剛地弓形蟲Peroxiredoxin多克隆抗體的制備及鑒定

蘇丹華，沈超群，吳 亮，劉 原，付 濤，周家豪，姜旭淦，陳盛霞，曹建平

剛地弓形蟲Peroxiredoxin多克隆抗體的制備及鑒定

蘇丹華1，沈超群1，吳 亮1，劉 原1，付 濤1，周家豪1，姜旭淦1，陳盛霞1，曹建平2

目的 原核表達(dá)剛地弓形蟲過氧化物氧化還原酶(peroxiredoxin，Prx)并制備多克隆抗體。方法 PCR技術(shù)擴(kuò)增弓形蟲cDNA中的prx基因，克隆至pET-28a(+)載體，構(gòu)建prx/pET-28a(+)重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌(E.coli)Rosetta中誘導(dǎo)表達(dá)。親和層析純化重組Prx蛋白，并制備兔多克隆抗體，蛋白印跡技術(shù)對(duì)多克隆抗體進(jìn)行鑒定。結(jié)果 成功從弓形蟲cDNA中擴(kuò)增出prx目的基因，構(gòu)建了prx/pET-28a(+)重組質(zhì)粒，獲得抗Prx重組蛋白的多克隆抗體。蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)出弓形蟲Prx的特異性條帶。結(jié)論 重組弓形蟲Prx制備的多克隆抗體能檢測(cè)Prx在弓形蟲速殖子表達(dá)。

剛地弓形蟲；過氧化物氧化還原酶；原核表達(dá)；多克隆抗體

剛地弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的寄生蟲。免疫功能正常的人感染弓形蟲后，一般表現(xiàn)為輕微的流感樣癥狀，無明顯的臨床特征。免疫功能降低、先天性免疫功能缺陷者或者胎兒感染弓形蟲后會(huì)引起嚴(yán)重的弓形蟲病，從而導(dǎo)致人體各器官出現(xiàn)嚴(yán)重病變，新生兒腦炎、智力障礙，甚至流產(chǎn)，畸胎等[1-2]。

過氧化物氧化還原酶(peroxiredoxin，Prx)是抗氧化家族的成員，可作為抗氧化酶清除過氧化氫和羥自由基[1,3]。分布在速殖子細(xì)胞質(zhì)中的弓形蟲Prx不僅能清除蟲體自身代謝產(chǎn)生的活性氧族，而且能拮抗宿主免疫細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧族[4-5]。蛋白組學(xué)分析顯示，Prx為弓形蟲速殖子可溶性抗原的組成成分[6-7]。本研究旨在構(gòu)建Prx的原核表達(dá)載體以獲得重組Prx，經(jīng)純化后免疫家兔獲得抗Prx多克隆抗體，為研究弓形蟲的抗氧化機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和蟲株 Hela細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，弓形蟲RH株由本實(shí)驗(yàn)室液氮冷凍保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大白兔，2.0 kg左右，雄性，由江蘇省江陵動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，在江蘇大學(xué)動(dòng)物中心清潔級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.1.3 質(zhì)粒和菌株 pET-28a(+)原核表達(dá)質(zhì)粒、pTG19-T質(zhì)粒、大腸埃希菌DH5α和Rossetta菌株均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.4 試劑和儀器 2×Taq Mater Mix PCR預(yù)混液和增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，牛血清白蛋白、瓊脂糖膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量制備試劑盒、DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)均購(gòu)自上海捷瑞生物技術(shù)有限公司，限制性核酸內(nèi)切酶BamH I、XhoI購(gòu)自上海ThermoFisher科技有限責(zé)任公司，T4連接酶購(gòu)自寶生物大連有限責(zé)任公司。全溫空氣搖床QYC-200購(gòu)自上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(HRP-IgG)、硝酸纖維素NC膜購(gòu)自武漢博士德公司，福氏不完全佐劑和福氏完全佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。脫色搖床購(gòu)自金壇市醫(yī)療儀器廠，核酸蛋白分析儀購(gòu)自英國(guó)WPA公司，超聲波細(xì)胞粉碎儀購(gòu)自寧波新芝生物科技公司，全自動(dòng)凝膠成像儀及垂直電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 弓形蟲cDNA的制備 根據(jù)吳亮等[8]報(bào)道的方法在Hela細(xì)胞中傳代培養(yǎng)弓形蟲RH株速殖子。從液氮中取出凍存的弓形蟲RH株速殖子，按照慢凍快融的原則，37 ℃水浴快速?gòu)?fù)蘇，3 000 r/min離心5 min，用1 mL 15%小牛血清RPMI 1640重懸后接種于Hela細(xì)胞。培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃ 5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱，用倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞和蟲體的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)觀察到大量蟲體游離在細(xì)胞外時(shí)，以滅菌PBS緩沖液(pH7.4)洗3次后，收集蟲體標(biāo)本。按照RNA提取試劑盒的說明書，提取弓形蟲速殖子總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2Prx基因擴(kuò)增與克隆 根據(jù)ToxoDB基因庫(kù)提供的弓形蟲RH株基因組prx的基因序列，利用DNASTAR軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物如下：上游引物Prx-BamH I：5′-GGCGGATCCATGCCGGCCCCGATGGTGTCT-3′，下游引物Prx-XhoI： 5′-GGCCTCGAGCTTGCTTCCGAGATACTC-3′，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以弓形蟲RH株速殖子cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性10 s，56.1 ℃退火20 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定后，用瓊脂糖膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，與克隆載體pTG19-T于16 ℃連接12 h后轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌感受態(tài)DH5α，涂布于含50 μL AMP、20 μL X-gal和10 μL IPTG的LB平板上，37 ℃溫箱里培養(yǎng)12 h，通過藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中增菌過夜，次日按堿裂解法提取重組質(zhì)粒。

