低氧誘導(dǎo)腎上腺髓質(zhì)素對(duì)卵巢癌細(xì)胞及在體腫瘤的生長(zhǎng)促進(jìn)作用

周美芳，陳麗萍，呂杰強(qiáng)

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江溫州 325000；2.溫州市中西結(jié)合醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江溫州 325000）

低氧誘導(dǎo)腎上腺髓質(zhì)素對(duì)卵巢癌細(xì)胞及在體腫瘤的生長(zhǎng)促進(jìn)作用

周美芳1，2，陳麗萍2，呂杰強(qiáng)1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江溫州 325000；2.溫州市中西結(jié)合醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江溫州 325000）

目的 觀察低氧情況下腎上腺髓質(zhì)素（ADM）對(duì)卵巢癌細(xì)胞及在體腫瘤的生長(zhǎng)促進(jìn)作用。方法 三種卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780、SKOV3、HO-8910于低氧環(huán)境中培養(yǎng)6～24 h，采用RT-PCR分析ADM、低氧誘導(dǎo)因子1α（HIE-1α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGE）的mRNA表達(dá)改變。通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染獲得穩(wěn)定表達(dá)ADM-shRNA的HO-8910細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ADM表達(dá)沉默后卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡比例。建立卵巢癌細(xì)胞裸鼠荷瘤模型，各組裸鼠每天腹腔內(nèi)注射5 mg/kg的順鉑或皮下瘤內(nèi)注射10μg/kg的ADM-shRNA，觀察腫瘤體積變化并采用Western blot檢測(cè)ADM蛋白表達(dá)。結(jié)果 HO-8910細(xì)胞24 h低氧使ADM mRNA表達(dá)上升4.13倍（P＜0.000 1），VEGE、HIE-1α的mRNA表達(dá)則比對(duì)照組升高3.46（P＜0.01）和3.91倍（P＜0.000 1）。轉(zhuǎn)染72 h后，sh ADM組細(xì)胞ADM蛋白表達(dá)量比對(duì)照組降低48.2%（P＜0.05），mRNA比對(duì)照組降低26.9%（P＜0.000 1）。sh ADM組凋亡細(xì)胞比例顯著高于正常組（sh ADM組：42.65%；正常組：8.4%；二者相比P＜0.01）。順鉑+sh ADM組的抑瘤率為71.39%，顯著高于順鉑+ PBS組的39.21%（P＜0.001）或者鹽水+sh ADM組的49.45%（P＜0.05）。結(jié)論 低氧環(huán)境可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞ADM表達(dá)增加，激活VEGE和HIE-1相關(guān)信號(hào)通路，繼而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)存活。ADM基因沉默能顯著促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡并加強(qiáng)順鉑對(duì)裸鼠在體瘤的抑瘤作用，因此可能成為卵巢癌基因治療的潛在的靶點(diǎn)。

腎上腺髓質(zhì)素；卵巢癌；順鉑；凋亡

腎上腺髓質(zhì)素（adrenomedullin，ADM）是血管生成肽家族的一個(gè)重要成員，最初從人嗜鉻細(xì)胞瘤中分離而得來(lái)［1］。研究發(fā)現(xiàn)，ADM在細(xì)胞分裂及細(xì)胞在缺氧環(huán)境中存活具有作用［2］。ADM通過誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡和通過激活多種信號(hào)途徑調(diào)控促癌基因的表達(dá)，如低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIE-1）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGE）等，繼而在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。ADM蛋白的過表達(dá)被認(rèn)為與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。例如，最近有研究報(bào)道，在肝細(xì)胞癌［3］、前列腺癌［4］、宮頸癌［5］、卵巢癌［6］等多種腫瘤中表達(dá)異常。因此，ADM可能是一種重要的促腫瘤增殖及腫瘤細(xì)胞凋亡抑制因子，同時(shí)研究ADM的作用機(jī)制為腫瘤的基因治療提供了潛在的靶點(diǎn)。從對(duì)ADM蛋白表達(dá)進(jìn)行RNA干涉的實(shí)驗(yàn)手段為切入點(diǎn)，我們對(duì)ADM在3種卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)進(jìn)行了研究，并觀察了ADM基因沉默結(jié)合傳統(tǒng)抗癌藥物順鉑對(duì)在體腫瘤的生長(zhǎng)抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780、SKOV3、HO-8910購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。上述細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中并添加150 g/L小牛血清蛋白，設(shè)定細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)環(huán)境為200 m L/L O2，50 m L/L CO2，37℃恒溫。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為BALB/c-nu裸鼠，4～6周齡，體質(zhì)量為20～22 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理原則。單克隆兔抗ADM、抗GAPDH抗體購(gòu)自Abcam公司。人ADM-shRNA質(zhì)粒、非靶向性對(duì)照質(zhì)粒（NC-sh RNA）、抗VEGE和抗HIE-1抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。其他藥品均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

