植物開(kāi)放式組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展及發(fā)展前景

摘要：從抑菌劑種類和濃度、蔗糖濃度、有機(jī)物質(zhì)、培養(yǎng)容器、接種條件及培養(yǎng)方式幾個(gè)方面綜述了植物開(kāi)放式組織培養(yǎng)的發(fā)展與應(yīng)用，并展望了未來(lái)發(fā)展的前景。

關(guān)鍵詞：開(kāi)放式組織培養(yǎng);植物;抑菌劑;培養(yǎng)容器;有機(jī)物質(zhì);接種條件;培養(yǎng)方式

中圖分類號(hào)： Q943.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0011-03

收稿日期：2014-05-17

基金項(xiàng)目：江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目（編號(hào)：13KJB180004）;江蘇開(kāi)放大學(xué)、江蘇城市職業(yè)學(xué)院“十二五”規(guī)劃項(xiàng)目（編號(hào)：12SEW-Y-026）。

作者簡(jiǎn)介：曾云英（1976—），女，重慶長(zhǎng)壽人，碩士，副教授，主要從事園林植物與觀賞園藝、生態(tài)規(guī)劃方面的研究。E-mail：yuniny@sina.com。

自1902年德國(guó)著名植物生理學(xué)家和植物學(xué)家Haberlandt提出了植物細(xì)胞具有全能性的理論之后，植物組織培養(yǎng)作為一種高效的植物快速繁殖技術(shù)顯示出了巨大的應(yīng)用價(jià)值。時(shí)至今日，植物組織培養(yǎng)技術(shù)以其特有的優(yōu)勢(shì)在理論研究和生產(chǎn)應(yīng)用上不斷被深入改進(jìn)和創(chuàng)新，各種植物幾乎都有進(jìn)行組織培養(yǎng)的報(bào)道。植物組織培養(yǎng)技術(shù)要求嚴(yán)格的無(wú)菌環(huán)境，需要特定的儀器設(shè)備（超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋和人工氣候箱），因而生產(chǎn)成本很高，且繁雜的操作程序?qū)ぷ魅藛T的技術(shù)都有一定的要求，這大大地限制了該技術(shù)的應(yīng)用和推廣。為了降低成本，簡(jiǎn)化工作程序，學(xué)者們一直在努力探索一種能高品質(zhì)和規(guī)?；a(chǎn)試管苗的新技術(shù)。隨著研究的不斷深入，“開(kāi)放式組織培養(yǎng)”理念被提出。植物開(kāi)放式組織培養(yǎng)是指在抑菌劑的作用下，使植物組織培養(yǎng)脫離嚴(yán)格無(wú)菌的操作環(huán)境，不需高壓滅菌和超凈工作臺(tái)，用普通容器代替組培瓶，在自然、開(kāi)放的有菌環(huán)境中進(jìn)行植物的組織培養(yǎng)[1]。開(kāi)放式組織培養(yǎng)與傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)相比，有成本低、操作環(huán)節(jié)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，因而受到研究者們的喜愛(ài)，更是規(guī)模化生產(chǎn)試管苗的必然趨勢(shì);但由于整個(gè)操作過(guò)程沒(méi)有在無(wú)菌的條件下進(jìn)行，防止污染也成了植物開(kāi)放式組織培養(yǎng)研究中的主要任務(wù)。崔剛等采用中醫(yī)理論，從多種植物中提取了具有殺菌、抗菌的活性物質(zhì)，成功研制出了具有廣譜性殺菌能力的抗菌劑，并利用這一技術(shù)成功地建立了葡萄外植體培養(yǎng)體系，同時(shí)還開(kāi)展了多種植物開(kāi)放式組織培養(yǎng)研究工作[2]。隨后研究者們?cè)诙喾N植物上進(jìn)行了開(kāi)放式組織培養(yǎng)的嘗試并取得了成功，主要有香蕉[3-4]、魔芋[5-6]、荸薺[7]、馬鈴薯[8]、梅花[9]、紅豆杉[10]、白菜[11]等植物，已建立開(kāi)放式組織培養(yǎng)技術(shù)體系的植物種類見(jiàn)表1。研究主要集中在抑菌劑種類的選擇和濃度的確定、培養(yǎng)方式以及培養(yǎng)基中有機(jī)物質(zhì)和無(wú)機(jī)碳這幾方面。本文從抑菌劑、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基成分等方面綜述了植物開(kāi)放式組織培養(yǎng)的應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展前景，以期為該技術(shù)的生產(chǎn)應(yīng)用及推廣提供一定的理論支撐。

