艾芬地爾對(duì)強(qiáng)迫游泳模型小鼠抗抑郁作用實(shí)驗(yàn)研究

徐賽 謝沂宏 萬(wàn)美霞 王芳 張開(kāi)蓮

(瀘州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥物分析教研室，四川 瀘州 646000)

艾芬地爾對(duì)強(qiáng)迫游泳模型小鼠抗抑郁作用實(shí)驗(yàn)研究

徐賽 謝沂宏 萬(wàn)美霞 王芳 張開(kāi)蓮

(瀘州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥物分析教研室，四川 瀘州 646000)

目的：評(píng)價(jià)艾芬地爾對(duì)強(qiáng)迫游泳模型小鼠抗抑郁作用效果。方法：采用小鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)研究艾芬地爾抗抑郁作用。(1)艾芬地爾抗抑郁作用起效時(shí)間和持續(xù)時(shí)間試驗(yàn)：150昆明小鼠隨機(jī)分為15組，每組10只，其中實(shí)驗(yàn)組(酒石酸艾芬地爾1 mg·kg-1)、空白對(duì)照組(0.9%氯化鈉注射液)、陽(yáng)性對(duì)照組(氯胺酮2 mg·kg-1)，分別在腹腔注射給藥后30 min、60 min、120 min、240 min、300 min進(jìn)行強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)；(2)艾芬地爾抗抑郁作用量效關(guān)系試驗(yàn)：100只昆明小鼠隨機(jī)分為10組，每組10只，其中實(shí)驗(yàn)組(酒石酸艾芬地爾0.2 mg·kg-1、1 mg·kg-1、5 mg·kg-1)，陽(yáng)性對(duì)照組(氯胺酮2 mg·kg-1)，空白對(duì)照組(0.9%氯化鈉注射液)，分別于腹腔注射后120min、240min進(jìn)行強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)；(3)反復(fù)給藥后艾芬地爾抗抑郁效果評(píng)價(jià)：60只昆明小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，其中實(shí)驗(yàn)組(酒石酸艾芬地爾5 mg·kg-1)，空白對(duì)照組(0.9%氯化鈉注射液)，第1、2、3組分別連續(xù)給藥2 d、4 d、6 d，三組均在最后一天給藥后240 min進(jìn)行強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)。結(jié)果：艾芬地爾可在120 min內(nèi)顯著縮短強(qiáng)迫游泳小鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間，該作用可持續(xù)240 min，其作用強(qiáng)度在1 mg·kg-1～5 mg·kg-1范圍內(nèi)與劑量呈正相關(guān)；反復(fù)多次給藥后，其作用持續(xù)時(shí)間仍然為240 min。結(jié)論：艾芬地爾對(duì)強(qiáng)迫游泳模型小鼠具有明顯的抗抑郁作用，反復(fù)多次給藥后，其抗抑郁作用持續(xù)時(shí)間維持穩(wěn)定。

酒石酸艾芬地爾；抑郁癥；抗抑郁作用；小鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)

酒石酸艾芬地爾片劑于1979年4月首次獲準(zhǔn)在日本上市，早期主要用于改善腦梗死或腦出血后遺癥。之后法國(guó)也相繼開(kāi)發(fā)其片劑和注射劑，適應(yīng)癥更為廣泛，還用于腦供血不足相關(guān)的精神頹廢癥狀、短暫性缺血發(fā)作和老齡化引起的精神行為障礙等。目前艾芬地爾尚未在國(guó)內(nèi)上市，但已有三家公司于2005年將其作為仿制藥申報(bào)。本課題組從2011年開(kāi)始對(duì)艾芬地爾抗抑郁作用進(jìn)行研究，初步結(jié)果顯示，單次給予小劑量(1～3 mg·kg-1)艾芬地爾能在短時(shí)間內(nèi)顯著縮短強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中小鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間，也能在短時(shí)間內(nèi)顯著減少穿梭箱試驗(yàn)中獲得性無(wú)助模型小鼠的逃避失敗次數(shù)[1-2]。因此推測(cè)艾芬地爾可能具有快速起效抗抑郁作用。

為了探討艾芬地爾作為新型抗抑郁藥的可能性，本課題組進(jìn)一步對(duì)其抗抑郁作用起效時(shí)間和持續(xù)時(shí)間、量效關(guān)系以及反復(fù)給藥后作用持續(xù)時(shí)間進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性昆明小鼠，體重18-23 g(瀘州醫(yī)學(xué)院SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)SCXK(川)2013-17)。

