不同穿刺點(diǎn)行子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)對(duì)小鼠胚胎皮層發(fā)育的影響

張鵬 吳翠瑩 陶慶霞 牛力軍 陳文錦 劉寧 徐如祥

·基礎(chǔ)研究·

不同穿刺點(diǎn)行子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)對(duì)小鼠胚胎皮層發(fā)育的影響

張鵬 吳翠瑩 陶慶霞 牛力軍 陳文錦 劉寧 徐如祥

目的探討子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)技術(shù)操作過(guò)程中三種不同的穿刺點(diǎn)對(duì)胚胎死亡率、皮層厚度和皮層面積，以及細(xì)胞分化、增殖、遷移和細(xì)胞凋亡的影響。方法通過(guò)應(yīng)用免疫熒光染色對(duì)Tbr1，Tbr2，Pax6，Ctip2，Caspase-3和Ki67等標(biāo)記物的檢測(cè)分析，評(píng)價(jià)三種不同穿刺點(diǎn)對(duì)細(xì)胞分化、增殖、遷移和細(xì)胞凋亡的影響。應(yīng)用SPSS13.0軟件使用單因素方差分析的方法對(duì)分化、增殖和凋亡實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果三種不同的穿刺點(diǎn)無(wú)論對(duì)胚胎死亡率、皮層厚度和皮層面積，還是細(xì)胞分化、增殖、遷移和細(xì)胞凋亡的影響均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論三種不同的穿刺點(diǎn)對(duì)宮內(nèi)電轉(zhuǎn)胚胎無(wú)顯著性影響。

基因轉(zhuǎn)移技術(shù)；穿刺點(diǎn)；分化；增殖；

隨著生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展，越來(lái)越多的生物學(xué)片段被鑒定出來(lái)，然而識(shí)別這些生物學(xué)片段與判定該片段的功能是兩個(gè)不同的概念，后者通常需要使用多種手段來(lái)決定。目前存在多種基因功能鑒定的方法，例如，轉(zhuǎn)基因和基因打靶技術(shù)可以改變某一基因并使其穩(wěn)定傳遞至下一代[1,2]；重組病毒和啟動(dòng)子基因槍可以傳導(dǎo)基因到體內(nèi)組織[3,4]等。然而上述方法存在局限性，轉(zhuǎn)基因的生產(chǎn)過(guò)程、獲得基因打靶小鼠或重組病毒的過(guò)程耗時(shí)、耗力，實(shí)現(xiàn)靶基因在精準(zhǔn)時(shí)間與位置成功表達(dá)非常困難。相比而言，子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)技術(shù)，操作時(shí)間短、見效快，并可使基因的過(guò)表達(dá)或失活限定在特定時(shí)間段特定組織內(nèi)。

子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)技術(shù)是將質(zhì)粒DNA注射進(jìn)入胎鼠腦室內(nèi)，然而施加電壓于子宮壁外合適位置，在電場(chǎng)的作用下，質(zhì)粒DNA向正極電極板方向移動(dòng)，最終到達(dá)目標(biāo)特定腦區(qū)。借助該方法，可向腦組織內(nèi)轉(zhuǎn)染表達(dá)不同顏色熒光蛋白的基因以觀察細(xì)胞的遷移與分化情況，從而分析該基因的功能[5,6,7]。與其它方法相比，子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)技術(shù)具有多種優(yōu)點(diǎn)：高效性，時(shí)空精確性，并可同時(shí)將多種基因轉(zhuǎn)染進(jìn)同一細(xì)胞[7]。甚至該技術(shù)可標(biāo)記細(xì)胞有絲分裂的大概時(shí)間，根據(jù)這一特點(diǎn)，不同時(shí)間段電轉(zhuǎn)可使基因表達(dá)于不同類型的細(xì)胞[2]。利用子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)技術(shù)通過(guò)功能獲得與缺失同樣被用來(lái)研究某些基因功能[6,27]。通過(guò)對(duì)大腦生理發(fā)育過(guò)程中或病理過(guò)程中神經(jīng)元或其他細(xì)胞的錯(cuò)位表達(dá)分析，子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)技術(shù)也用于闡明基因功能的分子機(jī)制[8-10]。

雖然透過(guò)子宮壁可以看到胎鼠頭部，然而要精確的將DNA質(zhì)粒注入靶位置難度很大，尤其是胎腦的腹側(cè)區(qū)。在子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)技術(shù)的操作過(guò)程中，穿刺部位的選擇是關(guān)鍵。本篇文章將重點(diǎn)研究從不同穿刺位置穿刺對(duì)皮層發(fā)育的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

