姜黃素調(diào)控Notch1信號通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株凋亡

劉少瓊，楊 芳，禹正楊，李春花，劉 婭，劉婉瑩

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 衡陽 421001）

姜黃素調(diào)控Notch1信號通路誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株凋亡

劉少瓊，楊 芳，禹正楊，李春花，劉 婭，劉婉瑩

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南 衡陽 421001）

目的 從Notch1信號通路探討姜黃素誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株凋亡的分子機(jī)制。方法 （1）利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測不同濃度姜黃素（0，7.5，15，30，60 μmol/L）處理結(jié)腸癌SW480株24 h和48 h后的細(xì)胞凋亡情況。（2）通過RT-PCR檢測不同濃度姜黃素（0，7.5，15，30，60 μmol/L）處理結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株24 h和48 h后，Notch1信號通路中膜受體基因Notch1及下游靶基因Hes-1 mRNA表達(dá)情況，觀察姜黃素對Notch1信號通路中Notch1及Hes-1基因mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果 （1）姜黃素能誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株凋亡；（2）姜黃素能一定程度上下調(diào)Notch1信號通路中Notch1及Hes-1基因mRNA的表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)論 姜黃素能一定程度上誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株凋亡，這種對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞毒性作用可能與調(diào)控Notch1信號通路中膜受體基因Notch1及下游靶基因Hes-1轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

姜黃素；Notch1信號通路；結(jié)腸癌；SW480；細(xì)胞凋亡

腫瘤是當(dāng)今世界第二大致死因素[1]，而結(jié)直腸癌是世界上第三常見惡性腫瘤，發(fā)病率在男性和女性患者中分別位居第三位和第二位[2]，并且結(jié)直腸癌在年輕人中發(fā)生率逐漸上升，年齡小于30周歲的年輕患者結(jié)直腸癌侵襲力更強(qiáng)、預(yù)后更差[3]。雖然，經(jīng)規(guī)范聯(lián)合化療，可使結(jié)直腸癌病人5年生存率達(dá)42.7%，但世界上平均每年仍有60.8萬癌癥病人死于結(jié)直腸癌[4]；同時放化療給結(jié)直腸癌患者帶來明顯的毒副作用，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，患者依從性差，因此尋找高效、低副作用的抗腫瘤藥物依然是研究者們的主攻課題。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥在亞洲地區(qū)應(yīng)用于治療惡性腫瘤有著悠久的歷史。姜黃素是由中藥姜黃根莖提取，目前研究顯示姜黃素對包括結(jié)直腸的多種腫瘤有抑制作用，此外它還具備抗炎、抗氧化、防衰老等作用，除了功效多外，其毒副作用小、耐受性好，是極具潛力的抗癌活性物質(zhì)之一[5]，然而姜黃素抗結(jié)腸癌的分子機(jī)制尚未統(tǒng)一，因此有必要進(jìn)一步探討。

Notch1信號通路在多種腫瘤（包括乳腺癌、腎癌、食管癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌等）組織中檢測出過度表達(dá)，并且Notch1信號與這些腫瘤對化療藥物耐藥及腫瘤向周圍侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)[6-7]。Notch1信號通路在研究治療腫瘤分子機(jī)制中占有重要地位。

本文擬從Notch1信號通路探討中藥提取物姜黃素誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株凋亡的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株、藥物與試劑

結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株購于湘雅細(xì)胞中心 （中國，湖南長沙），無噬菌體胎牛血清購于四季青生物公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購于Hyclone（美國），姜黃素粉末（J-007）購于成都瑞芬思生物科技有限公司（HPLC≥98.5%），cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Thermo公司，DNA marker、2×Taq MasterMi（含染料）購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，GoldView I型核酸染色劑均購于北京Solarbio公司，PBS粉末、總RNA提取試劑盒、流式細(xì)胞檢測試劑盒購于南京凱基生物公司，cDNA擴(kuò)增引物由上海生工公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 主要儀器

AIR-TECH醫(yī)用凈化工作臺 （蘇州蘇潔凈化設(shè)備公司）；DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；PCR擴(kuò)增儀（德國Roche Diagnostics公司）；Hema凝膠圖像分析儀（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；紫外分光光度計(jì) （德國Eppendorf公司）；流式細(xì)胞儀 （美國BD FACSAria II）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，加1%青-鏈霉素雙抗，于5%CO2，37℃孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株，1～2 d換液1次；待其貼壁生長融合至80%左右、細(xì)胞處于對數(shù)生長期時進(jìn)行細(xì)胞傳代及種板。

2.2 藥物配制及實(shí)驗(yàn)分組

姜黃素粉末溶于二甲基亞砜（DMSO），母液濃度為1 mol/mL，經(jīng)0.22 μm無菌過濾器過濾后4℃冰箱避光保存，使用時用培養(yǎng)基稀釋成工作液，并使DMSO最終濃度＜0.01%。