表1 植物開(kāi)放式組織培養(yǎng)的應(yīng)用

試驗(yàn)材料 基本培養(yǎng)基 抑菌劑 作者 發(fā)表時(shí)間

香蕉 MS 次氯酸鈉 莫廷輝等 2011、2012

荸薺 MS 次氯酸鈉 吳桂容等 2013

魔芋 MS H198 趙青華等 2011

梅花 MS 特制消毒液 陳瑞丹等 2007

紅豆杉 MS 山梨酸鉀 王丹等 2010

白菜 B5 大蒜素、代森錳鋅 王趙玉等 2012

馬鈴薯 YEB、PDA YI-1 張薪薪等 2005

葡萄 MS0 特制消毒液 崔剛等 2004

蘋果 MS0 特制消毒液 崔剛等 2004

紅櫨 MS0 特制消毒液 崔剛等 2004

香花槐 MS0 特制消毒液 崔剛等 2004

蝴蝶蘭 MS0 特制消毒液 崔剛等 2004

地被菊 MS0 特制消毒液 崔剛等 2004

1 抑菌劑

在植物開(kāi)放式組織培養(yǎng)中，由于培養(yǎng)基不經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌，外植體處于開(kāi)放、自然的有菌環(huán)境中，所以能防止污染又不影響外植體生長(zhǎng)的抑菌劑就成了研究者們的研究重點(diǎn)?？股厥侵参锝M織培養(yǎng)中用來(lái)防止污染的傳統(tǒng)試劑，是組織培養(yǎng)中常用的一種抑菌劑。但其在抑菌的同時(shí)有一定的抑菌譜且容易使微生物產(chǎn)生耐藥性，對(duì)外植體的分化和生長(zhǎng)有一定的影響。王春發(fā)現(xiàn)在馬鈴薯培養(yǎng)基中添加20 mg/L的硫酸鏈霉素能完全抑制細(xì)菌浸染且對(duì)組培苗的生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)不良影響[12]。閻志紅等通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)50 mg/L的青霉素能夠有效地抑制培養(yǎng)基的污染，但長(zhǎng)期在含有此濃度青霉素的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)的西瓜的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)與生根明顯受到抑制[13]。簡(jiǎn)興等在紅掌的培養(yǎng)基中加入300 mg/L青霉素與180 mg/L鏈霉素混合液，比單一使用一種抗生素抑菌效果更好[14]。隨后研究者們嘗試使用其他物質(zhì)作為抑菌劑并獲得了試管苗，報(bào)道有農(nóng)藥（代森錳鋅）、食品添加劑（山梨酸鉀）、家用消毒液（次氯酸鈉）、植物提取物（大蒜素、特制消毒液）等作為抑菌劑。在香蕉的開(kāi)放式組織培養(yǎng)試驗(yàn)中，解輝等通過(guò)向培養(yǎng)基中添加不同濃度的次氯酸鈉溶液作為抑菌劑，發(fā)現(xiàn)0.01%以上濃度的次氯酸鈉可有效抑制培養(yǎng)基的污染，濃度超過(guò)002%時(shí)外植體的存活率降低，試管苗的生根率低于傳統(tǒng)組培苗[4]?？赡苁怯捎诖温人徕c加入培養(yǎng)基后產(chǎn)生的次氯酸對(duì)外植體的生長(zhǎng)有一定的影響且使培養(yǎng)基pH值降低影響了外植體對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的吸收。吳桂容等在荸薺的開(kāi)放式組織培養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)次氯酸鈉濃度為1.0%時(shí)的污染率最低，誘導(dǎo)率最高，但都低于對(duì)照組[7]。次氯酸鈉穩(wěn)定性差，易受熱、光和pH值的影響，這可能是導(dǎo)致以上2個(gè)試驗(yàn)所用次氯酸鈉濃度差別大的主要原因。王趙玉等自制生物農(nóng)藥大蒜素及化學(xué)農(nóng)藥代森錳鋅對(duì)白菜種子進(jìn)行開(kāi)放式組培，試驗(yàn)結(jié)果表明，0.10～017 g/mL的大蒜素抑菌效果較好且對(duì)植物生長(zhǎng)影響較小，代森錳鋅0.1～0.7 g/L抑菌效果較好且對(duì)植物的根和芽生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用[11]。趙青華等用6種不同的抑菌劑對(duì)魔芋進(jìn)行開(kāi)放組培，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑菌劑對(duì)愈傷組織的分化影響較大，容易引起愈傷組織褐變，濃度越低影響越小，且分化的試管苗長(zhǎng)勢(shì)也比傳統(tǒng)組織培養(yǎng)試管苗弱[6]。王丹等首次運(yùn)用食品添加劑山梨酸鉀作為開(kāi)放組培的抑菌劑，發(fā)現(xiàn)0.02 g/L的山梨酸鉀能有效抑制紅豆杉開(kāi)放組培中培養(yǎng)基的污染[10]。

