0.05）。其中CNE-2R-CD133+組的細胞增長幅度最大（表1）。

圖1 流式細胞檢測CD133+在鼻咽癌CNE-2及CNE-2R中的表達分別為1.79%和2.63%Eig.1 Expression of CD133+in NPC cells of CNE-2 and CNE-2R was 1.79%and 2.63%by flow cytometry，respectively

圖2 CNE-2及CNE-2R CD133+細胞在無血清培養(yǎng)基中形成的懸浮干細胞細胞球Eig.2 CNE-2 and CNE-2R CD133+cells in serum-free suspension ball forming stem cells culture medium（×100）

表1 各組細胞培養(yǎng)不同時間增殖指數(shù)的比較Tab.1 The proliferation index of different cells cultured for different time

2.4 軟瓊脂克隆形成率檢測CNE-2及CNE-2R CD133+干細胞克隆形成能力軟瓊脂克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，CNE-2R-CD133+細胞克隆形成能力較CNE-2-CD133+細胞明顯升高，二者的克隆形成率分別為17.1%和5.9%，而且CNE-2R-CD133+細胞的克隆形態(tài)與CNE-2-CD133+細胞相比較明顯增大，有顯著差異（P＜0.05，圖3）。

2.5 裸鼠成瘤實驗檢測分選的CD133+細胞的成瘤能力CNE-2-CD133-、CNE-2-CD133+、CNE-2RCD133-、CNE-2R-CD133+細胞分別以2×104個細胞各接種4只裸鼠，4周之后，分別有2、4、3、4只裸鼠體內形成移植瘤；兩種CD133+細胞在裸鼠體內的成瘤率高于CD133-組，CNE-2R-CD133+高于CNE-2-CD133+組，二者差異明顯（P＜0.05，圖4）。

圖3 分選CNE-2及CNE-2R CD133+細胞的克隆形成能力Eig.3 Clone-forming ability of CD133+cells screened from CNE-2 and CNE-2R cells

圖4 免疫磁珠分選CNE-2及CNE-2R細胞中CD133+細胞裸鼠體內成瘤性的比較Eig.4 Comparison of tumorigenicity between CNE-2 and CNE-2R CD133+cells in nude mice

2.6 HE染色和電鏡超微結構觀察CD133+細胞結構的差異 HE常規(guī)染色發(fā)現(xiàn)兩種移植瘤細胞形態(tài)差異不大（圖5）。而透視電鏡發(fā)現(xiàn)CNE-2R-CD133+細胞核大，異型，核仁大，細胞器肥大（圖6），說明CNE-2RCD133+移植瘤細胞惡性度高于CNE-2-CD133+。

圖5 CNE-2-CD133+及CNE-2R-CD133+裸鼠移植瘤細胞的HE染色Eig.5 CNE-2-CD133+and CNE-2R-CD133+xenografts in nude mice by HE staining

3 討 論

腫瘤干細胞（tumor stem cells，TSCs）是一種極少數(shù)的增殖特性失控、可形成腫瘤、具有干細胞特性的腫瘤細胞［3］，是形成不同分化程度腫瘤細胞和腫瘤增長、復發(fā)及轉移的根源。TSC具有自我更新、分化潛能、高致瘤性、耐藥性及放射抗拒性［4］。

圖6 CNE-2-CD133+及CNE-2R-CD133+裸鼠移植瘤細胞的電鏡觀察Eig.6 Electron microscopic examination of CNE-2-CD133+ and CNE-2R-CD133+xenografts in nude mice

目前，已有鼻咽癌腫瘤干細胞系的系列研究，但放射耐受性細胞的相關研究尚未見報道［5］。鼻咽癌干細胞放射抗拒是否直接與放射線損傷修復的能力有關，是否伴隨DNA損傷應答提前、修復迅速的機制及相關基因通路參與［6］；此外，腫瘤干細胞的放射抗拒性是否涉及到細胞凋亡、細胞周期、DNA損傷、基因組穩(wěn)定和DNA修復、血管生成等多個信號轉導通路，是否與腫瘤干細胞的自我更新及增殖相關通路的激活等相關，均可通過高通量分子生物信息學技術進行進一步深入研究［7］。

