葛根川芎藥對中葛根素和阿魏酸的大鼠在體腸吸收機制

夏敬勝，蔡瑜

(武漢市第三醫(yī)院藥學部，武漢 430060)

葛根川芎藥對中葛根素和阿魏酸的大鼠在體腸吸收機制

夏敬勝，蔡瑜

(武漢市第三醫(yī)院藥學部，武漢 430060)

目的 探討葛根川芎藥對中指標性成分葛根素、阿魏酸在體腸吸收機制，為其復方的研發(fā)及臨床應用提供依據(jù)。方法 采用大鼠在體腸單向灌流法，高效液相色譜(HPLC)法測定葛根素、阿魏酸2種成分含量，考察葛根-川芎藥對提取物三種人工腸液緩沖液濃度、灌流時間及大鼠十二指腸、空腸、回腸及結腸對其吸收的影響。 結果 高、中、低濃度葛根-川芎藥對中葛根素和阿魏酸的全腸段吸收速率常數(shù)(Ka)均約0.01 min-1；兩種成分的全腸段表觀吸收系數(shù)(Papp)均在0.03～0.05 cm·min-1，濃度對葛根素、阿魏酸腸吸收情況影響不大。葛根素在不同腸段的Ka及Papp不同，Ka值在十二指腸最大為(0.099 0±0.002 7) min-1，Papp值在空腸最大為(0.014 0±0.001 2 )cm·min-1；阿魏酸Ka值在十二指腸最大為(0.180±0.036)min-1，Papp值在空腸最大(0.037±0.015)cm·min-1。葛根素的Ka和Papp隨時間影響很小，而阿魏酸Ka和Papp都隨時間影響變化較大。結論 葛根川芎藥對中指標性成分葛根素、阿魏酸屬于被動吸收。

葛根素；阿魏酸；藥對；吸收，腸，在體

中藥藥動學研究方法多效仿西藥研究模式，從中藥材中分離目標成分后，采用生物醫(yī)學方法研究其吸收、分布、代謝、排泄規(guī)律[1]。藥物被吸收是發(fā)揮藥效的首要環(huán)節(jié)，藥物吸收的研究是評價藥物生物利用度的重要手段，可為藥物的轉運及轉化研究提供基礎?？诜幬锏奈眨Q于藥物本身的理化性質、小腸上皮細胞的通透作用、腸黏膜構造、腸內(nèi)酶及腸上皮細胞對藥物代謝的屏障作用。研究腸吸收機制，可以獲得藥物在腸道的吸收動力學參數(shù)、有效吸收部位、吸收機制、影響因素等信息，從而為提高藥物生物利用度提供參考。

在體腸灌流模型的原理是假定藥物的減少等于藥物的吸收，通過測定灌流液中藥物減少量來評價藥物的小腸吸收情況，測定吸收速率及吸收量等，計算藥物的吸收動力學參數(shù)，如藥物吸收速率常數(shù)(Ka)、表觀吸收系數(shù)(Papp)等，能在一定程度上反映藥物的滲透和吸收動力學特征?？捎糜谘芯恐兴巻误w成分、復方提取物及中藥制劑指標性成分的腸吸收機制，考察胃腸吸收的最適pH和最佳吸收部位[2-4]。

葛根川芎配伍(1.2：1)藥對能顯著改善腦缺血、眩暈等癥狀[5-6]，主要用于治療頸椎病[7]，其藥動學研究筆者未見報道。筆者在本實驗采用大鼠在體腸單向灌流法，用高效液相色譜(HPLC)法測定葛根川芎藥對中指標性成分葛根素、阿魏酸含量，考察不同藥物濃度、灌流時間、不同腸段對其吸收的影響。探討葛根川芎藥對中2種指標性成分的在體腸吸收機制，以期為這一藥對在復方配伍及臨床應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠，體質量180～220 g，雌雄各半，購自廣東省動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2014-0035，飼養(yǎng)環(huán)境SPF級，動物質量合格證號：44008200003485，動物使用許可證號：SYXK(粵)2008-0085。

1.2 試藥 阿魏酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110773-201012，純度：97%)；葛根素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110752-200912，純度：98%)；人工腸液(Kreb-Ringer's，KR)緩沖液[8](氯化鈣 0.37 g·L-1，葡萄糖1.4 g·L-1，氯化鈉7.8 g·L-1，氯化鈣0.35 g·L-1，碳酸氫鈉1.37 g·L-1，磷酸二氫鈉0.32 g·L-1，氯化鎂0.02 g·L-1)；乙腈(HPLC級，Honeywell Burdick & Jackson，批號：M44A1H)；甲醇(HPLC級，Honeywell Burdick & Jackson，批號：N5AG1H)；水為純化水；其余試劑均為分析純；葛根(產(chǎn)地：廣西，批號：110510)、川芎(產(chǎn)地：四川，批號：110510)藥材均購自廣州致信中藥飲片有限公司，經(jīng)武漢市第三醫(yī)院藥學部陳永剛副教授鑒定為合格藥材，均符合《中華人民共和國藥典》2010年版相關藥材項檢驗標準，飲片標本保存于武漢市第三醫(yī)院藥學部標本室。