1.2.3 重組質(zhì)粒prx/pTG19-T的鑒定 提取的重組質(zhì)粒通過PCR和BamH I酶切鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒送上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序。用Blast比對(duì)分析基因測(cè)序結(jié)果，篩選與弓形蟲prx編碼基因完全一致的質(zhì)粒用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒prx/pET-28a(+)的構(gòu)建與鑒定 重組質(zhì)粒prx/pTG19-T和pET-28a(+)載體經(jīng)BamH I和XhoI雙酶切后，用瓊脂糖膠回收試劑盒分別回收目的片段和表達(dá)載體片段，T4連接酶16 ℃連接過夜后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DH5α。堿裂解法提取重組質(zhì)粒，通過PCR和雙酶切鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Rossetta中。

1.2.5 重組蛋白的表達(dá)與可溶性分析 挑取陽(yáng)性菌落接種于3 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，次日以1∶100接種于含同種抗生素的20 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃振搖培養(yǎng)1.5～2 h，當(dāng)至對(duì)數(shù)期A600為0.4～0.6時(shí)，無菌分裝到6個(gè)玻璃試管中，每管3 mL，第1管不加IPTG，其余5管加入IPTG使其終濃度為0.4 mmol/L，25 ℃分別誘導(dǎo)表達(dá)2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，經(jīng)SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)情況。另取1.5 mL菌液，離心收集菌體沉淀，用500 μL的PBS重懸菌體沉淀，超聲裂解后離心，吸取上清至新EP管中，沉淀繼續(xù)用500 μL PBS重懸。分別吸取30 μL的上清和沉淀，進(jìn)行蛋白可溶性分析。

1.2.6 重組蛋白Prx的純化 在最佳表達(dá)條件下，用200 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基增菌。收集菌體，超聲破碎后，4 ℃、10 000 r/min離心30 min，收集上清，和氯化鎳4 ℃結(jié)合4 h，用洗滌緩沖液(20 mmol/L咪唑，50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl)洗脫雜蛋白，然后用洗脫緩沖液(250 mmol/L咪唑，50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl)洗脫目的蛋白。

