杠板歸提取物對(duì)黃粉蟲生物活性測(cè)定的初步研究

周妍等

摘 要：通過(guò)試驗(yàn)研究杠板歸不同層提取物對(duì)不同齡黃粉蟲的麻醉活性及體質(zhì)量變化的影響，結(jié)果表明，石油醚層萃取物對(duì)3、8齡黃粉蟲的麻醉活性最好，當(dāng)濃度為4 mg·mL-1時(shí)，處理3 min時(shí)校正麻醉率均為100%，LC50分別為0.008 3和0.058 9 mg·mL-1；同時(shí)，石油醚萃取物0.5 mg·mL-1對(duì)3齡黃粉蟲的平均體質(zhì)量增長(zhǎng)的抑制作用最明顯，體質(zhì)量平均增長(zhǎng)率在16 d內(nèi)比對(duì)照低了2.9%，且與對(duì)照達(dá)到極顯著水平。研究結(jié)果表明杠板歸對(duì)黃粉蟲的麻醉及其體質(zhì)量增長(zhǎng)抑制的活性成分為低極性的化合物。

關(guān)鍵詞：杠板歸提取物；黃粉蟲；麻醉活性；體質(zhì)量變化

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.06.022

Abstract： Biological activity of five extracts of P. perfoliatum was determined on anesthetic activity and weight changing of T. motlitorlin. The research results showed that the anesthetic activity of extracts of petroleum against 3rd and 8th instars larvae of T.motlitorlin possesses significant activity. When its concentration was 4 mg·mL-1， the corrected rate of anesthesia of 3rd and 8th instars larvae of T. motlitorlin in 3 min was 100%. P.E. extracts against 3rd and 8th instars larvae of T. motlitorlin exhibited anesthesia activity with LC50 values of 0.008 3 and 0.058 9 mg·mL-1， respectively. At the same time， for the inhibition of weight gaining of instars larvae of T. motlitorlin， the most obvious effect against 3rd instars larvae of T. motlitorlin was observed at 0.5 mg·mL-1 of P. E. extracts， and inhibition of insects average growth rate of weight was 2.9% lower than the control's in 16 days， and reached extremely significant level with the control. These results suggested that compounds of the anesthetic and inhibition of weight growth belonged to compounds of the lower polarity.

Key words： extracts of P. perfoliatum L.； T.motlitorlin （L.）； anesthetic activity； weight change

蓼屬（Polygonum）是蓼科植物中的藥用大屬，主要分布于北溫帶。我國(guó)約有120 種，其中近80 種供藥用，分布于全國(guó)各地，蓼屬大多具有清熱解毒、散結(jié)消腫、活血止痛、順氣解痙、收斂止瀉、通經(jīng)利尿等功效[1]。此外，該屬植物還具有殺蟲、昆蟲拒食、驅(qū)避以及抗菌等活性。杠板歸為蓼屬一年生攀援草本植物，又名貫葉蓼、蛇牙草等。目前已從杠板歸中分離得到的天然化合物有黃酮及苷類共13種、4個(gè)蒽醌類化合物、9個(gè)萜類化合物、12種酚羧酸類化合物、5個(gè)新苯丙素糖酯類化合物、3個(gè)酰胺類化合物等眾多類型的化合物[2-9]?；钚匝芯勘砻?，杠板歸具有抗炎、抗皰疹病毒、抗腫瘤、止咳、殺蟲等活性作用[10-13]。為更好地開發(fā)利用這一重要的傳統(tǒng)草藥資源，本試驗(yàn)以黃粉蟲為試蟲，以杠板歸不同層提取物的麻醉活性及其對(duì)生物體重變化的影響為篩選指標(biāo)，尋找杠板歸的有效部位或活性化合物。本研究旨在為系統(tǒng)研究杠板歸的活性成分及開發(fā)杠板歸的藥用價(jià)值提供活性依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 供試植物 杠板歸全草于2012年采自河北霧靈山，經(jīng)河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院徐興友博士鑒定為杠板歸（Polygonum perfoliatum L.）。將陰干的500 g杠板歸全草粉碎，過(guò)孔徑為0.187 5 mm的篩，備用。

1.1.2 供試?yán)ハx 黃粉蟲[Tenbrio motlitorlin （L.）]幼蟲由河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供。選取健康、大小一致、體質(zhì)量相近、發(fā)育正常的3、6、8齡幼蟲用于麻醉活性和體質(zhì)量變化情況的測(cè)定。