1.2 卵巢癌細(xì)胞的低氧誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞A2780、SKOV3、HO-8910培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，每種細(xì)胞分為四組接種于6孔板：①低氧6 h組，②低氧12 h組，③低氧24 h組，④正常對(duì)照組。每一組均包括三個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，低氧24 h組首先暴露于低氧環(huán)境中（設(shè)定培養(yǎng)箱環(huán)境為：10 m L/L O2，50 m L/L CO2，940 m L/L N2，恒溫37℃），隨后分別于12 h和18 h后培養(yǎng)箱中依次放入低氧12 h組和低氧6 h組以誘導(dǎo)低氧狀態(tài)。正常對(duì)照組細(xì)胞則同時(shí)在正常培養(yǎng)環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后所有細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，提取總蛋白及總RNA以進(jìn)行進(jìn)一步分析測(cè)定。

1.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HO-8910細(xì)胞穩(wěn)定傳代后接種于6孔板（密度約每孔1×105個(gè)細(xì)胞），依照產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行人ADM-sh RNA質(zhì)粒及NC-sh RNA轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞。同時(shí)采用可表達(dá)綠色熒光蛋白的cop GEP質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染以監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72 h后，培養(yǎng)基中加入7.0μg/m L嘌呤霉素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選，篩選后的A2780細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)ADM-sh RNA。

1.4 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)選取生長(zhǎng)良好的HO-8910卵巢癌細(xì)胞持續(xù)培養(yǎng)48 h，達(dá)到90%以上融合度時(shí)，常規(guī)胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5× 107/m L。裸鼠在超凈生物層流架內(nèi)常規(guī)消毒后，背側(cè)皮下注射0.2 m L細(xì)胞懸液，每組注射6只。接種腫瘤細(xì)胞后，將裸鼠送回籠罩自由攝取食料及水，每天觀察小鼠的飲食、精神、二便等一般狀況并稱重，連續(xù)觀察3周。接種1周左右，可見接種部位皮下長(zhǎng)出米粒大小的硬結(jié)，為移植瘤模型建成。

待皮下腫瘤成瘤后，裸鼠隨機(jī)分為6組（每組n =6），分別為：①鹽水+PBS組、②鹽水+NC-sh RNA組、③鹽水+sh ADM組、④順鉑+PBS組、⑤順鉑+ NC-shRNA組、⑥順鉑+sh ADM組。各組裸鼠每天腹腔內(nèi)注射5 mg/kg的順鉑或皮下腫瘤內(nèi)注射10 μg/kg的ADM-shRNA。對(duì)照組分別腹腔注射等體積鹽水、皮下腫瘤內(nèi)注射PBS或NC-sh RNA作為對(duì)照。每隔3 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤結(jié)節(jié)的長(zhǎng)徑（A）、短徑（B），按公式“體積=（A×B2）/2”計(jì)算出腫瘤近似體積。連續(xù)觀察28 d，根據(jù)計(jì)算所得的腫瘤體積繪制腫瘤移植瘤生長(zhǎng)曲線并計(jì)算腫瘤抑制率。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)采用拉頸處死，解剖取出腫瘤組織，稱重后分兩份保存，以備提取蛋白、RNA，進(jìn)行后續(xù)分析之用。