實(shí)驗(yàn)分組:根據(jù)濃度梯度姜黃素分為5組，即0（對照組）、7.5、15、30、60 μmol/L。處理時間:24 h和48 h。

2.3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測SW480細(xì)胞凋亡

按照凱基Annexin-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作:將對數(shù)生長期細(xì)胞根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組加入含姜黃素培養(yǎng)基，處理24 h和48 h后分別收集細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞2次后分別加入500 μL的Binding Buffer液懸浮細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-FITC溶液混勻后，加入5 μL碘化丙啶 （PI)，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5 min；使用美國BD FACSAria II流式細(xì)胞儀檢測。

2.4 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及RT-PCR

2.4.1 總RNA提取步驟 對數(shù)生長期細(xì)胞經(jīng)姜黃素處理分別24 h和48 h后，棄掉培養(yǎng)液，按照Solarbio總RNA提取試劑盒說明書操作提取總RNA，操作過程中均使用去酶的EP管和Tip頭，RNA提取后用紫外光分光光度計(jì)進(jìn)行定量，測定樣品在260 nm和280 nm的吸光度，確定RNA質(zhì)量。提取的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

2.4.2 逆轉(zhuǎn)錄及PCR引物擴(kuò)增 按照Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR引物擴(kuò)增反應(yīng)條件:95℃ 5min預(yù)變性，95℃變性30 s，按各自退火溫度退火30 s，延伸 72℃ 30 s，重復(fù)循環(huán)32次，最后延伸72℃ 5 min。

擴(kuò)增引物序列見表1。

表1 PCR 31物擴(kuò)增引物序列及反應(yīng)條件

2.4.3 瓊脂糖凝膠電泳 稱取2 g瓊脂糖，移入三角瓶中加入1×TBE，置微波爐中加熱至溶液沸騰，自然冷卻至70～80℃時，加入EB替代物GoldView I型核酸染色劑，搖勻倒入模具中自然冷卻制成2%瓊脂糖凝膠，目的基因使用2%瓊脂糖凝膠，而內(nèi)參β-actin使用1%瓊脂糖凝膠。制好的凝膠放入電泳槽中加入 1×TBE電泳液，每孔上樣 5 μL，DNAMarker加入5 μL，80 V恒壓電泳25 min，紫外燈下觀察結(jié)果。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

使用AlphaImager 2200圖像分析軟件對存入計(jì)算機(jī)的PCR產(chǎn)物電泳的圖像進(jìn)行光密度掃描，目的基因產(chǎn)物光密度值/β-actin產(chǎn)物的光密度值為目的基因相對表達(dá)量（重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次）。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以采用One-Way ANOVA單因素方差分析法檢驗(yàn)，結(jié)果以“±s”表示，P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株凋亡

流式細(xì)胞結(jié)果顯示姜黃素能誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株凋亡，當(dāng)姜黃素濃度組為7.5 μmol/L和15 μmol/L時，與對照組0 μmol/L相比處于凋亡期細(xì)胞比例相差不大，而姜黃素濃度為60 μmol/L時，細(xì)胞處理 24 h位于Q2期細(xì)胞 （凋亡期）為56%，而處理48 h凋亡細(xì)胞可達(dá)94.4%。

3.2RT-RCR結(jié)果

當(dāng)處理24 h時，姜黃素各濃度組Notch1基因mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而處理48 h時，60 μmol/L組與對照組 （0 μmol/L）相比，Notch1基因mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05）（圖1，圖2）。當(dāng)處理 24 h時，姜黃素各濃度組 Hes-1基因mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而處理48 h時，60 μmol/L組與對照組 （0 μmol/L）相比，Hes-1基因mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05）（圖3，圖4）。姜黃素能一定程度上下調(diào)Notch1及Hes-1基因mRNA表達(dá)。

4 討論

結(jié)直腸癌是世界第三大常見腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是由遺傳和生理改變多種因素共同作用而成，其主要分子機(jī)制尚未明確。在哺乳動物中，Notch信號主要由配體 （Dll1、Dll3、Dll4、Jagged1、Jagged2)，受體（Notch 1-4）和相關(guān)靶基因:Hes和HERP等構(gòu)成。Notch信號激活由臨近細(xì)胞配-受體結(jié)合后，受體蛋白水解，釋放胞漿內(nèi)活性結(jié)構(gòu)域（Notch intracellular domain，NICD），NICD易位至細(xì)胞核，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，誘導(dǎo)Notch信號下游靶基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄[8]。