1.1.3 主要儀器 JA1203電子天平（上海精科天平制造廠）、HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋和HDM電子調(diào)溫電熱套（江蘇金壇榮華儀器制造有限公司）、KH-100B超聲波清洗器（江蘇昆山禾創(chuàng)超聲波儀器有限公司）、GG17旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司）、FZ-102高速粉碎機(jī)（河北省黃驊市齊家務(wù)科學(xué)儀器廠）和SHZ-D（Ⅱ） 循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 方 法

1.2.1 樣品的制備 用90%乙醇加熱回流提取3次，每次3 h；再用70%乙醇加熱回流提取2次，每次3 h；合并提取濾液，減壓濃縮成浸膏，即杠板歸粗提物（Crude）（204 g）。粗提物用水分散后分別依次用石油醚（PE）、乙酸乙酯（EtoAc）、正丁醇（BuOH）各萃取7次，萃取液分別減壓蒸餾，濃縮后依次得到PE層浸膏8.879 g，EtoAc層浸膏7.191 g，BuOH層浸膏11.016 g，取水層液置于蒸發(fā)皿中加熱濃縮至浸膏31.787 g，所得材料備用。

1.2.2 活性測(cè)定 （1）麻醉活性的測(cè)定。將杠板歸粗提物、PE、EtoAc、BuOH、水層萃取物用20%乙醇溶液分別配制成0.25，0.5，1，2，4 mg·mL-1系列濃度藥液。在培養(yǎng)皿中放置2層濾紙，噴水保濕，將靶標(biāo)物黃粉蟲在藥液中浸泡5 s，然后放入培養(yǎng)皿中觀察，每個(gè)濃度藥液3次重復(fù)，每重復(fù)10條黃粉蟲。對(duì)照組黃粉蟲用20%乙醇溶液處理，在各處理后的2 h內(nèi)密切檢查試蟲麻醉情況，于3，5，10，20，30，40，60，90 min檢查試蟲麻醉數(shù)，蟲體平直、完全癱軟、鑷子尖刺其尾部，試蟲無(wú)反應(yīng)者為麻醉。

（2）對(duì)黃粉蟲的體質(zhì)量的影響。將杠板歸粗提物、PE、EtoAc、BuOH、水層萃取物用20%乙醇溶液分別配制成0.25，0.5，1，2，4 mg·mL-1系列濃度藥液。每處理用電子天平稱取2 g黃粉蟲飼料放入培養(yǎng)皿中，然后向每個(gè)培養(yǎng)皿中加入3 mL上述藥液攪拌均勻后晾干，將體質(zhì)量大小一致的10條黃粉蟲幼蟲（記錄黃粉蟲原始體質(zhì)量）放在培養(yǎng)皿中喂食，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)10條黃粉蟲。對(duì)照組用20%乙醇溶液處理，每隔2 d稱量黃粉蟲體質(zhì)量，記錄其16 d內(nèi)的體質(zhì)量變化，并畫出體質(zhì)量變化趨勢(shì)線。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 利用STATA SE 12 軟件進(jìn)行麻醉活性的meta分析[計(jì)數(shù)資料用比值比（Odds ratio， OR）表示，用95%的可信區(qū)間（Confidence interval， CI） 表達(dá)]和DPS7.05版軟件對(duì)黃粉蟲的麻醉和體質(zhì)量變化情況做顯著性方差分析，根據(jù)供試濃度的對(duì)數(shù)值和校正麻醉率的幾率值，計(jì)算回歸方程和麻醉中濃度（LC50）。計(jì)算公式：

麻醉率=麻醉黃粉蟲數(shù)/供試黃粉蟲數(shù)×100%

校正麻醉率=（處理麻醉率-對(duì)照麻醉率）/（1-對(duì)照麻醉率） ×100%

體質(zhì)量增長(zhǎng)率=（當(dāng)前體質(zhì)量-上一體質(zhì)量）/上一體質(zhì)量×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 杠板歸提取物對(duì)不同齡黃粉蟲的麻醉活性

2.1.1 杠板歸粗提物對(duì)黃粉蟲麻醉最佳時(shí)間的測(cè)定 杠板歸粗提物對(duì)3、6、8齡黃粉蟲麻醉最佳時(shí)間的測(cè)定（圖1、2、3）結(jié)果表明，不同齡的黃粉蟲均以3 min為較好，且有劑量依賴效應(yīng)。

