羅格列酮對自發(fā)性高血壓大鼠海馬區(qū)MCP-1、COX-2、NF-κB表達(dá)的影響及其機(jī)制

李雅麗，張巧俊，袁海峰，高登峰，牛小麟，羅 昆

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院：1.腦病科；2.心血管內(nèi)科，陜西西安 710004；3.西安市兒童醫(yī)院，陜西西安 710003）

羅格列酮對自發(fā)性高血壓大鼠海馬區(qū)MCP-1、COX-2、NF-κB表達(dá)的影響及其機(jī)制

李雅麗1，張巧俊1，袁海峰1，高登峰2，牛小麟2，羅 昆3

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院：1.腦病科；2.心血管內(nèi)科，陜西西安 710004；3.西安市兒童醫(yī)院，陜西西安 710003）

目的 觀察64周齡自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）海馬區(qū)炎癥相關(guān)因子COX-2（環(huán)氧合酶-2）、MCP-1（單核細(xì)胞趨化蛋白-1）、NE-κB（核轉(zhuǎn)錄因子-κB）、PPAR-γ（過氧化物酶體增殖激活受體-γ）的表達(dá)水平，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元改變及羅格列酮對上述指標(biāo)的影響，探討高血壓腦損傷過程中的炎癥反應(yīng)機(jī)制及PPAR-γ激動劑在高血壓腦損傷中的作用及相關(guān)機(jī)制。方法 雄性56周SHR及威斯塔京都大鼠（WKY）各10只，隨機(jī)分為2組，對照組（生理鹽水2 mL/d灌胃）和Ros組［羅格列酮5 mg/（kg·d）溶于2 m L生理鹽水中灌胃］，每組各5只，各組給藥8周，至64周齡時處死取腦。采用尼氏染色法觀察各組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷情況，Real-time PCR法檢測海馬COX-2、MCP-1 m RNA表達(dá)水平，Western blot法檢測NE-κB、PPAR-γ蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 64周齡SHR大鼠海馬區(qū)PPAR-γ蛋白表達(dá)降低，NE-κB活化（P＜0.05），MCP-1及COX-2表達(dá)升高（P＜0.05），海馬CA1區(qū)神經(jīng)元減少（P＜0.05），羅格列酮通過升高PPAR-γ表達(dá)，降低NE-κB、MCP-1及COX-2表達(dá)，逆轉(zhuǎn)了SHR大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷。結(jié)論 SHR海馬CA1區(qū)神經(jīng)元丟失明顯，NE-κB、MCP-1、COX-2等炎癥因子表達(dá)升高可能參與了高血壓神經(jīng)元損傷的病理過程，羅格列酮可通過活化PPAR-γ通路發(fā)揮抗炎及神經(jīng)保護(hù)作用。

自發(fā)性高血壓大鼠；MCP-1；COX-2；NE-κB；PPAR-γ

高血壓引起的長期慢性缺血缺氧可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，累及海馬、皮質(zhì)等與學(xué)習(xí)、記憶密切相關(guān)的腦區(qū)，是腦認(rèn)知功能下降的主要危險因素。近年來，研究顯示炎癥在高血壓靶器官損傷過程中發(fā)揮重要作用。我們前期研究證實，隨增齡自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHRs）腦內(nèi)海馬區(qū)存在炎癥活化及神經(jīng)元凋亡情況，但其機(jī)制尚不明確。羅格列酮是一種高選擇性過氧化物酶體增殖激活受體-γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPAR-γ）激動劑，在缺血性腦損傷動物模型中，通過抗炎、抗氧化應(yīng)激作用發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。羅格列酮是否可通過活化PPAR-γ通路對SHR腦組織發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用？炎癥通路在其中有何作用？通過探討羅格列酮的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制，將為PPARγ激動劑治療高血壓認(rèn)知功能障礙提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組健康雄性56周SHR大鼠和威斯塔京都大鼠（WKY）各10只，均購自上海SLAC實驗動物中心，隨機(jī)分為對照組（生理鹽水2 m L/d灌胃）和Ros組［羅格列酮5 mg/（kg·d）溶于2 mL生理鹽水中灌胃］，每組5只，共給藥8周，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)，室溫20～25℃，24 h晝夜循環(huán)光照，自由攝食飲水，到達(dá)相應(yīng)周齡時，尾動脈測壓后處死取腦。