目前利用次氯酸鈉、山梨酸鉀、代森錳鋅、大蒜素等作為開(kāi)放式組織培養(yǎng)的抑菌劑均獲得了組培苗（表2）。

表2 植物開(kāi)放式組織培養(yǎng)中抑菌劑的應(yīng)用情況

試驗(yàn)材料 抑菌劑種類 抑菌劑濃度 外植體生長(zhǎng)狀況

香蕉繼代叢生芽 次氯酸鈉 0.01%

荸薺莖芽 次氯酸鈉 1.0%

魔芋 H198 400倍液 比傳統(tǒng)試管苗弱

梅花莖段 特制消毒液 0.7%

紅豆杉三年生葉片 山梨酸鉀 0.02 g/L 污染率較高，存活率低

馬鈴薯試管苗 YI-1 62.5 g/mL 苗粗壯、葉片多、顏色綠、擴(kuò)展

葡萄莖段 特制消毒液 0.2% 苗生長(zhǎng)健壯，分化率較高

白菜種子 大蒜素 0.10～0.17 g/mL 種子萌發(fā)率80%以上，芽的生長(zhǎng)與對(duì)照組無(wú)顯著性差異

白菜種子 代森錳鋅 0.1～0.7 g/L 種子萌發(fā)率88%以上，芽的生長(zhǎng)與對(duì)照組無(wú)顯著性差異

2 培養(yǎng)容器

傳統(tǒng)的植物組織培養(yǎng)所用容器為錐形瓶，以塑料膜封口或用棉球塞封口，且容器要求能耐高溫高壓。而開(kāi)放式組織培養(yǎng)采用培養(yǎng)基中添加抑菌劑代替高溫高壓滅菌，所以容器的選擇范圍大。為了降低成本，簡(jiǎn)化程序，報(bào)道的試驗(yàn)所用培養(yǎng)容器均為一次性塑料杯，以保鮮膜封口。但趙青華等在對(duì)魔芋進(jìn)行開(kāi)放式組織培養(yǎng)時(shí)進(jìn)行了不同培養(yǎng)容器的對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果表明，一次性塑料杯由于質(zhì)量過(guò)輕，操作起來(lái)不方便，且長(zhǎng)期使用成本高，傳統(tǒng)的培養(yǎng)容器如錐形培養(yǎng)瓶和方形培養(yǎng)盒雖然一次性投入高，但能反復(fù)使用，且外植體生長(zhǎng)良好，是開(kāi)放式組織培養(yǎng)的最佳選擇[6]。

3 無(wú)機(jī)碳和有機(jī)物質(zhì)

蔗糖是外植體生長(zhǎng)發(fā)育的碳源和能量來(lái)源，沒(méi)有能量和碳源任何細(xì)胞都不能生長(zhǎng)，植物不能進(jìn)行正常的細(xì)胞分裂與組織分化。當(dāng)生長(zhǎng)素水平恒定時(shí)，2%蔗糖有利于分化出木質(zhì)部，4%蔗糖則有利于分化出韌皮部，3%的蔗糖則可以分化出二者，所以3%是植物組織培養(yǎng)常用的蔗糖濃度。植物組織培養(yǎng)中蔗糖是碳源和能量的供給物，同時(shí)也是微生物孳生的主要原因。為了降低污染率，研究者們采用降低蔗糖濃度、無(wú)糖培養(yǎng)等方式進(jìn)行。有關(guān)蔗糖濃度與開(kāi)放式組織培養(yǎng)中污染率之間的關(guān)系少有報(bào)道。吳桂容等在荸薺的開(kāi)放式組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度為2%時(shí)污染率最低而誘導(dǎo)率高，雖然隨著蔗糖濃度的提高，誘導(dǎo)率升高，但污染率也隨之升高[7]。在磨芋的開(kāi)放式組織培養(yǎng)中，趙青華等通過(guò)4個(gè)蔗糖濃度對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果表明，3%的蔗糖濃度有利于魔芋的誘導(dǎo)培養(yǎng)[6]。

