蛋白質瓜氨酸化及其在類風濕關節(jié)炎中的意義

鐘 兵，方勇飛

(第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院中西醫(yī)結合科·風濕病專科，重慶 400038)

蛋白質瓜氨酸化及其在類風濕關節(jié)炎中的意義

鐘 兵，方勇飛

(第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院中西醫(yī)結合科·風濕病?？疲貞c 400038)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)的發(fā)病機制至今尚未闡明。RA患者體內發(fā)現(xiàn)越來越多的抗瓜氨酸化蛋白抗體(ACPA)提示瓜氨酸化可能參與其發(fā)病過程。本文從蛋白質的瓜氨酸化過程、生理功能，ACPA在RA的診斷、預后及發(fā)病機制中的作用進行綜述，試圖更全面地了解蛋白質的瓜氨酸化在RA發(fā)病各環(huán)節(jié)中的作用。

瓜氨酸化；抗瓜氨酸化蛋白抗體；類風濕關節(jié)炎；發(fā)病機制

瓜氨酸化(citrullination)是指肽?；蛴坞x的精氨酸在酶的催化下脫掉一個亞胺基，而轉化為瓜氨酸的過程。近年來，隨著對抗瓜氨酸化的蛋白抗體(anti-citrullinated protein antibody，ACPA)在類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)的診斷及預后等方面的重要意義有越來越清楚的認識，瓜氨酸化現(xiàn)象得到廣泛地關注和研究。目前我們已逐漸認識到，瓜氨酸化是RA的一種普遍現(xiàn)象，并可在其它幾種自身免疫性疾病中出現(xiàn)，瓜氨酸化可能參與RA等自身免疫性疾病的發(fā)病過程[1]。

1 生理情況下的瓜氨酸化

通常情況下，瓜氨酸化是一種正常的生理過程，參與細胞凋亡、終末期分化、基因調控、生殖發(fā)育等多種生理功能。

1.1 瓜氨酸化過程 瓜氨酸化是一種酶促反應，參與瓜氨酸化的酶有許多種，根據(jù)其底物的不同，可以分為三類：一類是只能催化游離的精氨酸轉化為瓜氨酸的酶。目前已證實的有兩種，一種是真核生物體內的一氧化氮合成酶[2]，另一種是細菌中的精氨酸脫亞胺基酶(arginine deiminase)[3]，兩者均不需Ca2+的參與。另一類是只能催化肽酰精氨酸的酶。主要是存在于脊椎動物體內的肽酰精氨酸脫亞胺基酶(peptidylarginine deiminase，PAD)，此酶的催化過程需Ca2+的參與[4]。還有一類是目前僅在牙齦卟啉單胞菌中發(fā)現(xiàn)的一種酶PPAD(PAD of Porphyromonas gingivalis)，可以在不依賴Ca2+的情況下催化肽酰精氨酸或游離精氨酸轉化為瓜氨酸[5]。這種酶與脊椎動物體內的PAD沒有進化上的相關性，其氨基酸序列與細菌中發(fā)現(xiàn)的精氨酸脫亞胺基酶具有一定的同源性[6]，目前在真核生物體內尚未發(fā)現(xiàn)此類酶的存在。瓜氨酸不是蛋白質合成的編碼氨基酸，游離精氨酸瓜氨酸化的意義目前尚不清楚，我們通常所謂的瓜氨酸化是指肽酰精氨酸的瓜氨酸化。

Arita等描述了肽酰精氨酸的瓜氨酸化過程[7]。首先，在Ca2+存在的情況下，PAD的半胱氨酸殘基結合到精氨酸的胍基上，形成一種四面內旋體的過渡狀態(tài)，同時釋放一個氨。然后利用水分子的親核性使內旋體分解，重新恢復半胱氨酸殘基并形成一個酮基。由此，精氨酸就在酶的作用下轉化為瓜氨酸了。

1.2 PAD的表達及功能 目前已在人體內發(fā)現(xiàn)5種PAD，分別為PAD1～4和PAD6。人PAD基因位于染色體1p36.1區(qū)域，全長共334.7 kb。5種PAD在序列上具有廣泛的同源性，不同之處在于其組織分布的不同[4]。

