微電場(chǎng)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)缺氧培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移/侵襲的影響

張 娟，白 懷，范 平

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610072；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院西部婦幼醫(yī)學(xué)研究院，四川 成都 610041)

微電場(chǎng)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)缺氧培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移/侵襲的影響

張 娟1，白 懷2，范 平2

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610072；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院西部婦幼醫(yī)學(xué)研究院，四川 成都 610041)

目的 探討微電場(chǎng)(electric field，EF)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)缺氧培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移/侵襲能力的影響。方法 200 mV/mm微電場(chǎng)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)5 h，收集培養(yǎng)上清。Transwell 體外侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)觀察EF刺激內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)3% O2物理缺氧培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移/侵襲功能的影響。采用Western blot和熒光定量RT-PCR檢測(cè) EF刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基與滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后對(duì)缺氧培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞MMP-2(Matrix metalloproteinase 2，MMP-2)及MMP-9(Matrix metalloproteinase 9，MMP-9)分子表達(dá)的影響。結(jié)果 Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EF 200 mV/mm 刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞5 h條件培養(yǎng)基(conditioned medium，CM)與滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)，可促進(jìn)缺氧培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移/侵襲功能，其穿膜細(xì)胞數(shù)目是單純?nèi)毖醯?.62倍(P< 0.05)，遷移速度是單純?nèi)毖醯?.56倍(P< 0.05)。EF刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基與滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，可以促進(jìn)缺氧培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞的MMP-2表達(dá)；對(duì)MMP-9分子表達(dá)的影響不明顯。結(jié)論 EF刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清能促進(jìn)缺氧培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移/侵襲能力，可能與內(nèi)皮細(xì)胞作用于滋養(yǎng)細(xì)胞、促進(jìn)MMP-2分子表達(dá)增加有關(guān)。

直流微電場(chǎng)；缺氧；滋養(yǎng)細(xì)胞；內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞遷移/侵襲

在生理狀態(tài)下，妊娠胚胎植入早期絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(extravillous trophoblasts，EVT)侵入蛻膜組織和子宮螺旋動(dòng)脈，并使后者發(fā)生改建變成低阻、高容量血管，維持足夠的母體血液流入絨毛間支持胎盤的功能。滋養(yǎng)細(xì)胞適度地侵入子宮內(nèi)膜是維持妊娠和胎兒發(fā)育的前提條件。EVT侵入不足所致的胎盤缺血缺氧，可導(dǎo)致異常產(chǎn)科結(jié)局如流產(chǎn)、子癇前期和胎兒宮內(nèi)生長受限等。Onogi等研究顯示[1]，低氧可抑制妊娠胎盤組織來源的EVT的侵襲功能，并與下調(diào)MMP-2分子活性有關(guān)。母胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞功能受到微環(huán)境因素的影響，包括血管內(nèi)皮等因素的作用。我們近年的研究發(fā)現(xiàn)[2]，微電場(chǎng)(electric field，EF)可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌血管生成活性因子血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)，且這些因子能促進(jìn)包括滋養(yǎng)細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的遷移等活性[3]。鑒于缺氧環(huán)境對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)活性具有顯著的影響，探討促進(jìn)這些細(xì)胞遷移/侵襲功能具有實(shí)際意義。因此，本課題擬觀察EF刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清是否對(duì)缺氧環(huán)境的滋養(yǎng)細(xì)胞遷移/侵襲功能具有促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo(加拿大Queens University提供)，人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)(英國Aberdeen大學(xué)Prof.Min Zhao提供)。醫(yī)用高純氮?dú)?N2)及醫(yī)用CO2(四川大學(xué)華西第二醫(yī)院提供)。Transwell小室(購自Millipore)，細(xì)胞培養(yǎng)板(購自Costar)，RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶等(購自GIBCO公司)。Matrigel(購自BD公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及加電 內(nèi)皮細(xì)胞以DMEM在5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基含有20%的小牛血清、0.04 mmol/L 的谷氨酰胺、青霉素104 U/L、鏈霉素100 mg/L。每次實(shí)驗(yàn)前24 h將凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后以5 ×103個(gè)細(xì)胞/cm 的密度接種于預(yù)制的細(xì)胞培養(yǎng)槽中，該培養(yǎng)槽由兩片24 mm ×22 mm、平行放置、相距10 mm的蓋玻片通過硅酮膠(Dow Corning)固定于100 mm ×20 mm 的組織培養(yǎng)皿的底面而形成一個(gè)兩端開放的細(xì)胞培養(yǎng)小室。對(duì)培養(yǎng)小室內(nèi)細(xì)胞電場(chǎng)刺激5 h后，收集培養(yǎng)上清。