無(wú)糖培養(yǎng)是采用人工環(huán)境控制手段，用CO2代替蔗糖作為碳源，提供植株生長(zhǎng)適宜的光、溫、水、氣、營(yíng)養(yǎng)等條件，促進(jìn)植株的光合作用，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。張偉在紅掌的快繁中發(fā)現(xiàn)，如果不具備上述的無(wú)糖培養(yǎng)條件，僅在培養(yǎng)基中不添加蔗糖，雖然接種后由于無(wú)糖作為污染源，污染率大大降低，但外植體不會(huì)發(fā)生愈傷組織，增殖率很低，增殖系數(shù)只有1.81，且生長(zhǎng)緩慢;而繼代培養(yǎng)的植株由于有了完整的莖、葉，具備一定的自養(yǎng)能力，不加蔗糖也能存活但植株基本無(wú)變化[15]。

有機(jī)成分在生物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中參與了生物體的新陳代謝，是所有生物體不可缺少的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。曹善東等對(duì)影響草莓組織培養(yǎng)繁殖系數(shù)的有機(jī)物因素進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果表明，甘氨酸是影響草莓繁殖系數(shù)的主要有機(jī)物因子，且濃度以2.0 mg/L為最適宜[16]。張清霞等將B5-10培養(yǎng)基中的有機(jī)物加倍，發(fā)現(xiàn)有機(jī)物加倍對(duì)某些大白菜品種花藥培養(yǎng)的出胚率無(wú)影響，而對(duì)一些難誘導(dǎo)出胚的品種則有促進(jìn)作用;添加絲氨酸使花藥培養(yǎng)的出胚率降低，而添加0.4 g/L谷酰胺對(duì)一些品種的胚誘導(dǎo)效果好[17]。有機(jī)物質(zhì)與污染率有一定的關(guān)系，荸薺的開(kāi)放式組織培養(yǎng)中，去掉培養(yǎng)基中的有機(jī)成分能有效降低污染率，尤其是去掉甘氨酸后，污染率最低[7]。

4 培養(yǎng)方式

培養(yǎng)方式對(duì)開(kāi)放式組織培養(yǎng)的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。吳桂容等在荸薺的開(kāi)放式組織培養(yǎng)中進(jìn)行了培養(yǎng)方式對(duì)其污染率和誘導(dǎo)率的影響試驗(yàn)，結(jié)果表明，培養(yǎng)室內(nèi)污染率最低，玻璃溫室和塑料溫室的污染率都較高[7]。固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)對(duì)開(kāi)放式組織培養(yǎng)的影響還未見(jiàn)報(bào)道，僅王趙玉等在B5的固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中加入了不同的抑菌劑對(duì)白菜種子進(jìn)行開(kāi)放式組培[11]，但未進(jìn)行固體與液體培養(yǎng)基對(duì)開(kāi)放式組培的影響的對(duì)比。張慎等認(rèn)為循環(huán)流動(dòng)的液體培養(yǎng)基不易受微生物的侵蝕，比固體培養(yǎng)基更適合于植物開(kāi)放式組織培養(yǎng)[1]。

5 接種條件

傳統(tǒng)組織培養(yǎng)中，接種用的工具如鑷子、刀片等均采用高溫高壓滅菌或乙醇燈灼燒滅菌或?qū)Ｓ媒臃N滅菌器滅菌。而開(kāi)放式組織培養(yǎng)中，省掉了高溫高壓滅菌這一過(guò)程，崔剛等將接種工具用75%乙醇擦洗后放在抑菌劑中浸泡1 h，接種過(guò)程中鑷子和刀片一直浸泡在抑菌劑中，這樣可有效防止接種工具引起的污染[2]。趙青華等通過(guò)試驗(yàn)表明在魔芋的開(kāi)放式組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)瓶不需要進(jìn)行特殊的殺菌處理，接種盤、鑷子和刀片用抑菌劑浸泡處理即可達(dá)到滅菌效果[6]。