1.5 Western blot分析收集待檢細(xì)胞或組織樣本放入離心管中，加入預(yù)冷的RIPA組織裂解液（含磷酸酶抑制劑及蛋白酶抑制劑）進(jìn)行充分裂解（組織樣本進(jìn)行勻漿），將裂解物依次進(jìn)行變性、離心。將蛋白加樣到SDS-PAGE凝膠中電泳。電泳后半干法轉(zhuǎn)移到PVDE膜上，100 m L/L脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入抗ADM、抗VEGE、抗HIE1α和抗GAPDH抗體（抗體稀釋濃度均為1∶1 000），4℃孵育過夜。TBST洗膜后再用相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光，Quantity One凝膠圖像處理系統(tǒng)（美國(guó)伯樂公司）照相并分析目標(biāo)帶的分子量。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)收集待檢細(xì)胞或組織樣本，采用RNAiso Plus Kit試劑盒（Ta KaRa公司）提取總RNA，乙醇干燥后，將所得RNA溶于無(wú)RN酶純水中，紫外分光光度計(jì)定量。PrimeScript RT Kit試劑盒（Ta KaRa公司）對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，cDNA合成反應(yīng)條件（20μL體系）如下：1.0μg總RNA，加入4.0μL 5×PrimeScript Buffer，1.0μL Oligod T Primer，1.0μL PrimeScript RT Enzyme MixⅠ，1.0μL Random 6mers，加RNase Eree d H2O至終體積20μL，于37℃反應(yīng)15 min，85℃反應(yīng)5 s。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)使用伯樂公司IQ5熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)體系為25μL，其中逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA模板）2.0μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）12.5μL，引物各1.0μL，加入去離子水至終體積25 μL，放置于PCR儀擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件如下：預(yù)變性為95℃30 s一個(gè)循環(huán)；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃變性5 s，65℃退火延伸30 s，40次循環(huán)；溶解曲線檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性，分析條件為95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，溫度間隔0.5℃/s。各擴(kuò)增基因引物序列如下：ADM上游引物5＇-ACTTGGCAGATCACTCTCTTAGCA-3＇，下游引物5＇-ATCAGGGCGACGGAAACC-3＇；VEGE上游引物5＇-GCACCCATGGCAGAAGG-3＇，下游引物5＇-GGGGTACCCCTCACCGCCTCGGCTTGTC-3＇；HIE-1α上游引5＇-GAAAGCGCAAGTCCTCAAAG-3＇，下游引物5＇-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3＇；GAPDH上游引物5＇-CAAATTCCATGGCACCGTC-3＇，下游引物5＇-CCCATCTGATTTTGGAGGGA-3＇。采用比較Ct值法分析各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間目的基因擴(kuò)增的相對(duì)變化，通過根據(jù)公式Eolds=2-△△Ct計(jì)算各檢測(cè)目的基因相對(duì)于GAPDH的相對(duì)表達(dá)量。其中△△Ct=實(shí)驗(yàn)組（Ct目的基因-CtGAPDH）-對(duì)照組（Ct目的基因-CtGAPDH）。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)收集細(xì)胞樣本，用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，PBS沖洗兩次，1 000 r/min離心5 min。加入結(jié)合緩沖液200μL重懸細(xì)胞，加入10μL PI溶液（20μg/m L）和5μL Annexin V混勻后室溫避光染色15 min后上EACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)。將Annexin V染色陽(yáng)性而PI染色陰性的細(xì)胞判定為凋亡細(xì)胞。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用統(tǒng)計(jì)軟件包GraphPad Prism 5.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組之間用單因素方差分析（對(duì)在體腫瘤生長(zhǎng)體積結(jié)果使用雙因素方差分析）和Dunnet-t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和比較，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 低氧誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞ADM、VEGF、HIF-1α的mRNA表達(dá)情況RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境下（圖1），在A2780卵巢癌細(xì)胞中ADM的m RNA表達(dá)隨低氧時(shí)間的增加而出現(xiàn)顯著增高（E（3，8）= 9.054，P=0.006 7）。其中，24 h低氧組ADM的mRNA表達(dá)量比對(duì)照組升高3.72倍（P＜0.000 1）。而VEGE、HIE-1α的mRNA表達(dá)量同樣隨低氧時(shí)間延長(zhǎng)而出現(xiàn)不同程度的升高（VEGE：E（3，8）=5.370，P=0.036 4；HIE-1α：E（3，8）=7.288，P=0.029 7）。在SKOV3細(xì)胞系中，單因素方差分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境對(duì)ADM、VEGE、HIE-1α的表達(dá)都有顯著影響（ADM：E（3，8）=26.018，P=0.006 5；VEGE：E（3，8）= 10.661，P=0.008 7；HIE-1α：E（3，8）=49.9，P＜0.000 1）。在HO-8910細(xì)胞系，低氧環(huán)境下ADM、VEGE、HIE-1α的表達(dá)同樣顯著增高（ADM：E（3，8）= 11.51，P=0.0096；VEGE：E（3，8）=4.304，P=0.041 2；HIE-1α：E（3，8）=11.7，P=0.008 7）。多重比較發(fā)現(xiàn)，24 h低氧使ADM mRNA表達(dá)上升4.13倍（P＜0.000 1）。與之相對(duì)應(yīng)，VEGE、HIE-1α的表達(dá)則比對(duì)照組升高3.46（P=0.007 9）和3.91倍（P＜0.000 1）。以上結(jié)果表明，低氧能使卵巢癌細(xì)胞中ADM高表達(dá)，并誘導(dǎo)促癌基因VEGE、HIE-1α的表達(dá)增高。