1.1.2 主要儀器

秒表(運(yùn)動(dòng)秒表，中國(guó)廣東萬(wàn)機(jī)電子秒表廠(chǎng))；KQ500B超聲清洗儀器(昆山市超聲儀器有限公司)；BSA-CW型電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器)；游泳燒杯1000 ml，直徑12 cm，高15 cm；一次性無(wú)菌注射器(生產(chǎn)批號(hào)：批20120901，2 ml，成都市新津事豐醫(yī)療器械有限公司)。

1.1.3 藥物

酒石酸艾芬地爾原料藥(美國(guó)施瑞醫(yī)藥公司武漢子公司(3B Pharmachem International(Wuhan) Co., Ltd)，批號(hào)WH20120105，10 g，含量98.0 %)；鹽酸氯胺酮注射液(批號(hào)110301，2 ml：0.1 g，福建古田藥業(yè)有限公司)；0.9%氯化鈉注射液(批號(hào)M13041014，500 ml，四川科倫藥業(yè)股份有限公司)；滅菌注射用水(批號(hào)130702101，500 ml，四川美大康佳樂(lè)藥業(yè)有限公司)

1.2 方法

小鼠試驗(yàn)前飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室3天，自由飲食飲水。室內(nèi)溫度維持在22-25℃，以消除環(huán)境對(duì)小鼠的影響，減少實(shí)驗(yàn)誤差。為了減少時(shí)間對(duì)動(dòng)物行為的影響，本實(shí)驗(yàn)均于上午進(jìn)行。

1.2.1 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)[3]

選取體重18-23 g雄性小鼠，腹腔注射給藥后，將小鼠放入水溫為21-22℃的水中，水深10 cm，可稍作調(diào)整讓小鼠后爪能夠剛剛接觸水底又不能使其支撐住身體，保證動(dòng)物身體平衡又避免了溺水。強(qiáng)迫游泳總時(shí)間為6 min，游泳前2 min為適應(yīng)時(shí)間，記錄其后的4 min中內(nèi)的累積不動(dòng)時(shí)間，以s為單位。每只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)后換水，防止小鼠氣味影響后面小鼠行為。

不動(dòng)狀態(tài)的判別標(biāo)準(zhǔn)[4]：小鼠在水中停止掙扎并呈漂浮狀態(tài)，或僅有細(xì)小的肢體運(yùn)動(dòng)以保持頭部浮在水面。

1.2.2 酒石酸艾芬地爾抗抑郁作用起效時(shí)間和持續(xù)時(shí)間試驗(yàn)

150只昆明小鼠隨機(jī)分為15組，每組10只。分別腹腔注射1 mg·kg-1(0.25 ml)酒石酸艾芬地爾后30 min、60 min、120 min、240 min、300 min進(jìn)行強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)。每組對(duì)應(yīng)空白組均腹腔注射相同體積的生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射2 mg·kg-1(0.25 ml)氯胺酮[5]。

1.2.2 酒石酸艾芬地爾抗抑郁作用量效關(guān)系試驗(yàn)

100只昆明小鼠隨機(jī)分為10組。分別腹腔注射高(5 mg·kg-1)、中(1 mg·kg-1)、低(0.2 mg·kg-1)三個(gè)劑量酒石酸艾芬地爾后分別于120 min、240 min進(jìn)行強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)。每組對(duì)應(yīng)空白組均腹腔注射相同體積的生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射2 mg·kg-1(0.25 ml)氯胺酮[5]。

1.2.3 反復(fù)給藥后酒石酸艾芬地爾抗抑郁效果評(píng)價(jià)

60只昆明小鼠隨機(jī)分為6組。腹腔注射酒石酸艾芬地爾5 mg·kg-1，第一組連續(xù)給藥2 d，第二組連續(xù)給藥4 d，第三組連續(xù)給藥6 d，每日給藥1次，三組均在最后一天給藥后240 min記錄小鼠累積不動(dòng)時(shí)間。每組對(duì)應(yīng)空白組均腹腔注射相同體積的生理鹽水。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 酒石酸艾芬地爾抗抑郁作用起效時(shí)間和持續(xù)時(shí)間試驗(yàn)

氯胺酮組累計(jì)不動(dòng)時(shí)間與生理鹽水組有顯著性差異(P<0.05)；藥物組累計(jì)不動(dòng)時(shí)間與氯胺酮組均有顯著性差異；在給藥后30 min、60 min、300 min，藥物組累計(jì)不動(dòng)時(shí)間與生理鹽水組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在給藥后120 min、240 min，藥物組累計(jì)不動(dòng)時(shí)間與生理鹽水組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.2 酒石酸艾芬地爾抗抑郁作用量效關(guān)系試驗(yàn)