PAD1表達于表皮和子宮，主要作用是催化前絲集蛋白(pro-filaggrin)的瓜氨酸化，促進其成熟，參與角質形成細胞的終末期分化[8，9]。PAD2表達于骨骼肌、大腦、脾、分泌腺等組織和器官，是人體內表達最為廣泛的PAD[8]。已知PAD2的底物主要有兩種，一是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內的髓磷脂堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)，一是神經(jīng)膠質酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)。前者的瓜氨酸化可能參與多發(fā)性硬化的發(fā)病過程[10]，而后者可能與老年性癡呆相關[11]。PAD3表達于表皮和毛囊，其底物為毛透明蛋白(Trichohyalin)，后者是毛囊內根梢的主要結構蛋白[8]。與絲集蛋白一樣，毛透明蛋白介導角蛋白絲的聚集，其瓜氨酸化后會打開α螺旋結構，使其在毛囊轉谷氨酰胺酶的催化下可以更有效地與角蛋白絲形成交聯(lián)[12]。PAD4主要表達于人白細胞，也可在大腦、巨噬細胞、胸腺、關節(jié)等組織或細胞中檢測到，是唯一的表達于細胞核內的PAD[4]。PAD4主要催化組蛋白[13]，后者的瓜氨酸化不但破壞其蛋白結構，而且使其丟失大量正電荷，從而使核小體解聚，DNA容易降解和斷裂，最終導致細胞凋亡。PAD6最初是通過序列比對的方式發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)已被克隆，主要表達在卵母細胞和胚胎早期[14]，其功能可能與胚胎早期發(fā)育有關，目前尚無相關研究結果。

1.3 瓜氨酸化的調節(jié) PAD介導的瓜氨酸化受Ca2+濃度、氨基酸序列等多種因素調節(jié)。Ca2+濃度是最關鍵性的調節(jié)因素之一，不同的PAD需要不同的Ca2+濃度[15]。體外實驗顯示，瓜氨酸化僅在高濃度Ca2+存在的情況下才能進行[16]。生理情況下Ca2+濃度為10-8～10-6M，因此生理情況下所有的PAD均是失活的，這意味著體內的瓜氨酸化只有在特定的情況下才可能發(fā)生，如細胞凋亡或表皮細胞終末期分化等所導致的細胞內Ca2+濃度升高。蛋白質的一級結構也可影響瓜氨酸化的效率[17]，如N-Arg-Glu-C序列的瓜氨酸化較慢，而N-Arg-Asp-C序列則較快，靠近N端的精氨酸較少被瓜氨酸化，N-Pro-Arg-Pro-C序列則不會發(fā)生瓜氨酸化。蛋白質的二級結構也同樣如此，α螺旋難以被瓜氨酸化，而β折疊則最易被瓜氨酸化[18]。此外，最近的一些研究提示瓜氨酸化可能參與基因調控等細胞進程，這提示瓜氨酸化還受到除Ca2+以外的因素調節(jié)，從而使其能在生理性Ca2+濃度下發(fā)揮活性作用[19]。

1.4 瓜氨酸化對蛋白質的影響 瓜氨酸化可以改變蛋白質的各級結構。體外研究表明，高度的瓜氨酸化可使蛋白質變性，如毛透明蛋白或絲集蛋白中5%的精氨酸殘基改變可影響其三級結構，超過10%的精氨酸殘基瓜氨酸化則可完全破壞蛋白質結構而使其變性[18]。這可能是因為精氨酸是一種強堿性氨基酸，而瓜氨酸則是一種中性氨基酸，精氨酸被轉化為瓜氨酸雖然僅減少了約1 Da的重量，但從蛋白質水平來說，正電荷的丟失則可影響蛋白質的整體電荷、電荷分布、等電點以及氫鍵、離子鍵的形成能力，進而影響蛋白質的結構、功能以及蛋白質間的相互作用[18]。