1.3 儀器 戴安Ultimate 3000型高效液相色譜儀(包括四元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器、Chromeleon工作站)；AR224CN電子天平[d=0.000 1 g，奧豪斯儀器(上海)公司]；SK3300LH超聲儀(托利多儀器上海有限公司)；IKA RV10 HB10 basic旋轉蒸發(fā)儀(德國IKA)；HHS-4S水浴鍋(上海宜昌儀器紗篩廠)；TGL-16G高速離心機(上海安亭科學儀器廠)；HL-2恒流泵(上海滬西分析儀器廠有限公司)。

1.4 色譜條件 色譜柱：戴安公司Acclaim C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-乙腈-0.5%磷酸梯度洗脫，洗脫程序見表1。流速：1.0 mL·min-1，檢測波長：250 nm，柱溫30 ℃。

表1 甲醇-乙腈-0.5%磷酸梯度洗脫程序%

1.5 對照品溶液的配制 分別取阿魏酸、葛根素對照品適量，精密稱定，置100 mL量瓶，加甲醇溶解并定容，搖勻，分別得濃度為22 μg·mL-1阿魏酸、27 μg·mL-1葛根素對照品溶液。

1.6 樣品溶液的制備 按12：10取葛根、川芎藥材1份，加10倍量65%乙醇，回流提取2次，每次2 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，至95 ℃烘箱中干燥至干，取出，置于干燥器中冷卻，打成細粉，備用。取上述葛根川芎藥對提取物粉末約25.0，12.5，6.25 g，精密稱定，置500 mL量瓶，用KR緩沖液溶解，并稀釋至刻度，搖勻，配成高(50 mg·mL-1)、中(25 mg·mL-1)、低(12.5 mg·mL-1)3種濃度。

1.7 大鼠在體腸吸收實驗方法 參照文獻[2]。將大鼠禁食過夜(自由飲水)，用3 mg·mL-1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(30 mg·kg-1)，固定。置40 ℃水浴鍋上保持體溫。沿腹腔中線打開腹腔，分離出所需腸段，于切口處插管(進、出液口插管約3 cm)，結扎。用預熱的37 ℃KR緩沖液以150 r·min-1[r為灌流腸段橫截面半徑(cm)]恒定流速將小腸內(nèi)容物沖洗干凈，再平衡10 min，排凈空氣，將傷口用脫脂棉覆蓋保濕，各組灌流液保持37 ℃恒溫，以150 r·min-1速度平衡10 min后，記為0 min時，以后葛根-川芎湯灌流液以100 r·min-1的流速灌流120 min。分別于20，40，60，80，100，120 min用已知質量的離心管收集灌流液，稱定質量，再于各管中取灌流液1 mL，加入甲醇1 mL沉淀蛋白，6 000 r·min-1離心5 min，取上清液用孔徑0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾液即為樣品溶液，分別吸取對照品溶液、樣品溶液各20 μL注入液相色譜儀，測定各時間點各成分的吸收峰面積。用上述實驗方法分別考察高、中、低濃度及各腸段對各成分在體腸吸收的影響規(guī)律。

1.8 不同濃度藥物在全腸段吸收情況考察 參照文獻[2]，考察樣品在大鼠十二指腸、空腸、回腸以及結腸中的吸收情況。觀察腸段取約10 cm，各腸段區(qū)間如下：十二指腸段，自幽門1 cm處開始往下10 cm；空腸，自幽門15 cm處起往下10 cm；回腸，自盲腸上行20 cm處開始往下10 cm；結腸，從盲腸后端開始往下10 cm。不同腸段分別用同一濃度藥物的灌流液進行灌流，其他步驟同“1.7” 項，計算樣品在各腸段的Ka與Papp，比較藥物在不同腸段吸收情況差異[2]。

Qin和Qout分別為腸道進出口灌流液的體積(mL)(假定進出口灌流液密度為110 g·mL-1)，Cin和Cout分別為腸道進出口灌流液的濃度(未知成分按峰面積計算)，l和r分別為被灌流腸段長度(cm) 和橫截面半徑(cm)，Q為灌流速度，t為灌流時間。Ka和Papp為各個時間段樣品的平均值。

2 結果

2.1 線性關系 阿魏酸在8.80～880 ng 范圍內(nèi)線性關系良好，標準曲線為Y=0.018 6X+0.000 5，r=0.999 9；葛根素在1.08 ～108 ng范圍內(nèi)線性關系良好，標準曲線為Y=0.023 6X+ 0.000 6，r=0.999 9。