6 發(fā)展前景

植物開(kāi)放式組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)環(huán)境無(wú)嚴(yán)格的無(wú)菌要求，操作程序簡(jiǎn)化，成本降低，是未來(lái)植物組織培養(yǎng)發(fā)展的主要方向。既能抑菌又不影響外植體生長(zhǎng)的抑菌劑是植物開(kāi)放式組織培養(yǎng)技術(shù)的核心，故尋找有效的抑菌劑是研究者們工作的重點(diǎn)?？股乜咕Ч^好，但有一定的抗菌譜且對(duì)外植體生長(zhǎng)有一定的影響。化學(xué)農(nóng)藥及家用消毒劑的加入對(duì)外植體的生長(zhǎng)發(fā)育有一定的影響。利用生物提取物制成的中藥混合物作為抑菌劑一直是研究者們比較認(rèn)同的有效抑菌劑，但是中藥的選擇及提取過(guò)程比較繁瑣。一些具有抗菌作用的蛋白質(zhì)如乳鐵蛋白和溶菌酶等，對(duì)外植體無(wú)任何副作用且不誘導(dǎo)微生物的抗性，可能是將來(lái)開(kāi)放組培中抑菌劑的主要成分。

參考文獻(xiàn)：

[1]張 慎，郭陶然，鄧志瑞，等. 植物開(kāi)放式組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（26）：14281-14283，14288.

[2]崔 剛，單文修，秦 旭，等. 植物開(kāi)放式組織培養(yǎng)研究初探[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，35（4）：529-533.

[3]黃泰達(dá)，莫廷輝. 香蕉開(kāi)放式組織培養(yǎng)中增殖培養(yǎng)基成分優(yōu)化研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（18）：9584-9586.

[4]解 輝，莫廷輝，曾麗星. 次氯酸鈉在香蕉開(kāi)放式組織培養(yǎng)中的應(yīng)用研究[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2011，32（5）：886-890.

[5]趙青華，陳永波，滕建勛，等. 開(kāi)放式組織培養(yǎng)下魔芋快繁技術(shù)研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011（13）：114-115.

[6]趙青華，陳永波，楊朝柱，等. 魔芋開(kāi)放式組織培養(yǎng)技術(shù)初探[J]. 氨基酸和生物資源，2009，31（4）：79-82.

[7]吳桂容，曲芬霞，余炳鋒. 賀州荸薺開(kāi)放式組織培養(yǎng)體系建立[J]. 北方園藝，2013（6）：110-112.

[8]張薪薪，唐金花，王關(guān)林.抑菌劑在開(kāi)放組培中的使用及效果研究[J]. 遼寧師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，28（4）：466-469.

[9]陳瑞丹，孫文薇. 梅花品種“淡豐后”莖段開(kāi)放式啟動(dòng)培養(yǎng)的初步研究[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，29（增1）：30-34.

[10]王 丹，劉 霞. 山梨酸鉀在紅豆杉開(kāi)放式組織培養(yǎng)中的應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（2）：634-635.

[11]王趙玉，張健雄，戶新宇，等. 抑菌劑在開(kāi)放式植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用研究[J]. 北方園藝，2012（18）：125-127.

[12]王 春. 醫(yī)用抗生素在馬鈴薯組織培養(yǎng)中的抑菌效應(yīng)研究[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2004（10）：15-16.

[13]閻志紅，劉文革，趙勝杰，等. 青霉素和乳酸對(duì)西瓜組織培養(yǎng)中細(xì)菌污染的抑制作用[J]. 長(zhǎng)江蔬菜，2009（18）：21-23.

[14]簡(jiǎn) 興，王米力，石大興. 紅掌組培苗繼代過(guò)程中細(xì)菌污染的防治試驗(yàn)[J]. 亞熱帶植物科學(xué)，2003，32（2）：52-54.

[15]張 偉. 盆栽紅掌離體快繁簡(jiǎn)化培養(yǎng)基的研究[J]. 信陽(yáng)農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2012，22（2）：102-106.

[16]曹善東，李桂新. MS培養(yǎng)基中不同濃度有機(jī)物對(duì)草莓脫毒苗繁殖系數(shù)的影響[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，35（1）：32-35.

[17]張清霞，楊曉云，張淑霞，等. 基因型和培養(yǎng)基中有機(jī)物變化對(duì)大白菜花藥培養(yǎng)的影響[C]. 中國(guó)園藝學(xué)會(huì)十字花科蔬菜分會(huì)第六屆學(xué)術(shù)研討會(huì)暨新品種展示會(huì)論文集，2008：296-300.