仔豬雷極氏普羅菲登斯菌的分離鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

秦毅斌，何 穎，盧冰霞，李 斌，李瑩瑩，2，梁家幸，陳忠偉，梁保忠，蘇乾蓮，周英寧，蔣冬福，黎珂鈺，2，盧敬專，趙 武＊

（1.廣西獸醫(yī)研究所／廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001；2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005）

普羅菲登斯菌（Providencia）屬于腸桿菌科普羅菲登斯菌屬，廣泛分布于土壤、水體、下水道等自然環(huán)境以及蒼蠅、貓、鳥、狗、牛、羊、企鵝、豚鼠等的體表或腸道［1］。普羅菲登斯菌是條件致病性人獸共患病病原菌，可以引起人和動(dòng)物尿路感染、傷口感染、眼結(jié)膜炎、腹瀉、肺炎等多種病癥［2-4］，此外還可以引起食物中毒［5］。普羅菲登斯菌屬包括9個(gè)種，分別是P.stuartii、P.rettgeri、P.alcalifaciens、P.rustigianii、P.heimbachae、P.vermicola、P.sneebia、P.burhodogranariea和P.thailandensis［1］。雷極氏普羅菲登斯菌最早在1904年由Rettger在發(fā)生類似于禽霍亂的雞群中分離到，但直到14年后才得以進(jìn)一步深入研究，并由Hadley命名為P.rettgeri［6］。在人類，P.rettgeri主要引起有尿道留置導(dǎo)管的住院病人的尿路感染、敗血癥甚至死亡［2-3，7］，潛在的兒童腹瀉［8］以及較為罕見的角膜炎、淚囊炎、結(jié)膜炎等眼部感染［4］。在動(dòng)物，Ladds P W 和Camus A C等［9-10］各自報(bào)道了P.rettgeri可以引起鱷魚的腦膜腦炎、肺炎、肝炎和敗血癥；陳永林等［11］從死亡的白鰭鯊魚腹腔膿液和心血中分離到P.rettgeri，并證實(shí)該菌可引起小鼠發(fā)病死亡。

普羅菲登斯菌的感染雖然不常見或者通常是醫(yī)院內(nèi)感染，但逐漸增多的新型病例已經(jīng)引起了學(xué)者注意。近來的研究表明，普羅菲登斯菌可以引起人的心包炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎以及犬的皮膚潰瘍［3］。值得注意的是，從人和動(dòng)物分離到普羅菲登斯菌顯示有不同程度的抗生素耐藥性。本研究首次從發(fā)生腹瀉的哺乳仔豬內(nèi)臟器官中分離到了雷極氏普羅菲登斯菌，致病性試驗(yàn)和動(dòng)物回歸試驗(yàn)證實(shí)該菌具有致病性，并可引起哺乳仔豬嚴(yán)重腹瀉，提示在仔豬腹瀉中應(yīng)注意該菌感染的診斷、監(jiān)測和防控。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源及試驗(yàn)用動(dòng)物 4頭腹瀉嚴(yán)重（部分拉血便）的5日齡哺乳仔豬為廣西某規(guī)模豬場送檢的病豬；25只6周齡的Balb／c小鼠購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；6頭5日齡健康仔豬來自本地生產(chǎn)狀況良好的豬場。

1.1.2 主要試劑 營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、TSA瓊脂和SS瓊脂培養(yǎng)基，北京路橋技術(shù)公司產(chǎn)品；革蘭染色液、藥敏紙片、微量生化反應(yīng)鑒定管，杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組、瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒提取試劑盒，北京天根生物有限公司產(chǎn)品；氨芐青霉素、2×TaqPCR Master Mix、DNA Marker DL 2 000、BamHⅠ、HindⅢ、pMD18-T載體，TaKaRa公司產(chǎn)品；大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，由廣西獸醫(yī)研究所／廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.1.3 16SrRNA引物 根據(jù)細(xì)菌16SrRNA通用擴(kuò)增引物合成擴(kuò)增引物，序列如下：上游引物P1：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′；下游引物P2：5′-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3′。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度約為1 500bp。

1.2 方法

1.2.1 流行病學(xué)調(diào)查 對(duì)豬場發(fā)病情況進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，了解發(fā)病群的日齡、臨床癥狀、發(fā)病率和死亡率、病理變化及藥物治療情況。