1.2 試劑B-巰基乙醇、TEMED購于Sigma公司；Sample protectors、RNAiso、PrimeScript RT Master Mix、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ均購自Ta KaRa公司。NE-κB兔抗大鼠、β-actin小鼠抗大鼠多克隆抗體均購自Bioworlde公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、山羊抗小鼠二抗及ECL試劑盒（Amersham公司）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠尾動脈測壓 大鼠在正式實驗前，進(jìn)行為期1周的尾動脈測壓預(yù)適應(yīng)，然后將Tail-cuff壓力換能器與多導(dǎo)生理記錄儀相連，調(diào)整標(biāo)壓，將Tailcuff壓力換能器纏繞于待測大鼠尾根部，充氣后測量各組大鼠尾動脈收縮壓。

1.3.2 標(biāo)本收集及測定 各組大鼠達(dá)相應(yīng)周齡尾動脈測壓后，腹腔注射100 g/L水合氯醛（500 mg/kg），麻醉后處死，冰上剝離鼠腦。用預(yù)冷的生理鹽水洗凈表面血液并吸干殘留水分后，一部分貯存在標(biāo)本保護(hù)液（sample protector，Ta KaRa），液氮中保存以便進(jìn)行Real-time PCR及Western blot檢測。另一部分迅速貯存在預(yù)冷的新鮮40 g/L多聚甲醛中，4℃過夜，石蠟包埋，用于甲苯胺藍(lán)染色檢測。

1.3.3 甲苯胺藍(lán)染色 切片經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ和梯度酒精脫蠟入水，甲苯胺藍(lán)染色10 min，700 m L/L乙醇分色，梯度酒精脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。觀察每只大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量，每個大鼠3張切片，選取層面為前囟后3.72～3.96 mm，40倍目鏡下隨機(jī)取5個視野，圖像分析儀（Q550CW，德國萊卡公司）計數(shù)單位面積神經(jīng)元數(shù)量。

1.3.4 Real-time EQ-PCR分析 Trizol法提取各組大鼠海馬區(qū)總RNA，PrimeScript RT Master Mix盒子（Ta KaRa）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用SYBR Premix Ex TaqTMⅡKit（Ta KaRa）進(jìn)行Real-time EQ-PCR實驗。MCP-1（上游序列：5＇-CTATGCAGGTCTCTGTCACGCTTC-3＇，下游序列：5＇-CAGCCGACTCATTGGGATCA-3＇）、COX-2（上游序列：5＇-CGGAGGAGAAGTGGGGTTT-3＇，下游序列：5＇-GTTGATGGTGGCTGTCTTGG-3＇）和β-actin（上游序列：5＇-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3＇，下游序列：5＇-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3＇），序列均由Ta KaRa公司設(shè)計并合成。在iQ Multicolor Real-Time PCR detection system（Bio-Rad，Hercules，CA）儀器進(jìn)行Real-time EQ-PCR實驗。每個基因的m RNA水平都用其β-actin m RNA水平來調(diào)整。Ct值由Bio-Rad iQ5 2.0標(biāo)準(zhǔn)Edition optical系統(tǒng)軟件獲得，并用2-△△Ct法分析。每組3個樣，進(jìn)行3次獨立實驗。

1.3.5 Western blot 從Sample protector里取出海馬組織后提取蛋白質(zhì)，BCA測試盒測定各組蛋白質(zhì)濃度，并調(diào)整一致，蛋白變性后制取120 g/L瓊脂糖凝膠，各組等量上樣進(jìn)行電泳，電泳完畢后，將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上。100 g/L脫脂奶粉封閉，加入兔抗大鼠NE-κB（1∶1 000，Bioworld）或兔抗大鼠PPAR-γ（1∶1 000，Bioworld）及小鼠抗大鼠β-actin（1∶1 000，Bioworld）多克隆抗體，4℃過夜。TBST洗滌3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（羊抗兔或羊抗小鼠IgG）孵育，ECL化學(xué)發(fā)光法發(fā)光，X光片記錄結(jié)果。蛋白條帶進(jìn)行相對密度掃描并分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，用析因分析的方差分析檢測種族與給藥與否兩因素對各指標(biāo)的交互效應(yīng)及主效應(yīng)，然后對主效 應(yīng)顯著的變量采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行LSD組間檢驗，方差分析前均先進(jìn)行檢驗方差齊性及正態(tài)性分布，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血壓監(jiān)測情況的比較結(jié)果顯示，SHR組SBP較WKY對照組明顯升高（P＜0.01）。SHR Ros組較SHR組無明顯差異（P＞0.05）。WKY對照組和Ros組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表1）。統(tǒng)計結(jié)果顯示，種族與給藥與否對于SBP結(jié)果無交互作用，種族對SBP水平有顯著影響，給藥與否對SBP水平無顯著影響。