2.2 ADM基因沉默對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響卵巢癌細(xì)胞HO-8910進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率達(dá)到87.1%，轉(zhuǎn)染效率較高。轉(zhuǎn)染72 h后對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行蛋白及mRNA表達(dá)分析（圖2A），sh ADM組細(xì)胞的ADM表達(dá)量比對(duì)照組降低48.2%（P=0.054 4），mRNA比對(duì)照組降低26.9%（P＜0.000 1），而NC-shRNA組ADM蛋白及mRNA表達(dá)與正常對(duì)照組無(wú)差異。這表明通過轉(zhuǎn)染ADM-shRNA成功沉默了ADM在細(xì)胞中的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如圖2B所示。穩(wěn)定表達(dá)ADM-shRNA的HO-8910細(xì)胞其凋亡細(xì)胞比例顯著高于正常組（sh ADM組：42.65%；正常組：8.4%；二者相比P=0.003 1）。而NC-sh RNA組與正常組相比無(wú)顯著性差異（NC-sh RNA組：12.2%；二者相比P=0.461）。表明ADM基因沉默可顯著促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡。

圖1 低氧環(huán)境下卵巢癌細(xì)胞ADM、VEGF、HIF-1α的mRNA表達(dá)Eig.1 ADM，VEGE and HIE-1αmRNA expressions in ovarian cancer cells under hypoxia condition

2.3 ADM基因沉默對(duì)卵巢癌在體腫瘤生長(zhǎng)的影響裸鼠荷瘤7 d后，每天腹腔給予順鉑或皮下腫瘤內(nèi)注射ADM-sh RNA，連續(xù)21 d。其中，鹽水+PBS為空白對(duì)照組，鹽水+NC-sh RNA為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組，鹽水+sh ADM為ADM m RNA干擾組，順鉑+ PBS為順鉑治療組，順鉑+NC-sh RNA為順鉑合并質(zhì)粒轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組，而順鉑+sh ADM則為順鉑合并sh ADM聯(lián)合治療組。各組裸鼠腫瘤近似生長(zhǎng)體積如圖3A所示。各組裸鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)（第28天）的腫瘤體積、腫瘤抑制率見表1。