CD1(ICR)品系小鼠為本研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(北京，中國(guó))。該實(shí)驗(yàn)所涉動(dòng)物操作均符合當(dāng)?shù)貏?dòng)物管理協(xié)會(huì)的相關(guān)規(guī)定。

二、質(zhì)粒

質(zhì)粒含GFP/DsRed報(bào)告基因，該報(bào)告基因位于CAG啟動(dòng)子的下游(addgene 11150，addgene 11151)。該質(zhì)粒使用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒純化提取(德國(guó)Qiagen公司，12362)。

三、子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)技術(shù)

本研究子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)技術(shù)所用電轉(zhuǎn)儀為BTX， ECM830，參數(shù)為脈沖5個(gè)，電壓45 V，間隔時(shí)間1 s，每個(gè)脈沖持續(xù)時(shí)間為50 ms。整個(gè)操作在生物安全柜內(nèi)完成。CD1胎鼠使用異氟烷呼吸麻醉機(jī)(Matrx VIP3000)進(jìn)行氣體麻醉，氧流量為0.2～0.3 L/ min。將手術(shù)區(qū)域的毛發(fā)剃光，并準(zhǔn)備好手術(shù)操作所需無(wú)菌器械。手術(shù)區(qū)域使用碘酊和75%乙醇消毒3遍。當(dāng)準(zhǔn)備工作結(jié)束，將腹部切開3 cm切口以充分暴露手術(shù)視野。然后將胚胎取出，在選定好的位置進(jìn)行精確電擊。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)體溫，并使用加熱毯使其維持在37℃。轉(zhuǎn)染GFP/DsRed質(zhì)粒用于觀察電轉(zhuǎn)的效果。通過(guò)口控的注射管系統(tǒng)(美國(guó)Drummond Company,Inc)，使用拉制的玻璃微電極。將大概1 μl的DNA質(zhì)粒溶液(3 μg/μl)混合fast green溶液(0.1%，美國(guó)sigma,F7258)，注射入腦室。通過(guò)鑷形電極(BTX,45-0489)透過(guò)子宮外壁鉗住胚胎并給予適當(dāng)電擊。實(shí)驗(yàn)共分成4組：?jiǎn)渭冸姄?對(duì)照組)；從后囟旁開1 mm位置穿刺(A組)；從頭側(cè)沿前后軸刺入腦室(B組)；從前囟和后囟連線中點(diǎn)旁開1 mm位置穿刺(C組)。位于子宮口位置的胚胎并未注射質(zhì)粒。當(dāng)所有胚胎電擊完畢后，使腹腔內(nèi)充滿溫的無(wú)菌生理鹽水，縫合腹部肌肉與皮膚。將動(dòng)物移入干凈的鼠籠以促進(jìn)其恢復(fù)[11]。

四、DNA注射所需微量注射管的準(zhǔn)備.

使用P-97拉針儀拉制玻璃微電極，然后按“pull”按鈕以拉斷電極，通過(guò)磨針儀(WPI,48000)可將玻璃電極的尖端打磨至直徑60 μm。用標(biāo)記筆為玻璃電極每3 mm劃一刻度線予以標(biāo)記，3 mm可代表1 μl的質(zhì)粒溶液。將玻璃電極進(jìn)行121°C下30 min高壓滅菌。

五、免疫熒光染色

在胚胎13.5 d進(jìn)行電轉(zhuǎn)，在胚胎18 d使用苯巴比妥溶液對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，消毒后剖腹取胚胎。將電轉(zhuǎn)過(guò)的胎腦使用4%福爾馬林溶液(美國(guó)Sigma, 158127)4°C固定2 h至過(guò)夜不等。使用30%蔗糖溶液(美國(guó)Amresco,57-50-1)對(duì)組織脫水，脫水完畢，對(duì)組織進(jìn)行冰凍切片，厚度20μm。風(fēng)干1 h后置于﹣80°C冰箱保存。將切片用10%BSA配制的一抗作用過(guò)夜，次日，將切片用室溫0.01M PBS沖洗3次，每次5 min，后加入二抗，37°C作用1 h。使用含DAPI的封片劑進(jìn)行封片。