1.5 瓜氨酸化的生理功能 蛋白質的瓜氨酸化具有多種生理功能：①參與細胞的凋亡過程，可能與凋亡時的細胞形態(tài)學改變和DNA斷裂有關。當細胞發(fā)生凋亡時，細胞內Ca2+濃度異常升高，激活PAD。后者可使波形蛋白頭區(qū)(head domain of vimentin)發(fā)生高度瓜氨酸化，導致中間絲網(wǎng)狀結構喪失，細胞形態(tài)學改變[20]。高濃度的Ca2+可更大程度地激活細胞核內的PAD4，后者廣泛地催化組蛋白瓜氨酸化，使核小體解聚，DNA容易發(fā)生斷裂[13]。②促進細胞終末期分化。表皮細胞死亡前向皮膚表面趨化，在這一過程中，細胞內Ca2+濃度的不斷升高逐漸激活PAD1、2或3，作用于角蛋白K1、K10和絲集蛋白等細胞骨架蛋白，這些蛋白質的瓜氨酸化是表皮細胞終末期分化所必須的過程[21]。這一過程也同樣見于毛根內鞘細胞中的毛透明蛋白[12]。③調控基因的表達。瓜氨酸化可抑制由17β-雌二醇激活的基因表達。17β-雌二醇可激活具有甲基轉移酶功能的輔助激活因子CRAM1(coactivator associated arginine methyl transferase 1)和PRMT1(protein arginine methyl transferase 1)的活性，二者可將S-腺苷甲硫氨酸上的甲基轉移到特定組蛋白的精氨酸殘基上(H3：Arg17；H4：Arg3)，這些組蛋白定位于特定基因的啟動子區(qū)，其甲基化可促進基因的表達，PAD4可通過瓜氨酸化阻斷上述過程。研究表明，用17β-雌二醇處理MCF-7細胞后20 min內即可發(fā)現(xiàn)甲基化精氨酸明顯升高，目的基因誘導表達。40～60 min后局部PAD4可升高兩倍，同時伴隨甲基化精氨酸的減少，目的基因表達受抑制[18]。④促進卵母細胞和胚胎早期的發(fā)育。PAD6可在生殖細胞中表達，動物體內實驗顯示，PAD6基因失活可導致卵母細胞的細胞骨架分散，雌鼠不孕，而對雄鼠的生育功能沒有影響[22]。此外，可在胚胎早期檢測到PAD6的表達，提示其功能可能與胚胎早期發(fā)育有關[14]。

2 蛋白質的瓜氨酸化與RA

瓜氨酸化蛋白在RA的診斷、預后等方面具有重要意義，新近的研究結果還支持其與RA發(fā)病機制的相關性。

2.1 RA中的瓜氨酸化蛋白質的發(fā)現(xiàn) 1964年，Nienhuis等報道了一種抗核周因子(antiperinuclear factor，APF)抗體，在不同種族的RA患者中均具有高度的特異性[23]。1979年，Young等發(fā)現(xiàn)了另一種RA相關的抗角蛋白抗體(anti-keratin antibody，AKA)[24]。這兩種抗體一直被認為是不同的，直到1995年Sebbag等才證實APF 和AKA 的靶抗原均為人類表皮細胞內的絲集蛋白[25]。1998年，Schellekens 等發(fā)現(xiàn)瓜氨酸是絲集蛋白抗原決定族的關鍵成分[26]，從而第一次揭示了瓜氨酸化在RA中的意義。有意思的是，關節(jié)內雖然不表達絲集蛋白，但有證據(jù)顯示關節(jié)滑液中可測出AKA，且滴度較血清中高，提示AKA在關節(jié)局部分泌[27]。近年來，人們致力于尋找關節(jié)內的瓜氨酸化抗原，并相繼發(fā)現(xiàn)了多種RA特異性瓜氨酸化蛋白及其相關抗體。2001年Masson-Bessiere等證實，瓜氨酸化的纖維蛋白α和β鏈是RA相關的抗絲集蛋白抗體(AFA)主要的關節(jié)內靶點[28]。1994年發(fā)現(xiàn)的RA特異性抗Sa抗體，已被證實其靶抗原是瓜氨酸化的波形蛋白[29]。Ⅱ型膠原是關節(jié)軟骨的主要成分，研究表明Ⅱ型膠原的瓜氨酸化在其打破自身耐受性，成為RA的自身抗原中起重要作用[30]。此外，可能的瓜氨酸化蛋白還包括纖維連接蛋白、α-烯醇化酶、EB病毒核抗原1(EBNA1)和核蛋白[31]。