1.2.7 兔抗重組蛋白Prx多克隆抗體的制備 按姜旭淦等[9]報(bào)道方法進(jìn)行。先制備充足的乳化抗原，在兔背部通過皮內(nèi)多點(diǎn)注射的方法免疫，初次免疫前取兔耳緣靜脈血，分離血清后做陰性對(duì)照。第1次免疫乳化抗原的制備是由重組純化蛋白加入等體積的弗氏完全佐劑，第2和3次乳化抗原的制備采用重組純化蛋白加入等體積的弗氏不完全佐劑。第1次免疫3周后，進(jìn)行第2次免疫，間隔1周后進(jìn)行第3次免疫，共免疫3次，免疫方法和劑量同首次免疫。第3次免疫1周后耳緣靜脈采集兔血，分離血清，ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)。當(dāng)抗體效價(jià)>1∶640 000時(shí)，終止免疫，心臟采血法收集兔血，分離血清，于-70 ℃保存。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)Prx在弓形蟲速殖子內(nèi)的表達(dá) 弓形蟲RH株速殖子在Hela細(xì)胞中傳代培養(yǎng)，收集1×107蟲體于無菌EP管中，加20 μL 2×SDS-PAGE上樣緩沖液充分混勻，煮沸5～10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清液SDS-PAGE分析。電泳完成后，將目的蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，5%脫脂奶粉封閉30 min，加入1∶1 000的兔抗Prx血清，室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，再與1∶5 000 HPR標(biāo)記羊抗兔IgG室溫孵育1 h，進(jìn)行ECL顯影反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 弓形蟲prxPCR擴(kuò)增結(jié)果 以弓形蟲RH株cDNA為模板，PCR擴(kuò)增弓形蟲prx基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得588 bp目的條帶，與弓形蟲prx基因理論擴(kuò)增大小相符(圖1A)。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒prx/pET-28a(+)的鑒定 重組表達(dá)質(zhì)粒prx/pET-28a(+)通過BamH I和XhoI雙酶切后得到約588 bp和5 369 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果一致，證明弓形蟲prx基因被完整插入到表達(dá)載體pET-28a(+)中(圖1B)。

2.3 重組Prx蛋白的最佳表達(dá)條件和純化 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rossetta后，經(jīng)過對(duì)表達(dá)條件的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)菌液在A600接近0.6，誘導(dǎo)劑IPTG終濃度為1.0 mmol/L，30 ℃誘導(dǎo)8 h時(shí)，可得到大量的可溶性蛋白。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳親和層析技術(shù)純化后進(jìn)行SDS-PAGE分析，在25 kDa處有一條清晰的目的蛋白回收帶，即純化后的目的蛋白(圖2A)。

M1,M2: DNA marker; 1: prx;2: prx/pET-28a(+)

圖1 PCR擴(kuò)增弓形蟲prx基因和prx/pET-28a(+)重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

Fig.1 PCR amplification ofprxgene inT.gondiiand identification ofprx/pET-28a(+) by restriction enzyme digestion

M: Protein molecular weight marker; 1: unpurified recombinant protein;2: purified recombinant protein; 3: Hela cell; 4: tachyzoites ofT.gondii

圖2 重組Prx蛋白純化SDS-PAGE分析和蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)弓形蟲速殖子Prx的表達(dá)

Fig.2 Purification of recombinant Prx by SDS-PAGE analysis and Western blotting analysis of Prx expression inT.gondii

2.4 蛋白印跡技術(shù)鑒定多克隆抗體 蛋白印跡結(jié)果顯示，弓形蟲RH株在25 kDa處有反應(yīng)條帶，陰性標(biāo)本無此條帶(圖2B)，表明制備的多克隆抗體有較好的特異性。

3 討 論

Peroxiredoxin是一類具有顯著抗氧化作用的酶[10]，主要包括硫氧還蛋白過氧化物酶(TPx)和烷基過氧化氫酶C(AhpC)等。Prx抗氧化酶系廣泛分布于酵母、真菌、寄生蟲、哺乳動(dòng)物和人類等多種生物體內(nèi)[11]。所有生物的Prx都包含一個(gè)“過氧化反應(yīng)”半胱氨酸，它在與氫過氧化物的反應(yīng)中被氧化為半胱氨酸次磺酸(Cys-SOH)[12]。Prx不需要與金屬離子結(jié)合就可以發(fā)揮抗氧化作用，它的抗氧化活性體現(xiàn)在通過分解過氧化氫和烷基過氧化物來阻止強(qiáng)氧化劑羥自由基的產(chǎn)生[13]。Prx在剛地弓形蟲的抗氧化系統(tǒng)里發(fā)揮著重要作用，除了過氧化氫酶，Prx也可能參與過氧化氫的降解過程[14]。此外，Prx還可以通過介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，與細(xì)胞因子協(xié)同作用控制過氧化物的平衡，由此在細(xì)胞增殖[15]、分化和凋亡中起到重要作用[16-18]。