在給藥后120 min，中劑量藥物組、高劑量藥物組累積不動(dòng)時(shí)間與生理鹽水組均有顯著性差異(P<0.05)，且中、高劑量藥物組之間有顯著性差異。低劑量藥物組累積不動(dòng)時(shí)間與生理鹽水組無(wú)顯著性差異，低劑量藥物組、中劑量藥物組累積不動(dòng)時(shí)間與氯胺酮組均有顯著性差異(P<0.05)。高劑量藥物組累積不動(dòng)時(shí)間與氯胺酮組無(wú)顯著差異。

圖1 酒石酸艾芬地爾抗抑郁作用起效時(shí)間和持續(xù)時(shí)間試驗(yàn)

在給藥后240 min，中劑量藥物組、高劑量藥物組累積不動(dòng)時(shí)間與生理鹽水組均有顯著性差異(P<0.05)。低劑量藥物組累積不動(dòng)時(shí)間與生理鹽水組無(wú)顯著性差異。低劑量藥物組、中劑量藥物組累積不動(dòng)時(shí)間與氯胺酮組均有顯著性差異(P<0.05)。高劑量藥物組累積不動(dòng)時(shí)間與氯胺酮組無(wú)顯著性差異，見(jiàn)圖2。

圖2 酒石酸艾芬地爾抗抑郁作用量效關(guān)系試驗(yàn)

3.3 反復(fù)給藥后酒石酸艾芬地爾抗抑郁效果評(píng)價(jià)

反復(fù)給藥6次、反復(fù)給藥4次、反復(fù)給藥2次后累計(jì)不動(dòng)時(shí)間均與生理鹽水組有顯著性差異(P<0.01)；反復(fù)給藥6次、反復(fù)給藥4次、反復(fù)給藥2次兩兩之間無(wú)顯著性差異，如圖3。

圖3 反復(fù)給藥后酒石酸艾芬地爾抗抑郁效果評(píng)價(jià)

3 討論

非選擇性N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑——氯胺酮快速起效抗抑郁作用已被臨床和動(dòng)物試驗(yàn)所證實(shí)[5-6]。單一小劑量的氯胺酮能在數(shù)小時(shí)內(nèi)對(duì)具有抗藥性的重癥抑郁癥患者迅速起效，作用可長(zhǎng)達(dá)7天[5]。但隨給藥次數(shù)的增加，其抗抑郁作用持續(xù)時(shí)間逐漸縮短[9]。之后，將NMDA受體作為抗抑郁新靶點(diǎn)的研究取得了顯著的進(jìn)展[6-8]，雖然作用機(jī)制至今尚未明確，但其抗抑郁作用是肯定的。非選擇性NMDA受體拮抗劑的副作用限制了其在臨床上作為抗抑郁藥的應(yīng)用，而艾芬地爾作為NR2B亞型NMDA受體拮抗劑，可克服非競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體拮抗劑容易產(chǎn)生擬精神癥狀以及對(duì)認(rèn)知的損害等副作用，還可對(duì)抗應(yīng)急所引起的腦細(xì)胞凋亡[9]。因此本課題選擇艾芬地爾作為研究對(duì)象。

強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)是經(jīng)典的用于抗抑郁藥物效能檢驗(yàn)及新型抗抑郁藥篩選的試驗(yàn)[7，10-11]。本文選擇該試驗(yàn)對(duì)艾芬地爾是否具有抗抑郁作用做出初步評(píng)價(jià)，試驗(yàn)結(jié)果顯示艾芬地爾可在2小時(shí)內(nèi)顯著縮短強(qiáng)迫游泳小鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間；該作用可持續(xù)4小時(shí)，其作用強(qiáng)度在1 mg·kg-1～5 mg·kg-1范圍內(nèi)與劑量呈正相關(guān)；反復(fù)多次給藥后，其作用持續(xù)時(shí)間不存在隨給藥次數(shù)增加而逐漸縮短的情況。強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)?zāi)Ｐ同F(xiàn)常用于抗抑郁劑的快速篩選，不足之處在于假陽(yáng)性太高,降低了其作為抑郁模型的有效性。后期課題組還會(huì)選擇多種抑郁動(dòng)物模型，如慢性不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激試驗(yàn)、獲得性無(wú)助試驗(yàn)等，綜合評(píng)價(jià)艾芬地爾對(duì)抑郁動(dòng)物模型快速起效抗抑郁作用的效果。

將氯胺酮作為陽(yáng)性對(duì)照藥物是因?yàn)槠渥饔冒悬c(diǎn)與艾芬地爾相同，都是NMDA受體拮抗劑，本課題研究目的就是試圖證明艾芬地爾可能具有與氯胺酮相同或相似的快速起效抗抑郁作用。而作為抗抑郁作用試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照金標(biāo)準(zhǔn)的藥物——氟西汀是一種選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRI)型的抗抑郁藥，用藥2-3周之后才起效，與本研究平行性較差。

4 結(jié)論

動(dòng)物試驗(yàn)研究結(jié)果初步顯示酒石酸艾芬地爾具有快速起效抗抑郁作用。

1 萬(wàn)美霞. “N2011”抗抑郁作用評(píng)價(jià)及其在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究[D]. 2013,11-20.