六、細(xì)胞計(jì)數(shù)與測(cè)量

使用共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica SP5Ⅱ)對(duì)所有冠狀切片進(jìn)行皮層板(CP)厚度與細(xì)胞數(shù)量的體視學(xué)分析，以計(jì)數(shù)SVZ區(qū)與CP區(qū)特定標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量以及測(cè)量該區(qū)的厚度與面積。通過(guò)計(jì)數(shù)每層陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞的的數(shù)量可以大概估算出SVZ區(qū)與CP區(qū)陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞的總數(shù)(大概有20～30張切片)[17]。每組包含小鼠的數(shù)量為3只。通過(guò)DAPI標(biāo)記細(xì)胞核并用Image-Pro Plus軟件描記整個(gè)皮層輪廓以獲得皮層面積及測(cè)量皮層厚度。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析由SPSS13.0軟件完成。使用單因素方差分析的方法對(duì)分化、增殖和凋亡實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行分析。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用Prism軟件生成統(tǒng)計(jì)圖。

結(jié)果

為了獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并降低胚胎死亡率，須注意多個(gè)細(xì)節(jié)。首先，微量注射管的準(zhǔn)備很重要。毛細(xì)管尖端的直徑、角度和平滑程度均為決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素。例如，若尖端太粗，易導(dǎo)致腦脊液的溢出(圖1 A-a’)；若尖端過(guò)細(xì)，則易堵塞；尖端無(wú)角度(圖1 A-b’)或無(wú)尖(圖1 A-c’)等粗糙的注射針尖更易給胚胎帶來(lái)不必要的損傷。對(duì)微量注射針的尖端進(jìn)行正確處理后更易于控制注射角度與位置。總之，理想的微量注射器的尖端應(yīng)滿足以下幾個(gè)方面的要求：直徑在40～60μm之間，角度大約15～30°(圖1 A-d’)，表面光滑銳利。正如表1所示，尖端不合適的微量注射器會(huì)導(dǎo)致高死亡率，然而對(duì)GFP的陽(yáng)性率(存活胚胎中GFP陽(yáng)性胚胎所占的比例)影響較小。本實(shí)驗(yàn)均采用理想針尖的微量注射器完成實(shí)驗(yàn)。為便于觀察并分析電轉(zhuǎn)效果，實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒均攜帶GFP/DsRed報(bào)告基因。將質(zhì)粒注射進(jìn)頭部一側(cè)腦室，然后利用鑷形電極透過(guò)子宮壁向胚胎頭部施加方波電脈沖，DNA質(zhì)粒即被導(dǎo)入毗鄰的神經(jīng)細(xì)胞，并向陽(yáng)極方向移動(dòng)(圖1 B)。

圖1 玻璃微量注射針的準(zhǔn)備與子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)不同方法穿刺后效果展示

基于不同的穿刺部位，分為四組：對(duì)照組，A組，B組和C組(圖1C)。當(dāng)沿著3種途徑將DNA質(zhì)粒注射入側(cè)腦室后，結(jié)果顯示無(wú)論哪種注射途徑均可成功表達(dá)GFP熒光蛋白(圖1D、1E)。如表2示，細(xì)胞死亡率和GFP陽(yáng)性率在各組之間并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 不同尖端對(duì)胚胎存活率及GFP陽(yáng)性率的影響

圖2 不同穿刺點(diǎn)對(duì)皮層厚度與皮層體積的影響

圖3 不同穿刺點(diǎn)對(duì)細(xì)胞分化的影響

本研究同樣觀察了不同穿刺點(diǎn)對(duì)細(xì)胞增值和遷移的影響(圖4)。Ki67蛋白是細(xì)胞增值的標(biāo)記物。各組之間細(xì)胞增值并無(wú)明顯差異(圖4 A、4B)。通過(guò)分析不同腦區(qū)GFP陽(yáng)性細(xì)胞的比例，發(fā)現(xiàn)三種不同穿刺點(diǎn)對(duì)VZ/SVZ區(qū)細(xì)胞的遷移的影響并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4 A、4C)。Caspase-3進(jìn)行標(biāo)記結(jié)果表明各組之間并未統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4 D、4E)。

綜上所述，三種不同的穿刺途徑對(duì)胚胎的死亡率、皮層厚度、細(xì)胞分化、細(xì)胞增值、細(xì)胞遷移及細(xì)胞凋亡并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