根據(jù)參與催化功能的半胱氨酸殘基的數(shù)量，可將Prx分為1-Cys Prx和2-Cys Prx兩類[12]，弓形蟲Prx(TgPrx)有3種，TgPrx-1和TgPrx-3屬于2-Cys Prx，TgPrx-2屬于1-Cys Prx，它們各自或協(xié)同地在氧化應(yīng)激中發(fā)揮抗氧化作用[19]。本研究成功構(gòu)建了TgPrx-1原核表達(dá)載體，獲得了融合表達(dá)蛋白，并純化重組蛋白Prx，免疫新西蘭兔后獲得多克隆抗體。蛋白印跡技術(shù)鑒定抗體有良好的特異性。

劉轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)等[4]已報(bào)道弓形蟲prx基因的克隆表達(dá)和抗血清制備，但其設(shè)計(jì)的引物、原核表達(dá)載體、感受態(tài)細(xì)胞以及免疫動(dòng)物與本研究不同，且未對(duì)制備的抗體進(jìn)行鑒定。另外，已有的Prx相關(guān)研究是從研制弓形蟲疫苗候選抗原和免疫學(xué)診斷的角度出發(fā)，本研究制備的Prx兔多克隆抗體，可為后續(xù)弓形蟲速殖子Prx在宿主細(xì)胞中的表達(dá)及其生物學(xué)功能研究提供基礎(chǔ)。

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Preparation and identification of polyclonal antibody of peroxiredoxin fromToxoplasmagondii

SU Dan-hua1,SHEN Chao-qun1,WU Liang1,LIU Yuan1,FU Tao1,ZHOU Jia-hao1,JIANG Xu-gan1,CHEN Sheng-xia1,CAO Jian-ping2

(1.SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China; 2.NationalInstituteofParasiticDiseases,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Shanghai200025,China)

To clone and express the peroxiredoxin(Prx) ofToxoplasmagondiiRH strain and produce the polyclonal antibody,prxgene fragments amplified by PCR were cloned into the pET-28a(+) vector to construct the prokaryotic expression vectorprx/pET-28a(+), which was efficiently expressed inE.coliRosetta. Recombinant Prx proteins were purified by Ni-NTA affinity chromatography. The anti-Prx polyclonal antibody was produced in rabbit. Western blotting could detect Prx expression by anti-Prx polyclonal antibody. The recombinant Prx polyclonal antibody will facilitate the study of the biological functions of Prx.

Toxoplasmagondii; peroxiredoxin (Prx); prokaryotic expression; polyclonal antibody

Chen Sheng-xia, Email: chensxia@ujs.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.001

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81301453)，衛(wèi)生部寄生蟲病原與媒介生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(No.WSBKTKT201302)，中國(guó)博士后科學(xué)基金特別資助(No.2015T80518)，中國(guó)博士后科學(xué)基金(No.2014M561598)，江蘇省博士后科研計(jì)劃(No.1402171C)和江蘇大學(xué)高級(jí)人才啟動(dòng)基金(No.13JDG023，No.13JDG127)聯(lián)合資助

陳盛霞，Email：chensxia@ujs.edu.cn

1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013; 2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所，上海 200025

R382.5

A

1002-2694(2015)12-1089-04

2015-04-01；

2015-07-24

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81301453), the Laboratory of Parasite and Vector Biology of China, MOPH (No.WSBKTKT201302), the China Postdoctoral Science Special Foundation(No.2015T80518),the China Postdoctoral Science Foundation (No.2014M561598), the Jiangsu Postdoctoral Science Foundation (No. 1402171C), and the Senior Talent Studying Initial Funding of Jiangsu University (No. 13JDG023, 13JDG127)