2.2 精密度實驗 精密吸取葛根素、阿魏酸對照品溶液40 μL，連續(xù)進樣6次，記錄葛根素、阿魏酸色譜峰峰面積，計算峰面積積分值RSD值。結果葛根素、阿魏酸RSD分別為0.40%，0.6%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性實驗 取高濃度葛根-川芎-KR樣品溶液分別于0，12，20，32，40，48 h進樣15 μL分析，測定葛根素和阿魏酸峰面積，計算RSD值。結果葛根素、阿魏酸峰面積積分值RSD分別為1.1%，1.3%(n=6)，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重復性實驗 取葛根川芎粉末6份，精密稱定，按樣品制備方法，制備成高濃度樣品溶液，按上述色譜條件，進樣15 μL分析，記錄葛根素和阿魏酸色譜峰峰面積，計算葛根素和阿魏酸的峰面積積分值RSD值。結果RSD分別為3.6%，2.4%，表明方法重復性良好。

2.5 濃度對藥物吸收的影響 實驗分高、中、低組，每組4只大鼠，雌雄各半，按“1.8” 項方法進行實驗。實驗結果選取葛根素、阿魏酸，研究其腸道吸收情況。結果見表2,3。

2.6 不同腸段對藥物吸收的效果 實驗選用中濃度樣品溶液按“1.8”項下方法對大鼠4個腸段分別進行灌腸，檢測葛根素和阿魏酸的吸收情況。其中每個腸段用大鼠4只，雌雄各半。結果見表4。不同時段各成分吸收情況見圖1和圖2。

2.7 不同時段各成分吸收情況 不同時段葛根素和阿魏酸Ka和Papp變化趨勢見圖1，2。

表2 不同濃度動物凈水流量

3 討論

目前關于中藥有效成分小腸吸收研究，黃酮類和生物堿類成分最多，醌類、萜類和苯丙素類均有研究[9]。改變口服給藥劑型，可以制成脂質體，可增加親水性中藥成分的腸道吸收；或者添加促吸收劑，如葵酸鈉、冰片，也可以促進腸道的吸收[10]。

本實驗結果顯示葛根素和阿魏酸在全腸段均有吸收。用濃度或峰面積計算葛根素和阿魏酸的Ka及Papp值差異無統(tǒng)計學意義。從3種濃度灌流液對大鼠全腸段進行的灌流實驗結果可見，藥物濃度對各成分吸收參數(shù)的影響不大，全腸段的平均吸收量較低，Papp均<0.03。其中葛根素和阿魏酸在全腸段的吸收速率和吸收量差異無統(tǒng)計學意義，濃度對兩者影響不大；葛根素在十二指腸吸收最快，在回腸吸收最慢也最少，在空腸吸收最多；阿魏酸在十二指腸吸收最快，在結腸吸收最慢，在空腸吸收量最大，在十二指腸吸收量最小。葛根素的吸收速率和吸收量受時間影響很小，而阿魏酸的吸收速率和吸收量受時間影響變化較大，其中吸收速率隨時間先變快，后變慢，而吸收量也先變大，后變小。

表3 不同濃度藥物中葛根素和阿魏酸全腸段Ka和Papp值

表4 不同腸段葛根素和阿魏酸的Ka和Papp值

圖1 葛根素和阿魏酸Ka隨時間變化曲線

圖2 葛根素和阿魏酸Papp隨時間變化曲線

相關研究結果顯示，阿魏酸在全腸段吸收速率差異無統(tǒng)計學意義，且藥材中阿魏酸比單體阿魏酸的腸道吸收速率更快[11]。阿魏酸濃度在20～200 μg·mL-1范圍內(nèi)，Ka變化不大，在十二指腸、空腸和回腸的吸收較好，在結腸的吸收較差[12]。復方配伍時，阿魏酸腸吸收量增加，但藥物濃度增大時，阿魏酸的腸吸收基本無變化。研究顯示，復方配伍后，隨著藥物濃度增大，葛根素腸吸收增加；其腸吸收量也隨濃度增大而增加，屬于被動吸收[13]。葛根素在腸道內(nèi)的吸收表現(xiàn)為一級動力學過程，吸收機制是被動擴散，吸收速率較慢[14-15]。研究顯示葛根素與鹽酸小檗堿配伍，在腸道內(nèi)吸收程度和速度隨著鹽酸小檗堿劑量的提高而升高[16]。加入白芷提取物后，葛根素在空腸吸收明顯增加，在空腸灌流實驗中，葛根素Papp與Ka隨藥物濃度增大而逐漸減少，含有P-糖蛋白抑制劑維拉帕米的葛根素Ka與Papp都比單純葛根素吸收增加2倍多[17]。

從本實驗結果可見本藥對大鼠的腸吸收情況良好，提示可進一步對不同比例藥對配伍和與不同藥味組方后的藥動學研究，以期為其臨床應用提供更可靠實驗依據(jù)。

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2014-05-10

2014-06-19

夏敬勝(1974-)，男，湖北武漢人，主管藥師，從事醫(yī)院制劑研究。電話：(0)13329703680，E-mail：461981818@qq.com。

蔡瑜(1975-)，男，湖北武漢人，主管藥師，學士，主要從事醫(yī)院制劑研究。E-mail： 920462684@qq.com。

R286；R965

A

1004-0781(2015)02-0173-04

DOI 10.3870/yydb.2015.02.008