表1 荷瘤28 d后各組裸鼠的腫瘤體積和腫瘤抑制率Tab.1 The tumor volume and tumor inhibition rate of nude mice 28 d after tumor xenograft（n=6）

結(jié)果表明與空白對(duì)照組相比，腹腔注射順鉑的各組裸鼠腫瘤體積有明顯減小。而順鉑+sh ADM組的抑瘤率高達(dá)71.39%，顯著高于順鉑治療組的39.21%或單純ADM mRNA干擾組的49.45%（P=0.0347）。雙因素方差分析腫瘤組織內(nèi)的ADM蛋白表達(dá)量（圖3B），結(jié)果表明腹腔注射順鉑（E1，30=8.37，P=0.005 7）和瘤內(nèi)注射ADM-shRNA（E2，30=27.59，P＜0.000 1）對(duì)腫瘤生長(zhǎng)都具有一定抑制作用。此外，順鉑和ADM-sh RNA還具有顯著的交互作用（E2，30=0.66，P= 0.046 6）。多重檢驗(yàn)表明，ADM干擾組的ADM蛋白表達(dá)顯著低于空白組（P=0.008 7），順鉑+ sh ADM組的ADM蛋白表達(dá)顯著低于順鉑治療組（P＜0.000 1）。此外，順鉑+sh ADM組與鹽水+ sh ADM組的ADM蛋白表達(dá)量相比沒有顯著性差異（P=0.421 4）。以上結(jié)果表明，順鉑與ADM基因沉默對(duì)裸鼠在體瘤具有顯著的協(xié)同抑瘤作用。

3 討 論

卵巢癌是發(fā)生于卵巢組織的惡性腫瘤，起病隱匿、易轉(zhuǎn)移，占所有婦科惡性腫瘤的15%左右，由于其發(fā)展迅速、易復(fù)發(fā)、化療耐藥，患者5年存活率僅有30%左右［7］。因此，探索新的診斷和治療靶點(diǎn)具有十分重要的意義。

圖2 ADM基因沉默對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響Eig.2 The effect of ADM silencing on apoptosis of ovarian cancer cells

圖3 ADM基因沉默在裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)中的作用Eig.3 The effect of ADM gene silencing on tumor growth in vivo

ADM具有廣泛的生理調(diào)節(jié)功能。JI等［8］報(bào)道，ADM通過增加c AMP和c-fos表達(dá)，能夠促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂。ADM也在許多的腫瘤中廣泛表達(dá)，提示它可能是一個(gè)重要的腫瘤生長(zhǎng)因子，并且可促進(jìn)腫瘤血管生成。CUTTITTA等［9］探索了ADM和其受體在肺癌細(xì)胞系的表達(dá)情況，認(rèn)為ADM可能是腫瘤細(xì)胞的自分泌或旁分泌生長(zhǎng)因子，且對(duì)于不同類型的腫瘤細(xì)胞增殖有著不同的影響。本實(shí)驗(yàn)在缺氧的條件下培養(yǎng)A2780、SKOV3、HO-8910三種卵巢癌細(xì)胞，在不同的缺氧誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)（0～24 h）使用RT-PCR檢測(cè)ADM m RNA的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)于常氧條件下，缺氧誘導(dǎo)能誘導(dǎo)各組細(xì)胞ADM表達(dá)加強(qiáng)。A2780與HO-8910細(xì)胞在缺氧誘導(dǎo)6 h后ADM的表達(dá)即有明顯增高，且隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，ADM的表達(dá)與缺氧誘導(dǎo)的時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系。ADM基因敲除小鼠在生長(zhǎng)過程中出現(xiàn)血管發(fā)育異常［10］，相比于野生型小鼠的血管發(fā)育情況，ADM基因敲除小鼠的末端組織血液灌注水平低，側(cè)支循環(huán)網(wǎng)交通不充分，組織內(nèi)血氧分壓低，表明ADM是必不可少的血管形態(tài)發(fā)生因子。此外，有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞低氧環(huán)境可導(dǎo)致ADM過表達(dá)［11］。以上的證據(jù)進(jìn)一步支持了本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，提示組織缺氧狀態(tài)有可能刺激腫瘤細(xì)胞過度產(chǎn)生和分泌ADM，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在低氧狀態(tài)下的自我保護(hù)。