圖1 各組海馬CA1區(qū)尼氏小體的組織形態(tài)學(xué)變化Eig.1 Nissl's staining of CA1 subfield of the hippocampus in different groups（×400）

表1 各組大鼠血壓監(jiān)測情況的比較Tab.1 Comparison of blood pressure in different groups（±s，mm Hg）

表1 各組大鼠血壓監(jiān)測情況的比較Tab.1 Comparison of blood pressure in different groups（±s，mm Hg）

與64周SHR組比較，*P＜0.01。

組別例數(shù)SBP值（mm Hg）64周SHR組193.9±11.3 64周WKY組5 110.0±9.8*SHR Ros組5 187.5±12.6 WKY Ros組5 5 105.5±4.4

2.2 各組海馬CA1區(qū)尼氏小體的組織形態(tài)學(xué)變化高倍鏡下觀察，WKY組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞核著色不明顯，核內(nèi)有1～3個深藍(lán)色核仁，胞質(zhì)內(nèi)可見藍(lán)色的顆粒狀物質(zhì)，即為尼氏小體。由圖中可以觀察到，WKY組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)尼氏小體數(shù)量多、染色深，SHR組尼氏小體數(shù)量減少、染色變淡，提示其神經(jīng)元存在損傷，SHR Ros組神經(jīng)元數(shù)量和形態(tài)處于SHR組及WKY組之間（圖1）。

比較各組大鼠海馬CA1區(qū)單位面積的神經(jīng)元數(shù)目，可以觀察到，SHR組單位面積神經(jīng)元數(shù)目較WKY對照組明顯減少（P＜0.01），SHR Ros組較SHR組神經(jīng)元數(shù)目增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而WKY對照組與Ros組兩組之間神經(jīng)元數(shù)目無明顯變化（圖2）。

2.3 各組海馬區(qū)COX-2、MCP-1 mRNA表達(dá)水平的比較各組大鼠海馬組織中MCP-1、COX-2 m RNA表達(dá)水平如圖3所示：SHR組COX-2、MCP-1 m RNA水平顯著高于WKY組（P＜0.01），羅格列酮治療后SHR組的COX-2、MCP-1 mRNA水平明顯降低（分別為P＜0.05，P＜0.01），其中COX-2 m RNA表達(dá)較WKY對照組仍有差異（P＜0.01）。WKY對照組和Ros組兩組之間COX-2、MCP-1 m RNA表達(dá)無差異（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)單位面積的神經(jīng)元數(shù)目的比較Eig.2 Comparison of the number of neurons in CA1 subfield of the hippocampus in different groups

圖3 各組大鼠海馬組織中COX-2、MCP-1 mRNA表達(dá)水平的比較Eig.3 Comparison of COX-2 and MCP-1 m RNA expressions in the hippocampus of different groups

2.4 各組海馬區(qū)NF-κB、PPAR-γ蛋白表達(dá)水平的比較如圖4所示，與WKY組相比，SHR組的NE-κB蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），PPAR-γ蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01），羅格列酮明顯升高了SHR組腦內(nèi)代償不足的PPAR-γ蛋白表達(dá)水平（P＜0.01），降低SHR組升高的NE-κB蛋白表達(dá)水平（P＜0.01）。WKY對照組和藥物組之間NE-κB、PPAR-γ蛋白表達(dá)水平無明顯差異（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠海馬組織中NF-κB、PPAR-γ蛋白表達(dá)水平的比較Eig.4 The protein expressions of NE-κB（A）and PPAR-γ（B）in the hippocampus of different groups

3 討 論

卒中前高血壓腦損傷的病理機(jī)制為長期慢性缺血、缺氧所致的神經(jīng)元凋亡，主要累及海馬、皮質(zhì)等與學(xué)習(xí)、記憶密切相關(guān)的腦區(qū)，臨床表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙。高血壓誘導(dǎo)過量的活性氧產(chǎn)物（reactive oxygen species，ROS）生成，活化NE-κB并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，這可能是高血壓進(jìn)展過程中的早期事件［1］。COX-2和MCP-1為NE-κB的下游炎癥反應(yīng)指標(biāo)。前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，隨增齡，SHR海馬區(qū)NE-κB激活，COX-2、MCP-1表達(dá)升高，神經(jīng)元凋亡增多［2］，但其機(jī)制仍不明確。本研究證實，高血壓腦內(nèi)存在PPARγ表達(dá)顯著下調(diào)，羅格列酮可通過上調(diào)PPAR-γ改善SHR腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞。