2.2 ACPA在RA診斷中的意義 APF和AKA是最早發(fā)現(xiàn)的RA特異性ACPA，對RA的敏感性分別為49%～94%和36%～59%，特異性為73%～99%和88%～99%[32]。但由于其敏感性較低及檢測方法的限制，并未得到廣泛的應用和足夠的重視。直到2000年，Schellekens 等建立了用人工合成的環(huán)瓜氨酸肽(cycled-citrullinated peptide，CCP)檢測RA患者anti-CCP的方法后[33]，ACPA在RA診斷中的意義才得到普遍地認可。anti-CCP目前已發(fā)展到第三代，對RA的敏感性為75.6%～79.1%，特異性93%～96%，其敏感性較第一代anti-CCP有明顯提高，與第二代相當[34，35]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)RA患者在臨床癥狀出現(xiàn)前即可檢測到anti-CCP，且anti-CCP陽性對于未分化關節(jié)炎發(fā)展為RA有預示作用，提示anti-CCP可能成為RA早期診斷的標志之一[36，37]?？筍a抗體的靶抗原為瓜氨酸化的波形蛋白，在RA中敏感性為27%～40%，特異性超過95%[38]。另有研究顯示，以瓜氨酸化的波形蛋白為底物檢測的抗瓜氨酸化波形蛋白(MCV)抗體較抗Sa抗體有更高的敏感性，而特異性不變[39]。Nielen等研究發(fā)現(xiàn)，抗瓜氨酸化纖維蛋白原抗體(ACF)在RA中的敏感性為55.8%，特異性為92.6%，與anti-CCP相近，并與RA的影像學進展相關[40]。Burkhardt等用瓜氨酸化的Ⅱ型膠原檢測RA患者抗瓜氨酸化Ⅱ型膠原抗體陽性率為40.4%[30]。國內進一步研究顯示其敏感性為50.3%，特異性90%[41]。Suzuki等檢測RA患者抗瓜氨酸化Ⅰ型膠原抗體陽性率與anti-CCP相關，特異性高達99%[42]。

2.3 ACPA對RA預后的意義 ACPA不僅對RA 的診斷具有很高的特異性，并且該類抗體的滴度也與病情嚴重程度、骨侵蝕的危險性等預后因素相關。anti-CCP陽性者發(fā)生骨侵蝕的危險性增加，應用TNF-α拮抗劑治療后RA 病情改善的同時anti-CCP滴度降低[43]，這些結果均提示anti-CCP與RA的病情進展有關。目前，APF、AKA、抗Sa抗體、ACF等ACPA均已證實與RA的預后相關[38，40，44，45]。另一項研究結果顯示，抗MCV抗體比anti-CCP能更好的預示RA的放射學改變[39]。

2.4 蛋白質的瓜氨酸化在RA發(fā)病中的作用 ACPA在RA患者中具有高度特異性，可在RA發(fā)病之前數(shù)年出現(xiàn)，且不斷有新的ACPA被發(fā)現(xiàn)使ACPA在RA中具有更高的敏感性，這些結果均提示瓜氨酸化蛋白參與了RA 的發(fā)病過程。RA主要累及關節(jié)滑膜。研究發(fā)現(xiàn)，RA患者滑液中anti-CCP是血清中的7.5倍[46]，進一步提示瓜氨酸化蛋白參與了RA的主要病理過程。我們檢索了近年有關蛋白質瓜氨酸化與RA的研究文獻發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的與RA發(fā)病相關的因素均可與蛋白質瓜氨酸化發(fā)生聯(lián)系，并圍繞蛋白質的瓜氨酸化、瓜氨酸化蛋白的識別、ACPA的產(chǎn)生發(fā)揮作用(見圖1)。