2 謝沂宏. “N2011”抗抑郁作用研究及其鼻用原位凝膠的研制[D]. 瀘州醫(yī)學(xué)院碩士論文, 2013, 12-23.

3 Porsolt RD, Lepidnon M, Jalfre M. Depression:a new animal model sensitive to antidepressant treatment [J]. Nature, 1977, 266(5604):730-732.

4 Hashimoto K. Brain-derived neurotrophic factor as a biomarker for mood disorders:a historical overview and future directions [J]. Psychiatry Clin Neurosci, 2010, 64(4):341-357.

5 Berman RM, Cappiello A, Anand A, et al. Antidepressant effects of ketamine in depressed patients [J]. Biol Psychiatry, 2000, 47(4):351-354.

6 Zarate CA, Singh JB, Carlson PJ, et al. A randomized trial of an N-methyl-D-aspartate antagonist in treatment-resistant major depression [J]. Arch Gen Psychiatry, 2006, 63(8):856-864.

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8 Autry AE, Adachi M, Nosyreva E, et al. NMDA receptor blockade at rest triggers rapid behavioural antidepressant responses [J]. Nature, 2011, 475(7354):91-95.

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10 Pollak DD, Rey CE, Monje FJ. Rodent models in depression research:classical strategies and new directions[J]. Ann Med, 2010, 42(4):252-264.

11 Cryan JF, Valentino RJ, Lucki I. Assessing substrates underlying the behavioral effects of antidepressants using the modified rat forced swimming test [J]. Neurosci Biobehav Rev, 2005, 29(4-5):547-569.

Anti-depression effects of ifenprodil tartrate on forced swimming mice model

Xu Sai, Xie Yi-Hong, Wan Mei-Xia, Wang Fang, Zhang Kai-Lian

(Department of Pharmacoanalysis, School of Pharmacy, Luzhou Medical College, Sichuan Luzhou 646000)

Objective：To investigate the anti-depression effects of ifenprodil tartrate on the forced swimming mice model. Methods: Forced swimming test(FST) on mice was used to investigate the anti-depression effect of ifenprodil.(1) Test of the onset time and the duration time of ifenprodil tartrate in the antidepressant effect:one hundred and fifty mouse were randomly divided into fifteen groups(n=10), including the experimental groups(1 mg·kg-1ifenprodil tartrate), the positive control groups(2 mg·kg-1ketamine) and the control groups(NS). The forced swimming test were taken after 30 minutes, 60 minutes, 120 minutes, 240 minutes and 300 minutes respectively and the immobility time of mouse were recorded.(2) Test of the dose-effect relationship of ifenprodil tartrate in the antidepressant effect:One hundred mouse were divided randomly into ten groups(n=10), including the experimental groups(0.2 mg·kg-1, 1 mg·kg-1and 5 mg·kg-1ifenprodil tartrate), the positive control groups(2 mg·kg-1ketamine) and the control groups(NS). The forced swimming test was taken after 120 minutes and 240 minutes respectively.(3) Test of the antidepressant effect evaluation of ifenprodil tartrate on repeated dose:sixty mouse were randomly divided into six groups(n=10), including the experimental groups(5 mg·kg-1ifenprodil tartrate) and the control groups(NS). The experimental group mouse were intraperitoneal injectioned ifenprodil tartrate for two days, four days and six days, respectively. The forced swimming tests were taken after 240 minutes at the last day of injection. Results: The onset time and the duration time of the effect of anti-depression of ifenprodil were respectively 120 minutes and 240 minutes. There was a positive correlation between the dose-dependent relationship and the antidepressant effect of ifenprodil tartrate in the range of 1 mg·kg-1～5 mg·kg-1. The duration time on repeated dose still was 120 minutes. Conclusions: The effect of anti-depression on the forced swimming mice model for ifenprodil tartrate was accurate and the duration time was stable enough on repeated dose.

Ifenprodil tartrate; Depression; Antidepressant effect; Forced swimming test(FST)

徐賽，女，在讀碩士，Email：mag200@qq.com。

△通訊作者：張開(kāi)蓮，女，教授，主要從事新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究、抗抑郁藥研究，Email：442728665@qq.com。

2014-12-22)