討論

神經(jīng)發(fā)生是早期大腦皮層發(fā)育過(guò)程中的重要事件，神經(jīng)干細(xì)胞增殖并經(jīng)歷均衡與不均衡性分裂不斷遷移分化，并不斷發(fā)生可塑性變化并與其他神經(jīng)元建立突觸聯(lián)系從而產(chǎn)生完整的神經(jīng)功能，發(fā)育成為正常的大腦皮層[12,13]。子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)技術(shù)需穿過(guò)皮層組織進(jìn)入腦室，穿刺本身對(duì)腦組織會(huì)造成或輕或重的損傷，尤其是神經(jīng)前體細(xì)胞池的側(cè)腦室(SVZ)部位，分布有大量神經(jīng)干細(xì)胞[13]。

表2 不同穿刺點(diǎn)胚胎存活率及GFP陽(yáng)性胚胎的比例

圖4 不同穿刺點(diǎn)對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響

為了研究是否不同的穿刺部位對(duì)皮層發(fā)育有不同的影響，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)并比較了三種穿刺途徑對(duì)皮層面積及厚度的影響。結(jié)果表明，各組間并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2)。

在神經(jīng)發(fā)生階段，背側(cè)端腦腦室區(qū)(VZ)前體細(xì)胞的子細(xì)胞向側(cè)腦室(SVZ)遷移，在到達(dá)皮層板(cortical plate，CP)之前，子細(xì)胞會(huì)再次分裂成為中間神經(jīng)前體細(xì)胞(INP)[14,15]。VZ區(qū)分裂后皮層神經(jīng)元通過(guò)不對(duì)稱分裂依次產(chǎn)生VZ區(qū)前體細(xì)胞，并再次產(chǎn)生INP，不同區(qū)的細(xì)胞標(biāo)記物不同，分別為Pax6(VZ區(qū)),Tbr2(SVZ區(qū)),Tbr1(layer VI區(qū)皮層神經(jīng)元、layer V和VI區(qū)皮層神經(jīng)元)[16]。為了檢測(cè)是否不同穿刺部位影響神經(jīng)干細(xì)胞的分化，分別檢測(cè)了Ctip2,Tbr1,Tbr2和Pax6的表達(dá)情況(圖3 A、B)。結(jié)果表明，各組表達(dá)Ctip2,Tbr1,Tbr2和Pax6的情況并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

作為一種在體研究基因功能的方法，子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。通過(guò)該技術(shù)，可以精確的對(duì)側(cè)腦室的神經(jīng)前體細(xì)胞進(jìn)行基因過(guò)表達(dá)或敲低，以觀察轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)細(xì)胞增殖、遷移情況以及形態(tài)變化情況的影響[18,19,20]。本研究擬比較到達(dá)側(cè)腦室三種不同穿刺途徑對(duì)皮層發(fā)育的影響，從而獲得最佳的穿刺點(diǎn)。在同一發(fā)育階段，電轉(zhuǎn)后熒光蛋白表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞在皮層的分布符合神經(jīng)元inside-out的遷移分布模式[26,27]。以往的研究已經(jīng)表明Tbr2和Tbr1是同屬于T區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子。在胚胎皮層發(fā)育過(guò)程中，Tbr2的mRNA首先表達(dá)于預(yù)定皮層板(preplate, PP)，接下來(lái)會(huì)表達(dá)在增殖比較旺盛的區(qū)域，比如皮層的室管膜下區(qū)(SVZ區(qū))以及基底室管膜區(qū)(VZ區(qū))[21,16]。然而，Tbr1主要表達(dá)于即將分化的皮層前體細(xì)胞，即PP區(qū)與皮層6區(qū)(layer 6)的新生神經(jīng)元內(nèi)[22,23]。此外，Pax6主要表達(dá)于VZ區(qū)，Ctip2高表達(dá)于皮層5區(qū)(layer 5)[24,25]。上述蛋白作為標(biāo)記物可用于指示神經(jīng)前體細(xì)胞分化的不同狀態(tài)。本研究對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同穿刺點(diǎn)之間并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明無(wú)論從后囟旁開1 mm穿刺，從頭側(cè)沿頭-尾軸穿刺，還是從前后囟連線中點(diǎn)旁開1 mm穿刺，雖然均有輕微損傷，然而，其對(duì)細(xì)胞遷移和分化的影響均無(wú)明顯差異。結(jié)果同樣表明，不同穿刺點(diǎn)對(duì)皮層厚度與面積亦無(wú)明顯影響?？傊?，我們可以采用以上任意一種穿刺點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不用擔(dān)心干擾最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中，多種因素會(huì)對(duì)其造成嚴(yán)重影響，因此，在研究中采用一些有利的必要手段是必需的。在科學(xué)實(shí)驗(yàn)中，人工干預(yù)是一個(gè)重要且難以避免的因素，有時(shí)對(duì)研究本身會(huì)造成致命的影響。除外本文以上已經(jīng)介紹的一些影響因素，對(duì)子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)技術(shù)有影響的因素尚有很多，例如，子宮口附近的胚胎應(yīng)避免操作，以免流產(chǎn)；如果每只胚胎均從頭側(cè)沿頭-尾軸進(jìn)行穿刺，最好固定一種穿刺點(diǎn)，否則需要頻繁調(diào)整胚胎位置，易對(duì)胚胎造成不必要的損傷。除此之外，質(zhì)粒準(zhǔn)備過(guò)程需特別謹(jǐn)慎，注意祛除內(nèi)毒素，否則易增加胚胎死亡率。整個(gè)手術(shù)操作時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，盡量在20～30 min內(nèi)完成，因?yàn)槿绻^(guò)長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中，易導(dǎo)致胚胎脫水，增加死亡率。此外，鑷形電極的鉗夾位置，質(zhì)粒溶液的濃度以及其它因素均會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)造成很大影響?？茖W(xué)實(shí)驗(yàn)應(yīng)力爭(zhēng)以最小的實(shí)驗(yàn)損傷刺激獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