SHR是用于評估高血壓腦損傷及治療最常用的高血壓動物模型。高血壓腦損傷主要累及額枕葉皮質(zhì)、海馬等腦區(qū)，導(dǎo)致神經(jīng)元丟失范圍擴(kuò)大。尼氏小體是存在于神經(jīng)元中的一種嗜堿性物質(zhì)，主要功能是合成蛋白質(zhì)，對病理反應(yīng)非常敏感，在炎癥、變性、中毒等情況下，可發(fā)生溶解、消失，表現(xiàn)為數(shù)量減少、染色變淡，故被作為評價神經(jīng)元功能的重要指標(biāo)。本研究觀察到WKY大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元胞漿內(nèi)尼氏小體數(shù)量多、染色深，SHR組尼氏小體數(shù)量減少、染色變淡，SHR ROS組神經(jīng)元數(shù)目及形態(tài)介于兩者之間。提示高血壓海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷明顯，羅格列酮治療可改善神經(jīng)元損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

COX-2是合成前列腺素過程中的限速酶，正常情況下低水平表達(dá)于皮質(zhì)、海馬、杏仁核、下丘腦和脊髓等部位的神經(jīng)元，多種病理信號能誘導(dǎo)COX-2基因過度表達(dá)，通過炎癥反應(yīng)參與組織損傷。本研究觀察到SHR腦內(nèi)COX-2表達(dá)顯著升高，提示其在高血壓腦損傷中發(fā)揮重要作用。這與以往有關(guān)COX-2與SHR腦缺血損傷關(guān)系的研究結(jié)果一致。COX-2表達(dá)上調(diào)參與了SHR腦缺血損傷過程［3］。腦缺血后腹腔注射COX-2抑制劑可減少腦梗死的體積和神經(jīng)功能缺失［4］。MCP-1是由多種細(xì)胞分泌的趨化因子，可趨化、激活炎癥細(xì)胞，使其合成、釋放大量炎癥介質(zhì)，引發(fā)組織受損。近年來發(fā)現(xiàn)，MCP-1表達(dá)與高血壓密切相關(guān)［5］，其升高可能參與了高血壓靶器官損傷。研究發(fā)現(xiàn)，SHR的心、腎、胸主動脈等靶器官組織及外周血中MCP-1表達(dá)均較WKY大鼠顯著升高，且藥物抑制MCP-1表達(dá)可對靶器官發(fā)揮明顯保護(hù)作用［6］。本研究觀察到SHR組COX-2、MCP-1表達(dá)顯著升高，提示高血壓腦內(nèi)炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，這可能是SHR大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元減少的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。羅格列酮可降低海馬區(qū)MCP-1、COX-2表達(dá)，提示羅格列酮可能通過抗炎作用發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

NE-κB是一種與炎癥反應(yīng)相關(guān)的信號調(diào)控因子［7］。多種炎癥介質(zhì)如COX-2、MCP-1、IL-6、TNE-α的基因啟動子上均有NE-κB的結(jié)合位點，當(dāng)NE-κB與之結(jié)合后，基因被激活開始轉(zhuǎn)錄表達(dá)［8］。RODRIGUEZ-ITURBE等發(fā)現(xiàn)SHR體內(nèi)NE-κB蛋白水平升高，多種組織內(nèi)有明顯炎癥細(xì)胞浸潤，腹膜注射NE-κB抑制劑可降低NE-κB蛋白水平，減輕組織炎癥［9］。與我們之前的發(fā)現(xiàn)一致，SHR腦內(nèi)NE-κB與COX-2、MCP-1表達(dá)水平同步上調(diào)，提示NE-κB可能對COX-2、MCP-1表達(dá)有調(diào)控作用，表達(dá)上調(diào)的NE-κB可能與COX-2和MCP-1的基因啟動子結(jié)合，使COX-2和MCP-1基因激活后，轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。本研究中SHR ROS組NE-κB表達(dá)水平較SHR組明顯降低，同時伴COX-2、MCP-1表達(dá)下調(diào)，這一結(jié)果也支持NE-κB可能對COX-2、MCP-1具有調(diào)控作用這一觀點。