1.2.2 Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn) 用無血清1640以1∶3 比例稀釋Matrigel(10 mg/L)后包被基底膜，放入37 ℃培養(yǎng)箱孵育至少半小時(shí)。取生長融合至80%的HTR-8/SVneo細(xì)胞，加入不含胎牛血清的1640培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2靜置培養(yǎng)12 h，消化細(xì)胞后用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至(7～8)×105/ml，無菌條件下取出Millicell-插入小室，放進(jìn)無菌24孔培養(yǎng)板中。在24孔板中分別加入600 μl 預(yù)熱的HUVEC加電和對(duì)照組的上清。取細(xì)胞懸液300 μl，加入包被好的Transwell上室。將加好細(xì)胞懸液的培養(yǎng)板分別放入正常培養(yǎng)狀態(tài)(5%CO2，95% O2)和缺氧狀態(tài)(5%CO2，3% O2，92% N2)培養(yǎng)細(xì)胞，均培養(yǎng)90 h。然后取出插入小室，用棉簽輕輕拭去上室濾膜內(nèi)面的基質(zhì)膠和細(xì)胞，將整個(gè)插入小室放進(jìn)24孔板中，95%酒精固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn) 用記號(hào)筆在6孔板背后用直尺比著，均勻劃橫線。在孔中加入約5×105個(gè)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)。第二天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，用預(yù)熱的PBS清洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，然后分別加入無血清培養(yǎng)基作為對(duì)照組和條件培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組，放入培養(yǎng)箱缺氧狀態(tài)(5%CO2，3% O2，92% N2)分別培養(yǎng)24 h和30 h，拍照記錄。

1.2.4 Western-blot及 RT-PCR Western-blot檢測(cè)采用常規(guī)方法，收集細(xì)胞，用RIPA裂解細(xì)胞提取總蛋白質(zhì)，確定點(diǎn)樣量，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。分別與MMP2、MMP9、GAPDH蛋白抗體及二抗反應(yīng)后化學(xué)發(fā)光顯色，陽性條帶以凝膠吸光度分析軟件測(cè)定積分吸光度值為其蛋白量。RT-PCR按常規(guī)方法提取RNA再逆轉(zhuǎn)錄。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)和方差分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EF刺激HUVEC的條件培養(yǎng)基促進(jìn)缺氧培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移功能 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均在缺氧條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)24小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞向劃痕處遷移生長的細(xì)胞數(shù)目明顯多于對(duì)照組，30小時(shí)后幾乎布滿劃痕位置，遷移速度是單純?nèi)毖鯒l件遷移速度的1.56倍。見圖1。

圖1 EF刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清促進(jìn)缺氧滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移(Bar=100 μm)

2.2 EF刺激HUVEC的條件培養(yǎng)基促進(jìn)缺氧培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲功能 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EF(200mV/mm)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞5 h條件培養(yǎng)基與滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)，可以促進(jìn)缺氧培養(yǎng)條件滋養(yǎng)細(xì)胞的穿膜(侵襲)功能(穿膜細(xì)胞數(shù)是單純?nèi)毖鯒l件穿膜細(xì)胞數(shù)的3.62倍)，而單純?nèi)毖鯒l件滋養(yǎng)細(xì)胞的穿膜數(shù)目較正常氧環(huán)境培養(yǎng)細(xì)胞顯著降低，見圖2。

圖2 EF刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力(Transwell實(shí)驗(yàn)，Bar=100 μm)

2.3 微電場(chǎng)刺激HUVEC的條件培養(yǎng)基對(duì)缺氧培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移/侵襲相關(guān)分子MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，上述EF刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基與滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，可以促進(jìn)缺氧培養(yǎng)條件(3% O2)滋養(yǎng)細(xì)胞的MMP-2的表達(dá)，而單純?nèi)毖跖囵B(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞MMP-2表達(dá)較正常氧環(huán)境培養(yǎng)細(xì)胞的表達(dá)顯著降低，但對(duì)MMP-9分子表達(dá)的影響不明顯。熒光定量PCR法對(duì)mRNA水平的分析結(jié)果與上述蛋白水平的結(jié)果一致，見圖3、圖4。