2.1.2 杠板歸不同層提取物麻醉活性的測(cè)定 由圖4、5、6可見，在所供試的5個(gè)不同層提取物中，PE萃取物的麻醉效果對(duì)3、6、8齡黃粉蟲的麻醉活性最好，其次為BuOH萃取物，這表明杠板歸中所含的麻醉活性物質(zhì)分布在極性較小的PE層和極性較大的BuOH層中。

2.1.3 對(duì)不同齡期黃粉蟲的麻醉試驗(yàn) 由圖7～11可知，試驗(yàn)中5個(gè)提取物的麻醉效果對(duì)3、6、8齡的黃粉蟲，以3齡最為敏感，這表明試驗(yàn)中應(yīng)注意選擇低齡幼蟲。

2.1.4 對(duì)時(shí)間、物質(zhì)、齡期、濃度的互作情況分析 由表1知，由于因素間可能存在的交互作用，當(dāng)單因素作用時(shí)，通過(guò)F值檢驗(yàn)，表明麻醉效果受濃度的影響最大；當(dāng)2因素交互作用時(shí)，濃度受物質(zhì)的效應(yīng)修飾最顯著，表明在兩因素交互作用中，選擇不同物質(zhì)處理也是影響試驗(yàn)效果的第2重要因素；當(dāng)3因素交互作用時(shí)，可見齡期因素的作用可以修飾濃度與物質(zhì)的交互作用；當(dāng)4因素同時(shí)交互作用時(shí)，可知濃度、物質(zhì)、齡期等3因素的交互作用被時(shí)間所修飾。結(jié)果表明，當(dāng)不同濃度的不同物質(zhì)麻醉不同齡期的黃粉蟲時(shí)，麻醉效果所受因素的影響由大到小的順序?yàn)闈舛?、物質(zhì)、齡期、時(shí)間。其中，濃度為最主要因素，所以針對(duì)濃度做差異顯著性檢驗(yàn)（表2）。

由表2可知，4，2，1，0.5，0.25 mg·mL-1等5個(gè)不同濃度藥液之間均達(dá)到極顯著性差異，其中4 mg·mL-1的麻醉效果最明顯，濃度在試驗(yàn)中起著決定性作用。

2.1.5 杠板歸提取物對(duì)3、8齡黃粉蟲的麻醉毒力分析 結(jié)果顯示，杠板歸提取物對(duì)3、8齡黃粉蟲的麻醉效果最明顯的均是PE萃取物，毒力回歸方程分別為y=6.558 1+0.748 5x，y=6.173 3+0.953 9x；LC50分別為0.008 3，0.058 9 mg·mL-1，較其它物質(zhì)的麻醉中濃度低（表3、4）；而BuOH萃取物對(duì)8齡黃粉蟲的的麻醉效果僅次于PE萃取物，其毒力回歸方程為y=5.328 6+0.953 9x，LC50為0.452 4 mg·mL-1，較其它物質(zhì)的麻醉中濃度低（表4），推測(cè)活性成分主要分布在極性偏小的PE層所在極性范圍內(nèi)，也可能有少量分布在極性偏大的BuOH層所在極性范圍內(nèi)。

2.2 杠板歸提取物對(duì)黃粉蟲體質(zhì)量的影響

通過(guò)對(duì)3、6、8齡黃粉蟲體質(zhì)量影響情況的顯著性方差分析，針對(duì)每一個(gè)齡期，不同層的提取物在5種不同濃度處理下研究黃粉蟲的平均體質(zhì)量與濃度的關(guān)系，于飼喂后不同天數(shù)稱量體質(zhì)量?，F(xiàn)以濃度為類，飼喂天數(shù)為組進(jìn)行方差分析，可以得到0.5 mg·mL-1和1 mg·mL-1的濃度是抑制黃粉蟲平均體質(zhì)量增長(zhǎng)的最顯著濃度。選取低濃度0.5 mg·mL-1為例，針對(duì)最敏感的3齡黃粉蟲進(jìn)行下一步分析。

由表5可知，對(duì)黃粉蟲平均體質(zhì)量增長(zhǎng)有明顯抑制作用的物質(zhì)是PE萃取物，其與對(duì)照達(dá)到了極顯著水平。推測(cè)抑制黃粉蟲體質(zhì)量增長(zhǎng)的活性成分在極性偏小的PE層所在極性范圍內(nèi)。所以，針對(duì)不同濃度的PE萃取物對(duì)3齡黃粉蟲的平均體質(zhì)量變化做差異顯著性檢驗(yàn)（表6）。