已有研究顯示，PPAR-γ能通過競爭抑制炎癥信號通路發(fā)揮抗炎作用，NE-κB是其中一條重要的炎癥信號通路。PPAR-γ可直接與NE-κB基因結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，下調(diào)NE-κB表達(dá)水平，抑制其下游炎癥介質(zhì)的生成［10］。動物實驗表明PPAR-γ激動劑可通過激活PPAR-γ，下調(diào)炎癥因子，改善缺血性腦損傷動物模型的神經(jīng)功能［11］。細(xì)胞實驗證實，PPAR-γ激動劑可下調(diào)體外CNS來源細(xì)胞炎癥相關(guān)因子的表達(dá)水平［12］。本研究發(fā)現(xiàn)羅格列酮可升高PPAR-γ表達(dá)水平，降低NE-κB及炎癥因子COX-2、MCP-1的表達(dá)，可能是其作為PPARγ激動劑上調(diào)腦內(nèi)代償不足的PPARγ表達(dá)，通過下調(diào)NE-κB表達(dá)水平，降低COX-2、MCP-1表達(dá)，發(fā)揮其對腦組織的保護(hù)作用。另外，本研究還觀察到羅格列酮對WKY大鼠海馬組織中COX-2、MCP-1及NE-κB的表達(dá)無影響，提示其對血壓正常腦組織中炎癥相關(guān)因子的基礎(chǔ)表達(dá)無下調(diào)作用。

總之，在高血壓腦損傷中炎癥介質(zhì)COX-2、MCP-1發(fā)揮著重要作用，NE-κB可能對COX-2和MCP-1的表達(dá)起調(diào)控作用，有可能成為治療高血壓腦損傷新的干預(yù)靶點。羅格列酮可能通過上調(diào)PPAR-γ表達(dá)，下調(diào)NE-κB及COX-2、MCP-1的表達(dá)，抑制高血壓腦組織中的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮腦保護(hù)作用，故PPARγ激動劑可能在高血壓腦損傷的治療中具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

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（編輯 韓維棟）

Effects of rosiglitazone on MCP-1，COX-2 and NF-κB expressions in spontaneously hypertensive rats

LI Ya-li1，ZHANG Qiao-jun1，YUAN Hai-feng1，GAO Deng-feng2，NIU Xiao-lin2，LUO Kun3
（1.Department of Brain Diseases；2.Department of Cardiovascular Medicine，
the Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University Health Science
Center，Xi'an 710004；3.Xi'an Children's Hospital，Xi'an 710003，China）

Objective To investigate the expressions of inflammatory factors including NF-κB，COX-2 and MCP-1 as well as the changes of neurons in the hippocampus of spontaneously hypertensive rats（SHRs）so as to explore the protective effect of peroxisome proliferator-activated receptorγ（PPARγ）agonists on hypertensioninduced brain injury and the related mechanisms.Methods Male SHR and WKY rats aged 56 weeks were divided evenly into two groups at random：control group（2 m L/d saline by lavage）and Ros group［5 mg/（kg·d）rosiglitazone dissolved in 2 m L saline by lavage］.The animals were killed at week 64 before SBP test and their brains were taken out for detection.Then Nissl's staining was performed in CA1 area；COX-2 and MCP-1 m RNA expressions were detected by Real time PCR，while NF-κB and PPARγprotein expressions were detected by Western blot.Results We found in the SHRs a decreased expression of PPARγ；upregulated expressions of NF-κB，MCP-1 and COX-2（P＜0.05）；and decreased number of neurons in CA1 subfield of the hippocampus（P＜0.05）. Rosiglitazone reversed these pathological changes and exerted neuroprotective effects through PPARγpathway. Conclusion In SHRs there is obvious loss of neurons in CA1 subfield of the hippocampus.The expressions of inflammatory factors like NF-κB，MCP-1 and COX-2 are upregulated，which may be involved in the pathologicprocess of hypertension-induced neuronal injury.Rosiglitazone can have anti-inflammatory and neuroprotective effects by activating PPAR-γpathway.

spontaneously hypertensive rat；MCP-1；COX-2；NF-κB；peroxisome proliferator-activated receptorγ（PPAR-γ）

R544.1

A

10.7652/jdyxb201505008

2015-01-07

2015-04-18

張巧俊.E-mail：Zhangqj@mail.xjtu.edu.cn

優(yōu)先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150720.1533.006.html（2015-07-20）