[1]Venken KJ,Bellen HJ.Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster[J].Development,2007,134(20)∶3571-3584.

[2]Langevin L M,Mattar P,Scardigli R,et al.Validating in utero electroporation for the rapid analysis of gene regulatory elements in the murine telencephalon[J].Dev Dyn,2007,236(5)∶1273-1286.

[3]Yang N S,Sun W H.Gene gun and other non-viral approaches for cancer gene therapy[J].Nat Med,1995,1(5)∶481-483.

[4]Shukla V K,Doyon Y,Miller J C,et al.Precise genome modification in the crop species Zea mays using zinc-finger nucleases [J].Nature,2009,459(7245)∶437-441.

[5]Tabata H,Nakajima K.Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation∶visualization of neuronal migration in the developing cortex[J].Neuroscience,2001,103(4)∶865-872.

[6]Fukuchi-Shimogori T,Grove E A.Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8[J].Science,2001,294(5544)∶1071-1074.

[7]Saito T,Nakatsuji N.Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation[J].Dev Biol,2001, 240(1)∶237-246.

[8]Kawasaki H,Toda T,Tanno K.In vivo genetic manipulation of cortical progenitors in gyrencephalic carnivores using in utero electroporation[J].Biol Open,2013,2(1)∶95-100.

[9]Kita Y,Kawakami K,Takahashi Y,et al.Development of cerebellar neurons and glias revealed by in utero electroporation∶Golgi-like labeling of cerebellar neurons and glias[J].PLoS One,2013,8(7)∶e70091.

[10]Taniguchi Y,Young-Pearse T,Sawa A,et al.In utero electroporation as a tool for genetic manipulation in vivo to study psychiatric disorders∶from genes to circuits and behaviors[J].Neuroscientist,2012,18(2)∶169-179.

[11]Gal J S,Morozov Y M,Ayoub A E,et al.Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones[J].J Neurosci,2006,26(3)∶1045-1056.

[12]Rash B G,Lim H D,Breunig J J,et al.FGF signaling expands embryonic cortical surface area by regulating Notch-dependent neurogenesis[J].J Neurosci,2011,31(43)∶15604-15617

[13]Takahashi T,Nowakowski R S,Caviness V J.The leaving or Q fraction of the murine cerebral proliferative epithelium∶a general model of neocortical neuronogenesis[J].J Neurosci,1996,16 (19)∶6183-6196.

[14]Noctor S C,Martinez-Cerdeno V,Ivic L,et al.Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases[J].Nat Neurosci,2004,7(2)∶136-144. [15]Haubensak W,Attardo A,Denk W,et al.Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon∶a major site of neurogenesis[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2004,101(9)∶3196-3201.

[16]Englund C,Fink A,Lau C,et al.Pax6,Tbr2,and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia,intermediate progenitor cells,and postmitotic neurons in developing neocortex[J].J Neurosci,2005,25(1)∶247-251.