在本實(shí)驗(yàn)中還觀察到ADM的表達(dá)改變伴隨了VEGE、HIE-1基因的表達(dá)升高。卵巢癌是一種多血管實(shí)體瘤，隨著腫瘤體積增加及卵巢癌細(xì)胞的增生、侵襲轉(zhuǎn)移，大量腫瘤細(xì)胞由于新血管生成不足和血液循環(huán)不佳而經(jīng)常處于慢性低氧狀態(tài)下，因此缺氧被認(rèn)為在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［12］。大量研究表明，微環(huán)境缺氧可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及特定促癌基因的表達(dá)（如HIE-1、VEGE）［13］，往往預(yù)示著腫瘤化療抵抗及預(yù)后不良［14］。在微環(huán)境慢性低氧時(shí)，腫瘤細(xì)胞可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提高HIE-1和VEGE的表達(dá)，繼而激活糖酵解系統(tǒng)、血管發(fā)生系統(tǒng)、細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)重要基因的表達(dá)，最終促進(jìn)細(xì)胞存活［15］。HIE-1α可與缺氧反應(yīng)原件（hypoxia responsive element，HRE）共同結(jié)合與許多基因的啟動(dòng)子區(qū)，調(diào)控如促血管生成基因VEGE等基因轉(zhuǎn)錄活性［16］。VEGE是一種旁泌生長(zhǎng)因子，其可以結(jié)合于鄰近細(xì)胞表面的VEGE受體上激活細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶、糖原合成酶激酶-3等信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂生長(zhǎng)形成新血管，為腫瘤生長(zhǎng)提供條件［17］。此外，還有證據(jù)表明ADM可以部分介導(dǎo)VEGE和HIE-1相關(guān)信號(hào)通路的激活［18-19］。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)A2780、SKOV3、HO-8910三種卵巢癌細(xì)胞中，HO-8910對(duì)12～24 h的低氧更為敏感，因而我們選擇使用該細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)ADM-shRNA的細(xì)胞。

證據(jù)表明ADM具有調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用，其具體效應(yīng)依細(xì)胞種類及實(shí)驗(yàn)條件的變化而有所不同［20］。在肝癌細(xì)胞中，ADM可上調(diào)c AMP并激活絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）來(lái)調(diào)控凋亡基因表達(dá)［3］。NIKITENKO等［2］發(fā)現(xiàn)ADM可上調(diào)Bcl-2并激活原癌基因如Ras、Raf、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）等，從而抑制細(xì)胞凋亡。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADM基因沉默的卵巢癌細(xì)胞凋亡率顯著高對(duì)照組，說(shuō)明干擾ADM的表達(dá)可顯著促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡，提示我們ADM可能是一個(gè)重要的腫瘤生長(zhǎng)因子。然而，在卵巢癌中ADM調(diào)控作用的確切分子機(jī)制目前尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ADM信號(hào)通路能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制凋亡，此外，我們采用裸鼠荷瘤模型瘤內(nèi)注射ADM-shRNA結(jié)合腹腔給予順鉑來(lái)觀察腫瘤體積變化，發(fā)現(xiàn)ADM基因沉默顯著加強(qiáng)了順鉑對(duì)裸鼠在體瘤的抑瘤作用。