由圖12和表6可知，不同濃度的供試藥液對(duì)黃粉蟲體質(zhì)量的影響大體都呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)，但可以看出隨著時(shí)間的增加，低濃度抑制黃粉蟲體質(zhì)量的增長(zhǎng)。其中0.5 mg·mL-1對(duì)黃粉蟲體質(zhì)量增長(zhǎng)的抑制效果最顯著，且與對(duì)照達(dá)到了極顯著水平，體質(zhì)量平均增長(zhǎng)率為11.29%；而對(duì)照20%乙醇處理下的黃粉蟲體質(zhì)量平均增長(zhǎng)率為14.19%，2 mg·mL-1處理下的黃粉蟲體質(zhì)量平均增長(zhǎng)率最大，為15.81%，但與對(duì)照組沒有達(dá)到顯著水平。由此可知，低濃度抑制其體質(zhì)量增長(zhǎng)，高濃度反而促進(jìn)其體質(zhì)量增長(zhǎng)。

3 結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)，杠板歸提取物對(duì)供試?yán)ハx主要表現(xiàn)出麻醉和抑制體質(zhì)量增長(zhǎng)的活性。試驗(yàn)表明，麻醉活性物質(zhì)存在于不同層的提取物中，主要存在于PE層和BuOH層的萃取物中；3齡為最敏感齡期，實(shí)際應(yīng)用中注意選擇在最佳齡期時(shí)用藥。推測(cè)其抗藥性機(jī)理可能是由于代謝速率的差別和幼蟲處于不同的生理時(shí)期而引起的，也可能是對(duì)于不同齡期的黃粉蟲的活性成分可不一樣，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。PE萃取物對(duì)3齡黃粉蟲的平均體重增長(zhǎng)的抑制作用最明顯，EtoAc萃取物的抑制作用次之，低濃度處理下抑制體質(zhì)量增長(zhǎng)最顯著。生長(zhǎng)抑制作用對(duì)于大多數(shù)昆蟲來(lái)說(shuō)，雖然沒有達(dá)到直接控制害蟲數(shù)量的目的，但不良的生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)直接影響到后期幼蟲化蛹率和蛹的質(zhì)量及大小。在試驗(yàn)過(guò)程中，經(jīng)過(guò)杠板歸提取物處理后的黃粉幼蟲，伴隨著生長(zhǎng)緩慢，行動(dòng)遲緩，蛻皮延期，蟲體收縮變軟的現(xiàn)象也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。因此可對(duì)PE層、EtoAc層及BuOH層的萃取物進(jìn)一步分離、鑒定。

本試驗(yàn)推測(cè)的活性物質(zhì)分布在PE層和BuOH層中，根據(jù)極性大小，可以推測(cè)活性化合物種類可能是極性偏小的黃酮類化合物、萜類化合物和極性偏大的黃酮苷類、酚羧酸類化合物。目前已知衛(wèi)矛科殺蟲植物苦皮藤（Celastrus angulatus Max.）對(duì)10多種重要的農(nóng)林害蟲均有良好的防治效果，其中對(duì)菜青蟲（Pieris rapae）、粘蟲（Mythimna separate）、槐尺蠖 （Semiothisa cinerearia） 等主要表現(xiàn)為麻醉作用[14]，對(duì)蝗蟲（Locusta migratoria）、芫菁葉蜂（Athalia rosae）、小菜蛾（Plutella xylostella）有強(qiáng)烈的拒食作用[15]；已從苦皮藤中分離鑒定出了具有麻醉活性化合物苦皮藤素Ⅳ[15]和具有拒食活性的化合物苦皮藤素Ⅰ[16-17]。目前對(duì)杠板歸的研究主要集中在黃酮類及蒽醌類的化學(xué)成分及其藥理活性上，是否有其他化學(xué)成分及活性物質(zhì)尚不明確，還需在生物活性指導(dǎo)下進(jìn)行系統(tǒng)分離研究。以活性為指導(dǎo)對(duì)杠板歸的有效活性成分、結(jié)構(gòu)、構(gòu)效關(guān)系以及防治病蟲害的作用機(jī)制進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究，可為進(jìn)一步開發(fā)我國(guó)植物源農(nóng)藥提供理論基礎(chǔ)。

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