1.2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)及純化 無菌采集送檢病死仔豬腎臟、肝臟、肺臟、腸系膜淋巴結(jié)及腸道內(nèi)容物，接種營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)16h～18h。取培養(yǎng)液涂片，染色鏡檢，同時(shí)劃線接種血液瓊脂和TSA瓊脂，培養(yǎng)18h～24h，觀察菌落形態(tài)特征。挑取典型菌落，接種營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、TSA瓊脂和SS瓊脂，純化培養(yǎng)，并進(jìn)行培養(yǎng)特性鑒定。取純培養(yǎng)物涂片，革蘭染色，觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.3 生化試驗(yàn) 將分離純化細(xì)菌接種到TSB培養(yǎng)18h～20h，取菌液接種到微量生化管進(jìn)行葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、衛(wèi)茅醇、肌醇、枸櫞酸鹽、硫化氫、吲哚、尿素、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、苯丙氨酸脫氨酶生化試驗(yàn)。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 取分離純化的細(xì)菌接種于TSB肉湯培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)18h～20h，用TSB肉湯培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度至109CFU／mL，將菌液均勻涂布于TSA平板，稍干后取藥敏紙片分別平鋪在培養(yǎng)基表面，置37℃培養(yǎng)18h～20h，測量抑菌圈直徑，依據(jù)抑菌圈大小判定標(biāo)準(zhǔn)判定細(xì)菌的藥物敏感性。

1.2.5 16SrRNA基因序列測定及分析 按照細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書提取分離菌DNA，并進(jìn)行16SrRNA基因擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μL，反應(yīng)條件：95℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃90s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。

PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)，鑒定為陽性的重組質(zhì)粒由上海生工生物生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。將分離菌株的16SrRNA基因序列通過NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析，使用軟件與從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的細(xì)菌的16SrRNA序列進(jìn)行多序列匹配排列，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.6 致病性試驗(yàn) 取4周齡健康小鼠25只，隨機(jī)分為5組，每組5只。試驗(yàn)組4組（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）小鼠分別腹腔接種5.0×1010、5.0×109、5.0×108、5.0×107CFU／mL不同濃度的菌液，接種量為0.2 mL／只；對(duì)照組（Ⅴ）腹腔注射等量滅菌肉湯培養(yǎng)液，隔離飼養(yǎng)。觀察記錄小鼠發(fā)病情況，剖檢發(fā)病死亡小鼠，并從內(nèi)臟器官中分離細(xì)菌。

1.2.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 取5日齡健康哺乳仔豬6只，試驗(yàn)組和對(duì)照組各3頭，分欄隔離飼養(yǎng)，人工奶粉喂養(yǎng)。試驗(yàn)組豬只腹腔接種濃度為5.0×109CFU／mL的菌液2mL，對(duì)照組豬只腹腔注射2mL滅菌肉湯培養(yǎng)液。觀察記錄發(fā)病情況，及時(shí)剖檢發(fā)病死亡豬只，記錄大體的病理變化，對(duì)肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、心臟及淋巴結(jié)等內(nèi)臟器官進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，并對(duì)分離細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病情況調(diào)查

2013年12月中下旬，某規(guī)模化豬場出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉、部分仔豬拉新鮮血樣便的病例，其中一棟產(chǎn)房有5窩（共54只）3日齡～7日齡哺乳仔豬發(fā)生腹瀉、血痢后很快脫水死亡，病死率高達(dá)75%以上。發(fā)病仔豬在出生時(shí)狀況良好，第3天開始出現(xiàn)拉稀、水樣或血樣腹瀉、消瘦脫水的癥狀，一般在發(fā)病后24h到3d內(nèi)死亡，而母豬并無異常表現(xiàn)。通過觀察發(fā)病豬只的臨床癥狀和剖檢變化，顯示其病變特征基本一致。病理剖檢顯示腎臟表面有大量點(diǎn)狀出血，腸道、腸系膜淋巴結(jié)腫大出血，腸內(nèi)有鮮紅色液體。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