CD133被認為是多種腫瘤干細胞的表面標記物，是當前腫瘤干細胞篩選的主要手段［8］。本文首次針對一對來源相同，放射敏感性不同的鼻咽癌CNE-2細胞及CNE-2R細胞采用免疫磁珠法分離、篩選鑒定人鼻咽癌CNE-2及放射耐受CNE-2R的CD133+細胞。研究表明，在鼻咽癌細胞株CNE-2及CNE-2R細胞中均可用免疫磁珠分選方法可高效分選出CD133陽性表達的細胞，但二者陽性表達率不同，放射抗拒的CNE-2R細胞具有更高比例的腫瘤干細胞。

我們進一步在無血清成球實驗、體外增殖能力，裸鼠體內成瘤試驗中發(fā)現(xiàn)，CNE-2R-TSC細胞增長幅度均大于CD133-與未分選細胞（P＜0.05）。CNE-2R-TSC CD133+組的細胞增長幅度最大，軟瓊脂克隆形成能力，裸鼠體內成瘤能力均優(yōu)于CNE-2-TSC及CNE-2R細胞。

我們認為鼻咽癌細胞中存在一定的腫瘤干細胞，但放射敏感性不同的腫瘤細胞中干細胞比例不同，而且其體外增值能力、成瘤能力及微觀形態(tài)均有明顯的差異，提示鼻咽癌放射敏感性與腫瘤細胞中腫瘤干細胞的存在明顯相關，而且放射抗拒的細胞組群中具有更強的自我更新及增殖能力［9］。鼻咽癌細胞中腫瘤干細胞的存在是決定細胞放射敏感性的關鍵因素［10］。

我們認為從腫瘤干細胞角度研究細胞放射抗拒的機制可以從下面幾個方面做進一步研究［11］：①腫瘤干細胞放射敏感性調節(jié)相關的信號轉導通路；②腫瘤干細胞微環(huán)境的改變與腫瘤干細胞放射生物學行為的相關性；③根據腫瘤干細胞放射抗拒生物學機制，探尋逆轉關鍵靶點，以求探索新的調控放射敏感性機制［12］。

我們進一步將在此研究基礎上研究不同細胞用不同劑量射線照射后細胞的輻射敏感性，檢測其照射后細胞周期及細胞凋亡的改變，DNA放射性損傷的檢測以及DNA損傷信號通路相關通路基因及蛋白的檢測，探討鼻咽癌放射抗拒的機制，闡明其分子調控途徑和基因表達譜［13］。進一步發(fā)掘新的鼻咽癌輻射敏感性的調控靶點，為提高鼻咽癌放療療效及放射防護提供理論依據。

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（編輯 韓維棟）

Screening and identification of tumor stem cells in radioresistance human nasopharyngeal carcinoma

WANG Ya-Li，WANG Zhong-Wei，REN Hong-tao，JING Ying-ying，LI Yi
（Department of Oncology，the Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University Health Science Center，Xi'an 710004，China）

Objective To isolate，screen and identify human nasopharyngeal carcinoma CNE-2 and radioresistance CNE-2R cancer stem cells.Methods The CNE-2 and CNE-2R CD133+stem cells were sorted with flow cytometry and immunomagnetic beads.The CNE-2-CD133+and CNE-2R-CD133+stem cells were detected for the abilities of tumor sphere formation and proliferation in vitro.The clonogenic ability of CD133+ stem cell was detected by plate clone formation assay and tumorigenicity was detected by nude mice test in vivo. Morphological changes were observed with HE staining and electron microscopy.Results CD133+was expressed（1.79±0.16）%and（2.63±0.72）%in CNE-2 and CNE-2R cells，respectively.The clonogenic ability and tumor sphere formation ability of CNE-2R CD133+cells were much greater than those of CD133-cells.The ability of proliferation of CD133+cell sorted in vitro，especially CNE-2R-CD133+cells，was stronger than that of CD133-cells.The morphological results showed that the nucleus of CNE-2R-CD133+cells was larger and irregular with big nucleolus and organelles.Conclusion Nasopharyngeal CNE-2R-CD133+tumor stem cells isolated and screened can form tumor sphere.The abilities of proliferation and tumorigenesis are stronger.The identification of CNE-2R TSC provides foundation for further studies on the mechanism of radioresistance of nasopharyngeal carcinoma.

nasopharyngeal carcinoma；radioresistance；tumor stem cell

R739.63

A

10.7652/jdyxb201505015

2015-01-11

2015-03-30

國家自然科學基金資助項目（No.81141097）Supported by the National Natural Science Eoundation of China（No.81141097）

王亞利.E-mail：yal1wang72@163.com

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150721.0945.004.html（2015-07-21）