圖1 Notch1基因mRNA凝膠電泳圖

圖2 姜黃素對Notch1基因mRNA表達(dá)的影響

圖3 Hes-1基因mRNA凝膠電泳圖

圖4 姜黃素對Hes-1基因mRNA表達(dá)的影響

Notch1信號通路是Notch信號通路之一，它能在結(jié)直腸腫瘤組織中高表達(dá)并在結(jié)直腸癌發(fā)展過程中起致癌作用，不僅如此，Notch1在組織中高表達(dá)與病人總生存期短及預(yù)后差有關(guān)，可作為判斷預(yù)后和治療結(jié)直腸癌的潛力生物標(biāo)記[9]。Hes-1基因是堿性螺旋—環(huán)—螺旋 （basic Helix-Loop-Helix，bHLH）基因家族的一個重要成員，Hes-1蛋白是bHLH基因的負(fù)性轉(zhuǎn)錄因子，通過與靶DNA或其他一些bHLH蛋白直接結(jié)合，切斷激活途徑，最終使轉(zhuǎn)錄無法進(jìn)行，達(dá)到抑制細(xì)胞分化的目的。Hes-1蛋白作為Notch信號通路下游最重要的效應(yīng)分子，在細(xì)胞的分化中具有重要的作用[10]。

姜黃素是中藥姜黃中提取的活性成分，臨床研究顯示它可作其他化療藥物（如紫杉醇、5-FU）的輔助用藥，不僅增強(qiáng)了抗癌效果、減少化療藥物的使用劑量[11]，而且還可減輕化療帶來的毒副作用，如皮膚損傷、腸道反應(yīng)等[12]。并且姜黃素?zé)o明顯副作用，患者耐受性好。雖然較低的生物利用度一定程度上限制了姜黃素推廣使用，但經(jīng)過研究者們的努力，通過改變其劑型或者通過結(jié)合一些金屬離子及特異性抗體形成雜交概念的姜黃素分子等，提高了它的生物溶解度及生物利用度[13]。

流式細(xì)胞結(jié)果顯示姜黃素能一定程度上誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株凋亡。RT-PCR方法檢測到姜黃素能一定程度下調(diào)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株中細(xì)胞膜受體基因Notch1及下游靶基因Hes-1的mRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。本研究團(tuán)隊(duì)前期研究顯示姜黃素能夠一定程度上抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株中與Notch1信號通路相關(guān)蛋白，如Notch1受體蛋白和下游靶蛋白Hes-1的表達(dá)[14-15]，從蛋白翻譯水平闡述姜黃素對Notch1信號通路的調(diào)節(jié)作用，本文從基因轉(zhuǎn)錄水平對姜黃素調(diào)控Notch1信號通路進(jìn)行補(bǔ)充。Notch1信號通路在人結(jié)直腸癌組織中起致癌作用，姜黃素能下調(diào)Notch1信號通路而誘導(dǎo)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株凋亡，但是Notch1信號通路是由多個元件構(gòu)成，其下游有多個靶基因，并且靶基因之間關(guān)系復(fù)雜，本研究僅從Hes-1單個靶基因進(jìn)行探討姜黃素對Notch1信號通路調(diào)節(jié)作用有一定的局限性，我們期望在后續(xù)研究中找到姜黃素調(diào)控Notch1信號通路的最終靶位基因，并深入探討其與Hes-1靶基因之間的關(guān)系。

同時姜黃素誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞株凋亡并不是通過單一分子機(jī)制完成的，姜黃素調(diào)控Notch1信號通路可能是分子機(jī)制之一。本研究僅為姜黃素治療結(jié)直腸腫瘤提供理論參考，更深入探討姜黃素抗腫瘤的分子機(jī)制仍然是未來抗癌研究方向。

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（本文編輯 楊 瑛）

Curcumin Promoting Apoptosis of Colon Cancer Cell line SW480 by Regulating Notch1 Signal Pathway

Shao-Qiong Liu,Fang Yang,Zheng-Yang Yu,Chun-Hua Li,Ya Liu,Wan-Ying Liu
(The First Affiliated Hospital of University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

Objective To investigate molecular mechanism of curcumin in promoting apoptosis of colon cancer cell line SW480 through Notch1 signal pathway.Methods (1)The apoptosis of colon cancer cell line SW480 treated by diverse concentrations of curcumin(0，7.5，15，30，60 μmol/L)for 24 hours and 48 hours were tested by flow cytometry method.(2) The mRNA expressions of gene Notch1 and gene Hes-1 in Notch1 signal pathway of colon cancer cell line SW480 were detected by RT-PCR,which was treated by diverse concentrations of curcumin(0，7.5，15，30，60 μmol/L).Results(1) Curcumin could promote apoptosis of colon cancer cell line SW480.(2)Curcumin could decrease mRNA expressions of gene Notch1 and gene Hes-1 of colon cancer cell line SW480(P＜0.05).Conclusion Curcumin could accelerate apoptosis of colon cancer cell line SW480,and the effect of anticancer may be associated with regulating mRNA expressions of gene Notch1 and Hes-1 in Notch 1 signal pathway.

curcumin;Notch1 signal pathway;colon cancer;SW480;apoptosis

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.08.005

2015-05-07

湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（11JJ6083）。

劉少瓊，女，主任醫(yī)師，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail:liushaoqiong861224＠126.com。