采集發(fā)病豬的內(nèi)臟器官進(jìn)行了病毒檢測和細(xì)菌分離。病毒檢測結(jié)果均為陰性，排除了幾種導(dǎo)致腹瀉的病毒感染的可能性。而從所有送檢發(fā)病豬腎臟、肝臟、脾臟、肺臟、腸系膜淋巴結(jié)均分離到一種革蘭陰性桿菌。挑取典型的菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)觀察，分離菌株在TSA平板上培養(yǎng)18h～20h可見直徑約1mm～2mm的黏液狀菌落，呈灰白色、圓形、隆起、表明光滑、邊緣整齊、不透明、濕潤、黏稠，以鉑金環(huán)挑取易拉成絲；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌落邊緣有遷徙生長現(xiàn)象；分離菌株為兼性厭氧菌，在普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂、牛血清瓊脂平板、鮮血瓊脂上生長良好；普通肉湯呈均勻渾濁；鮮血瓊脂上未出現(xiàn)溶血圈。

2.3 染色鏡檢結(jié)果

分離菌染色鏡檢為革蘭陰性、兩極著色的桿菌，多單個(gè)存在，少數(shù)成對(duì)或個(gè)別短鏈排列，有鞭毛。

2.4 分離菌株生化特征鑒定

分離菌株發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；可發(fā)酵甘露醇、肌醇，不發(fā)酵乳糖、麥芽糖、蔗糖和衛(wèi)茅醇；尿素酶為陽性；賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、苯丙氨酸脫氨酶、枸櫞酸鹽、吲哚、H2S試驗(yàn)均為陰性（表1）。

表1 分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Biochemical characteristics of isolated strain

2.5 分離菌株藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，在測定的29種藥物中，分離菌株對(duì)頭孢哌酮鈉、頭孢噻肟鈉、頭孢曲松鈉、頭孢唑啉、頭孢呋肟、頭孢吡肟、阿莫西林、鏈霉素、氨曲南、洛美沙星、諾氟沙星、左氟沙星、恩諾沙星、大觀霉素、卡那霉素、氨芐青霉素、米諾環(huán)素、氯霉素和阿米卡星等19種藥物敏感，占試驗(yàn)藥物的65.5%；對(duì)四環(huán)素、青霉素中敏，占6.9%；對(duì)利福平、多黏菌素B、新生霉素、復(fù)方新諾明、亞胺培南、奧普托欣、克林霉素、萬古霉素其他8種藥物均耐藥，占27.6%（表2）。

2.6 16SrRNA基因的擴(kuò)增及酶切鑒定

以提取的分離菌株基因組為模板，P1、P2為引物進(jìn)行16SrRNA基因PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出一條約1 532bp的條帶。將PCR純化產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)入大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定，可見2條條帶，大小分別約為1 500bp和2 600bp，其中1 500bp的條帶即為16SrRNA基因片段（圖1）。

表2 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug sensitivity test of isolated strain

圖1 16SrRNA基因重組質(zhì)粒的PCR、酶切鑒定Fig.1 PCR and restriction enzyme analysis of the recombinant plasmid with 16SrRNA gene

2.7 16SrRNA的遺傳進(jìn)化分析

分離菌株16SrRNA基因測序結(jié)果在Gen-Bank中進(jìn)行Blast比對(duì)分析，結(jié)果表明與其同源性最高的序列為普羅威登斯屬各菌種的16SrRNA序列。將分離菌株與普羅威登斯屬各代表種26株的16SrRNA基因序列，用DNA Star軟件進(jìn)行同源性分析，利用MEGA4.0軟件的N-J法繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。同源性結(jié)果顯示，分離菌株與本屬26株代表菌的同源性在95.9%～99.6%之間；與雷極氏普羅威登斯菌代表菌的同源性在97.3%～99.6%之間，其中與雷極氏普羅威登斯菌DSM 4542株同源性最高，為99.6%。遺傳進(jìn)化分析顯示，分離菌株與雷極氏普羅威登斯菌關(guān)系最為密切，同處一個(gè)進(jìn)化分支。由此證明該菌為P.reggteri，并命名為Guangxi 2013株（圖2）。

圖2 Guangxi 2013分離菌16SrRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16SrRNA gene of Guangxi 2013isolate