圖1 多因素介導瓜氨酸化蛋白參與RA發(fā)病的機制假設

病毒感染、創(chuàng)傷、炎癥等均可誘導正常細胞發(fā)生凋亡。細胞凋亡伴隨多種自身蛋白的修飾，如泛素化、磷酸化、轉谷氨酰胺、瓜氨酸化等，是自身抗原的主要來源方式[47]。細胞凋亡時，細胞內Ca2+濃度升高使PAD激活，催化關節(jié)來源的蛋白發(fā)生瓜氨酸化，可能是RA發(fā)病的始動因素之一。凡是可以影響蛋白瓜氨酸化過程的因素，均可能影響RA的發(fā)病。如PAD4基因多態(tài)性可影響PAD4基因的表達水平，進而調節(jié)蛋白的瓜氨酸化，這可能解釋PAD4基因與RA易感的相關性[48]。最近的研究顯示，雌激素可通過雌激素受體激活的AP-1、Sp1和NF-Y等轉錄因子增強PAD4基因的表達[49]，這可能部分解釋女性易患RA的原因。病毒感染還可能通過其它方式誘發(fā)RA。Pratesi等的研究顯示抗瓜氨酸化的EB病毒核抗原-1多肽(CEBNA-1)抗體在RA中的陽性率為50%[50]，提示EB病毒感染可能通過誘導疾病特異性抗體參與RA 的發(fā)病。牙齦卟啉單胞菌是一種非酵解糖的革蘭氏陰性厭氧球桿菌，是牙周炎的主要致病菌，目前已有研究顯示牙周炎與RA相關。該細菌產(chǎn)生的PPAD酶可催化自身及多種蛋白質如波形蛋白、纖維蛋白原、α烯醇酶等發(fā)生瓜氨酸化，后者均是RA的特異性自身抗原。進一步研究還發(fā)現(xiàn)在RA患者體內可檢測到抗瓜氨酸化的PPAD的抗體[51]。這些研究提示齦紫單胞菌通過PPAD催化蛋白質的瓜氨酸化，從而參與RA的發(fā)病過程。

有研究在其他炎癥性關節(jié)炎如骨關節(jié)炎等的滑膜中也發(fā)現(xiàn)有瓜氨酸化蛋白的存在[52]，卻沒有anti-CCP的產(chǎn)生，提示蛋白瓜氨酸化可能不是RA特異性的，但針對瓜氨酸化蛋白的免疫反應卻是RA所特有的。這些結果表明有其它因素參與自身反應性T細胞對瓜氨酸化蛋白的識別以及B細胞產(chǎn)生ACPA，而這一過程對RA可能更加重要。Hill等的研究發(fā)現(xiàn)瓜氨酸化多肽與共享表位HLA-DRB1*0401分子的親和力升高[53]，進一步的研究提示HLA-DRB1*0401與anti-CCP水平顯著相關[54]。Ling等發(fā)現(xiàn)共享表位可作為配體與樹突狀細胞(dendritic cell，DC)表面上的肌鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)結合，進而抑制CD11c+CD8+DC細胞色氨酸加氧酶(indoleamine 2，3 dioxygenase，IDO)的活性及增加CD11c+CD8-DC細胞IL-6的分泌，最終抑制Treg細胞分化及促進Th17細胞分化成熟[55]。并發(fā)現(xiàn)在RA患者滑膜組織存在大量的瓜氨酸化的CRT，而CRT的瓜氨酸化可提高與共享表位配體的親和力[56]。這些研究結果解釋了瓜氨酸化、共享表位與RA的關系。此外，吸煙與HLA-DR4陽性RA患者的anti-CCP水平相關，但與HLA-DR4陰性的RA患者不相關[57]，還有研究發(fā)現(xiàn)吸煙可升高肺內細胞外PAD2酶的水平，從而促進蛋白質的細胞外瓜氨酸化[58]，提示吸煙可能通過促進蛋白質的瓜氨酸化及HLA-DR4呈遞瓜氨酸化多肽的過程兩個方面，影響RA的發(fā)病。動物實驗表明，B細胞凋亡調節(jié)缺陷是其產(chǎn)生ACPA的關鍵性因素[59]，這提示一些細胞因子如SDF-1、BAFF、APRIL、IL-6等，可能通過抑制B細胞凋亡而參與ACPA的調節(jié)，從而在RA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮相應的作用[60]。