圖3 EF刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞MMP-2的表達(dá)

圖4 EF刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)MMP-9表達(dá)的影響

3 討論

孕早期EF適度地侵入子宮內(nèi)膜，在母胎循環(huán)的建立及成功妊娠方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。EVT侵入不足可能導(dǎo)致流產(chǎn)、子癇前期和胎兒宮內(nèi)生長受限等產(chǎn)科不良結(jié)局。在生理狀態(tài)下，妊娠早期(前三個(gè)月)胎盤和胚胎均處于低O2分壓的環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)在孕11周之前胎盤氧分壓低于蛻膜氧分壓[4，5]。大約孕12周胎盤氧分壓才與蛻膜氧分壓相同[4，5]，胎盤氧分壓與孕周之間存在正相關(guān)關(guān)系。因此，缺氧可能在正常和病理性妊娠過程中胎盤形成及其功能調(diào)節(jié)方面起重要作用。

缺氧環(huán)境對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲/遷移的影響存在廣泛的爭(zhēng)論。一些研究結(jié)果顯示，缺氧對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能產(chǎn)生促進(jìn)作用，例如，Lash 等研究發(fā)現(xiàn)，與20%氧環(huán)境結(jié)果比較，缺氧(1%O2)培養(yǎng)的HTR-8/SVneo 24 h，促進(jìn)細(xì)胞的侵襲能力[6]，而Kilburn等的研究發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/ SVneo在缺氧(2% O2)培養(yǎng)72 h，其侵襲能力降低[7]；另一項(xiàng)類似研究顯示，JEG-3和HTR-8/SVneo在缺氧(2% O2)培養(yǎng)24 h，其侵襲活性增強(qiáng)，但培養(yǎng)72 h其侵襲能力降低。本研究發(fā)現(xiàn)，3% O2環(huán)境中滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo培養(yǎng)90 h其侵襲能力受到抑制，與Kilburn等[7]的結(jié)果一致。關(guān)于這些研究結(jié)果不一致的原因，可能與細(xì)胞種類、培養(yǎng)方法如缺氧時(shí)間及程度的不同等有關(guān)。

滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)行為受局部環(huán)境眾多因素的影響，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞等因素的作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)EF可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌血管生成活性因子VEGF和IL-8[3]，這些因子是促進(jìn)細(xì)胞遷移的重要活性分子。我們推測(cè)，這些活性分子對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞功能、特別是缺氧環(huán)境中滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲/遷移功能可能具有影響。本研究結(jié)果顯示，EF刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞5 h的條件培養(yǎng)基與缺氧環(huán)境滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)90 h，可明顯促進(jìn)其穿膜的能力：與對(duì)照培養(yǎng)細(xì)胞相比，穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)是單純?nèi)毖跖囵B(yǎng)的3.62倍，遷移速度是單純?nèi)毖跖囵B(yǎng)的1.56倍，提示血管內(nèi)皮細(xì)胞來源的旁分泌因子可能對(duì)缺氧滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲功能起促進(jìn)作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，3% O2的缺氧環(huán)境培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞MMP-2的表達(dá)降低，與Onogi等[1]的研究結(jié)果一致，但對(duì)MMP-9的表達(dá)影響不明顯，與張雅琪等[8～10]的報(bào)道不一致，可能與缺氧條件、缺氧時(shí)間及滋養(yǎng)細(xì)胞種類不同有關(guān)。本研究顯示，EF刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)基促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲功能可能與其上調(diào)MMP-2的表達(dá)有關(guān)。

上述結(jié)果提示，EF刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清能促進(jìn)缺氧滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移/侵襲能力，可能與內(nèi)皮細(xì)胞分泌的相關(guān)活性分子如VEGF和 IL-8等作用于滋養(yǎng)細(xì)胞、促進(jìn)MMP-2分子表達(dá)增加有關(guān)。

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國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：30872774/H0418)；四川省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：140071)

R446.11

A

1672-6170(2015)05-0069-04

2015-04-30；

2015-06-20)