2.8 致病性試驗(yàn)結(jié)果

致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌可引起小鼠發(fā)病，試驗(yàn)組小鼠在攻毒2h后出現(xiàn)精神沉郁、呼吸急促等癥狀。試驗(yàn)組Ⅰ（1.0×1010CFU）小鼠在攻毒后24h～36h全部死亡；試驗(yàn)組Ⅱ（1.0×109CFU）4只小鼠在攻毒后30h～48h內(nèi)死亡，1只存活；試驗(yàn)組Ⅲ（1.0×108CFU）、試驗(yàn)組Ⅳ（1.0×107CFU）所有小鼠均存活；對(duì)照組小鼠均健活（表3）。剖檢死亡小鼠，發(fā)現(xiàn)肝臟、腎臟腫大；腸道、腸系膜淋巴結(jié)出血。死亡小鼠的心、肝、脾、肺、腎等器官中均分離到細(xì)菌，革蘭染色鏡檢顯示，分離菌與接種菌是完全相同的細(xì)菌。

表3 致病性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Pathogenicity of strain Guangxi 2013in mice

2.9 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果

動(dòng)物回歸試驗(yàn)顯示，5日齡哺乳仔豬在接種1.0×1010CFU劑量的分離菌后出現(xiàn)了嚴(yán)重的臨床癥狀。所有試驗(yàn)組仔豬在接種分離菌6h后出現(xiàn)精神沉郁、食欲減退、腹瀉等癥狀，與臨床所見的癥狀基本一致又有所不同，即沒有看到拉血便的癥狀；所有試驗(yàn)組仔豬在接種后36h內(nèi)全部死亡，而對(duì)照組仔豬未見異常。剖檢死亡仔豬，大體病理變化為腎臟表面有出血點(diǎn)，腸系膜淋巴結(jié)腫大出血，腸道出血（圖3A）。死亡仔豬的心、肝、脾、肺、腎等器官中均分離到與攻毒細(xì)菌一樣的形態(tài)特征和生化特性的細(xì)菌。

圖3 Guangxi 2013分離菌攻毒仔豬腸道病變Fig.3 Gross lesions of intestines of the inoculated pigs

3 討論

普羅菲登斯菌屬細(xì)菌是一種運(yùn)動(dòng)型的、有菌體外周鞭毛的革蘭陰性桿菌。在目前發(fā)現(xiàn)的普羅菲登斯菌屬9個(gè)種當(dāng)中，大多數(shù)都被證實(shí)具有致病性。P.stuartii、P.rettgeri可導(dǎo)致有尿道留置導(dǎo)管的住院病人的尿路感染［2］；P.rettgeri還可引起人的眼部感染，潛在的兒童腹瀉及鱷魚的腦膜腦炎、肺炎、肝炎和敗血癥［4，8-10］。P.alcalifaciens、P.rustigianii和P.heimbachae均是人和動(dòng)物腸道的定植者，它們是公認(rèn)的引起胃腸炎的病原［2-3］。P.vermicola最初從線蟲中分離得到［12］，近來的研究顯示其可引起鯉魚的腹部皮膚潰瘍和腹鰭發(fā)紅等病變［1］。其余的普羅威登斯菌都是新近發(fā)現(xiàn)的，P.sneebia和P.burhodogranariea均是從野生果蠅的淋巴細(xì)胞中分離到的新物種，P.thailandensis是從海產(chǎn)品加工過程的廢水中分離鑒定的，目前還沒上述3種普羅菲登斯菌的致病性報(bào)道。