對于瓜氨酸化如何導致RA，目前已有部分動物實驗結果。2005年，Lundberg等用瓜氨酸化的Ⅱ型膠原免疫大鼠，結果顯示膠原性關節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)的發(fā)生率和關節(jié)炎評分均高于天然的Ⅱ型膠原，且關節(jié)中的瓜氨酸化蛋白和PAD4的表達量與關節(jié)的炎癥程度呈正相關，而在正常大鼠的關節(jié)中則檢測不到瓜氨酸化蛋白和PAD4[61]。隨后Duplan等分別用自體的瓜氨酸化纖維蛋白原(C-rFBG)和天然的纖維蛋白原(NC-rFBG)免疫大鼠，結果C-rFBG可以使大鼠產(chǎn)生針對C-rFBG的抗體，但不能引起關節(jié)炎，而NC-rFBG不能引起大鼠的免疫反應[62]。盡管該結果沒有顯示C-rFBG與關節(jié)炎的相關性，但卻從側面證實了瓜氨酸化可打破自身抗原的免疫耐受。Kuhn等的研究證實，ACPA可增加CIA小鼠的組織損傷，預先用瓜氨酸肽進行免疫耐受可使病情顯著減輕[63]。但對ACPA如何參與RA的組織損傷過程目前尚不清楚，其可能的機制是ACPA與瓜氨酸化蛋白形成免疫復合物，進而激活炎癥細胞，產(chǎn)生炎癥因子，并進一步促進炎癥細胞浸潤，導致更多的瓜氨酸化蛋白的產(chǎn)生，形成惡性循環(huán)，RA纏綿不愈。該免疫復合物也可激活補體，導致組織損傷和炎癥反應。最新的一項研究結果顯示，補體受體CR2/CR1缺陷小鼠的CIA病情較輕，抗Ⅱ型膠原抗體和ACPA的水平較低[64]，支持補體在RA病理改變中的作用。瓜氨酸化還可能參與RA關節(jié)外病變，在類風濕結節(jié)和RA間質性肺炎的病理切片中均可發(fā)現(xiàn)瓜氨酸化蛋白的存在，陽性率分別為70%和44%[65]。值得注意的是，瓜氨酸化蛋白同樣存在于非RA的間質性肺炎中(40%)，該研究結果進一步突出了ACPA在RA中的作用。

3 展望

瓜氨酸化現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為RA的研究提供了新的思路。用瓜氨酸化蛋白免疫小鼠建立的新的動物模型，將可能替代目前常用的CIA、AA等模型，用于RA的發(fā)病機制、抗RA藥物的藥理作用等方面的研究。此外，抑制瓜氨酸化蛋白和ACPA的產(chǎn)生途徑，可能成為RA治療的新靶點。

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The role of citrullinated proteins in the pathogenesis of rheumatoid arthritis

ZHONG Bing，F(xiàn)ANG Yong-fei

(Department of Rheumatology and Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Southwest Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China)

FANGYong-fei

The mechanism of rheumatoid arthritis(RA)has not been clarified.More and more anti-citrullinated protein antibodies(ACPA)have been found in RA patients，suggesting that citrullinated proteins may be involved in the pathogenesis of RA.This paper reviews the process of protein citrullination，physiological function and the role of ACPA in the diagnosis，prognosis and pathogenesis of RA in order to get a more comprehensive understanding of the role of citrullinated proteins in the pathogenesis of RA.

Citrullination； Anti-citrullinated protein antibody； Rheumatoid arthritis； Pathogenesis

方勇飛，男，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導師。中華醫(yī)學會風濕病分會委員，中國中西醫(yī)結合學會風濕病分會副主任委員，中華中醫(yī)藥學會風濕病分會常務委員，重慶市醫(yī)學會風濕病專業(yè)委員會主任委員。主要研究方向：感染與免疫在類風濕關節(jié)炎發(fā)病機制中的作用。

R593.22

A

1672-6170(2015)05-0032-07

2015-07-15)