[17]Kee N,Teixeira C M,Wang A H,et al.Preferential incorporation of adult-generated granule cells into spatial memory networks in the dentate gyrus[J].Nat Neurosci,2007,10(3)∶355-362.

[18]Yeh M L,Gonda Y,Mommersteeg M T,et al.Robo1 modulates proliferation and neurogenesis in the developing neocortex[J].J Neurosci,2014,34(16)∶5717-5731.

[19]Furukawa T,Yamada J,Akita T,et al.Roles of taurine-mediated tonic GABAAreceptor activation in the radial migration of neu-rons in the fetal mouse cerebral cortex[J].Front Cell Neurosci, 2014,8∶88.

[20]Chi Z,Zhang J,Tokunaga A,et al.Botch promotes neurogenesis by antagonizing Notch[J].Dev Cell,2012,22(4)∶707-720.

[21]Bulfone A,Martinez S,Marigo V,et al.Expression pattern of the Tbr2(Eomesodermin)gene during mouse and chick brain development[J].Mech Dev,1999,84(1-2)∶133-138.

[22]Bulfone A,Smiga S M,Shimamura K,et al.T-brain-1∶a homolog of Brachyury whose expression defines molecularly distinct domains within the cerebral cortex[J].Neuron,1995,15 (1)∶63-78.

[23]Hevner R F,Shi L,Justice N,et al.Tbr1 regulates differentiation of the preplate and layer 6[J].Neuron,2001,29 (2)∶353-366.

[24]Chen B,Schaevitz L R,Mcconnell S K.Fezl regulates the differentiation and axon targeting of layer 5 subcortical projection neurons in cerebral cortex[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(47)∶17184-17189.

[25]Lian G,Lu J,Hu J,et al.Filamin a regulates neural progenitor proliferation and cortical size through Wee1-dependent Cdk1 phosphorylation[J].J Neurosci,2012,32(22)∶7672-7684.

[26]Angevine J J,Sidman R L.Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse [J].Nature,1961,192∶766-768.

[27]Berry M,Rogers A W.The migration of neuroblasts in the developing cerebral cortex[J].JAnat,1965,99(Pt 4)∶691-709.

Influence of three puncture sites of in utero electroporation on embryonic cortex development

Z hang Peng,Wu Cuiying,Tao Qingxia,Niu Lijun,Chen Wenjin,L iu Ning,Xu Ruxiang.
A ffiliated Bayi Brain Hospital,The Military General Hospital of Beijing P LA,Beijin g 100700,China

Xu Ruxiang,Email:zjxuruxiang@163.com

ObjectiveTo compare the influence of three different puncture sites of in utero electroporation on the death rate of mice embryos,the thickness and the area of cortex,cell differentiation,cell proliferation,cell migration and cell apoptosis.MethodsIt groups on the bases of common puncture sites as follows∶1.electric shock only(control);2.injection near the posterior fontanel,at about one millimeter(here,group A);3.injection along the antero-posterior axis into the cephalic ventricle(group B);and 4.injection near the midpoint between the anterior fontanel and posterior fontanel,at about three millimeters(group C).We compared the four groups using littermate mice,and repeated the experiment with 5 pregnant mice.To detect whether different injection positions affect cell differentiation,cell proliferation,cell migration and cell apoptosis,we stained cells with anti-Tbr1,anti-Tbr2,anti-Pax6 anti-Ctip2,anti-Caspase-3 and anti-Ki67.In differentiation, proliferation,and apoptosis assays,the cell number was analyzed with SPSS 13.0 software,using one way ANOVA.ResultsWe found no statistical significant differences between the three puncture methods in the death rate of embryos,the thickness and the area of cortex,cell differentiation,cell proliferation,cell migration and cell apoptosis(P＞0.05).ConclusionThree puncture sites used for in utero electroporation show no significantly different negative impacts during gene transfer into the embryonic mouse brain.

Gene transfer techniques;Puncture;Cell differentiation;Cell proliferation;

2015-06-09)

(本文編輯：楊藝)

DOI∶10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.04.008

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：81401031)

北京軍區(qū)總醫(yī)院附屬八一腦科醫(yī)院

徐如祥，Email∶zjxuruxiang@163.com

張鵬,吳翠瑩,陶慶霞,等.不同穿刺點(diǎn)行子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)對(duì)胚胎皮層發(fā)育影響的實(shí)驗(yàn)研究[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志,2015,1(4)∶219-226.