目前，有關(guān)普羅威登斯菌的檢測通常采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離、生化反應(yīng)進(jìn)行鑒定，但不同分離菌株的生化特征可能存在一定的差異。普羅威登斯菌屬各種細(xì)菌擁有共同的生化特性：發(fā)酵葡萄糖、甘露糖，不發(fā)酵乳糖、衛(wèi)茅醇、山梨醇；賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、硫化氫、V-P試驗(yàn)為陰性，苯丙氨酸脫氨酶、硝酸鹽還原陽性。而尿素酶陽性，赤藻糖、甘露醇、阿拉伯醇、核糖醇和纖維醇產(chǎn)酸陽性是P.rettgeri區(qū)分于同屬其他細(xì)菌的重要特征［6，13］。本研究中的分離菌株生化特性中除了苯丙氨酸脫氨酶陰性外，其余特性與上述的P.rettgeri生化特性相符，從生化特性上來看可以初步鑒定分離菌為P.rettgeri。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，16SrRNA基因擴(kuò)增和序列分析技術(shù)已成為細(xì)菌檢測和鑒定的一種強(qiáng)有力工具。通過對(duì)高度保守性和特異性的16 S rRNA進(jìn)行同源性比較分析，可以判定不同菌屬、菌種間遺傳關(guān)系的遠(yuǎn)近；通過基因序列的差異來鑒定種屬，還可以發(fā)現(xiàn)細(xì)菌新的種類［14］。因此，從基因的角度來研究細(xì)菌的分類更加精確。對(duì)16S rRNA基因的遺傳進(jìn)化分析顯示，本研究分離菌株與26株普羅威登斯菌代表菌株的同源性在95.9%～99.6%之間；與P.rettgeriDSM 4542等代表菌株關(guān)系最為密切，同源性在97.3%～99.6%之間，處于同一個(gè)進(jìn)化分支；從基因水平證實(shí)了該菌為P.reggteri。

小鼠致病性試驗(yàn)和動(dòng)物回歸試驗(yàn)均證實(shí)，該分離菌具有較強(qiáng)致病力；在試驗(yàn)組仔豬接種分離菌后6h出現(xiàn)精神沉郁、食欲減退、腹瀉等癥狀，但沒有見到臨床出現(xiàn)的拉血便的癥狀，這可能是在復(fù)雜的養(yǎng)豬生產(chǎn)實(shí)際中感染P.reggteri后可能會(huì)表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的癥狀。

對(duì)于細(xì)菌性感染病例最有效的治療途徑是對(duì)分離細(xì)菌進(jìn)行藥物敏感性測定后采用敏感藥物治療。在本試驗(yàn)測定的20多種常用藥物中，分離菌株對(duì)頭孢菌素類、喹諾酮類、氨基糖苷類及氨芐青霉素、阿莫西林、氨曲南、米諾環(huán)素、氯霉素等19種藥物敏感；有2種藥物中度敏感；有8種藥物不敏感，占測定藥物的27.6%，這表明分離菌株對(duì)部分藥物具有較高抗藥性。這與Stock I等［15］報(bào)道的普羅菲登斯菌藥敏結(jié)果較為一致。

由于抗菌藥物的廣泛及不合理的使用，普羅菲登斯菌的耐藥性已經(jīng)越來越普遍和嚴(yán)重，成為臨床關(guān)注的重點(diǎn)，通常造成對(duì)耐藥菌株感染病例的治療花費(fèi)增加及延誤治療。細(xì)菌產(chǎn)生的由質(zhì)?；蚪閷?dǎo)的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs）是導(dǎo)致其對(duì)廣譜β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性的重要機(jī)制，ESBLs能夠水解多數(shù)廣譜β-內(nèi)酰胺類抗生素，從而使其失去抗菌作用［16］。P.stuartii是普羅菲登斯菌屬細(xì)菌中耐藥性最為嚴(yán)重的菌種。意大利的調(diào)查顯示，約有36.7%的P.stuartii菌株產(chǎn)ESBLs，產(chǎn)ESBLs的P.stuartii菌株數(shù)占所有產(chǎn)ESBLs腸道細(xì)菌菌株總數(shù)的10%，對(duì)阿莫西林-克拉維酸、氨芐西林-舒巴坦等藥物耐藥較為嚴(yán)重［17］；而來自意大利某大學(xué)醫(yī)院的連續(xù)4年的監(jiān)測顯示，產(chǎn)ESBLs的P.stuartii菌株數(shù)占P.stuartii分離菌株的53%，且呈逐年上升的趨勢［18］。

本研究首次從發(fā)生腹瀉的哺乳仔豬內(nèi)臟器官中分離到了P.reggteri，將該分離菌接種哺乳仔豬后成功復(fù)制了哺乳仔豬腹瀉、死亡的病例。因此，對(duì)P.reggteri這一重要的條件致病性人獸共患病病原菌引起的感染應(yīng)該引起重視，并加強(qiáng)對(duì)其診斷、監(jiān)測和防控措施。

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