未來(lái)腫瘤治療的理想的方法是針對(duì)某一特定來(lái)源、特定病理類型的腫瘤，都有其個(gè)體化的治療方法和作用靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ADM在人卵巢癌細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá)，且在缺氧條件下進(jìn)一步表達(dá)上調(diào)并激活VEGE和HIE-1信號(hào)通路，繼而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)存活。ADM基因沉默能顯著促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡并加強(qiáng)順鉑對(duì)裸鼠在體瘤的抑瘤作用。因此，ADM可能成為卵巢癌腫瘤基因治療的潛在的靶點(diǎn)。利用RNA干涉技術(shù)如能有效抑制ADM表達(dá)并對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)控，同時(shí)結(jié)合化療藥物進(jìn)行治療，將有可能是一種更為高效、特異的卵巢癌治療方案?？傊?，ADM作為一種促腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)因子，值得進(jìn)一步深入研究。

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（編輯 韓維棟）

Hypoxia-induced adrenomedullin promotes the growth of ovarian cancer cells and hetero-grafted ovarian tumor in vivo

ZHOU Mei-fang1，2，CHEN Li-ping2，LüJie-qiang1
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000；2.Department of Obstetrics and Gynecology，the Chinese and Western Medicine Integration Hospital of Wenzhou，Wenzhou 325000，China）

Objective To observe the growth-promoting effect of adrenomedullin（ADM）on the ovarian cancer cells growth under hypoxia condition and heter-grafted tumor growth in vivo.Methods Three ovarian cancer cell lines，A2780，SKOV3 and HO-8910 cells，were incubated for 6 h to 24 h under hypoxia condition.The mRNA expressions of ADM，hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α），and vascular endothelial growth factor（VEGF）were analyzed by RT-PCR.Stable ADM-sh RNA expressing HO-8910 cells was obtained by plasmid transfection. The apoptosis rate of ovarian cancer cells was analyzed by flow cytomertry after ADM gene silence.Tumor-bearing model of ovarian cancer HO-8910 cells was established in nude mice.These mice were intraperitoneally injected with 5 mg/kg of cisplatin or subcutaneously injected with 10μg/kg of ADM-sh RNA plasmid each day.The tumor volume was measured and ADM protein expression was analyzed by Western blot.Results In HO-8910 cells under hypoxia condition for 24 h，ADM m RNA expression increased 4.13 times（P＜0.000 1），the expressions of VEGF and alpha HIF-1αwere 3.46 times（P＜0.01）and 3.91（P＜0.000 1）times higher than those in the control group，respectively.At 72 h after the transfection，ADM protein expression was 48.2%lower（P＜0.05）and mRNAexpression was 26.9%lower（P＜0.000 1）in sh ADM group compared with the control group.There was no difference between NC-sh RNA group and control group in ADM protein or mRNA expression.The apoptosis ratio in sh ADM cells was significantly higher than that in the normal group（sh ADM groups：42.65%；normal group：8.4%；P＜0.01）.The tumor inhibition rate in cisplatin+sh ADM group was 71.39%，significantly higher than that of cisplatin alone group（39.21%，P＜0.001）or sh ADM group（49.45%，P＜0.05）.Conclusion Hypoxia could induce increased ADM expression，activate VEGF and HIF-1 signal pathways，and thus promote the growth of ovarian cancer cells.ADM gene silencing can significantly strengthen the tumor-suppressive effect of cisplatin in nude mice in vivo.The ADM gene intervention may be a potential target for ovarian tumor gene therapy in the future.

adrenomedullin；ovarian cancer；cisplatin；apoptosis

R711；R737

A

10.7652/jdyxb201505013

2014-12-01

2015-01-17

浙江省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（No.2012162）Supported by the Key Program of Innovational Technology of Zhejiang Provience（No.2012162）

呂杰強(qiáng).E-mail：jieqianglu@126.com

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150721.0841.002.html（2015-07-21）