缺氧預處理對顱腦外傷大鼠皮層TrxR2、CHOP表達及神經元細胞超微結構改變的影響

劉光杰 劉家傳 王金標 楊艷艷 張星 王春琳 湯宏 徐燊

缺氧預處理對顱腦外傷大鼠皮層TrxR2、CHOP表達及神經元細胞超微結構改變的影響

劉光杰 劉家傳 王金標 楊艷艷 張星 王春琳 湯宏 徐燊

目的探討缺氧預處理對顱腦外傷大鼠皮層TrxR2、CHOP表達及神經元細胞超微結構改變的影響。方法48只SD大鼠隨機分成對照(Con)組、缺氧預處理(HPC)組、單純外傷(TBI)組和缺氧預處理顱腦外傷(HPCT)組。采用改良的Feeney’s自由落體裝置制作顱腦損傷大鼠模型，預先在低壓氧艙內連續(xù)處理3 d(-50 kPa、3 h/d)制作缺氧預處理模型。采用HE染色法和新鮮標本制作超薄切片，分別在光鏡和電鏡下觀察各組大鼠皮層腦組織的大體結構和神經元細胞超微結構改變。qRT-PCR和Western blotting法檢測挫傷區(qū)周圍皮層TrxR2、CHOP mRNA和蛋白的表達變化。結果Con組和HPC組病理改變無明顯差異，HPCT組較TBI組大鼠病理改變輕，神經元細胞超微結構受損明顯減輕。HPCT與TBI組比較，TrxR2 mRNA和蛋白表達顯著上調，CHOP mRNA和蛋白表達顯著下調，差異均具有統計學意義(均P＜0.05)；Con與HPC組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。結論缺氧預處理可明顯減輕顱腦外傷大鼠皮層神經元細胞形態(tài)學改變，這可能與上調TrxR2、下調CHOP的表達有密切關系，從而對神經元細胞起保護作用。

顱腦外傷；缺氧預處理；TrxR2；CHOP；超微結構

顱腦外傷(traumatic brain injury，TBI)是腦組織遭受直接或間接打擊后伴隨一系列復雜變化的動態(tài)過程[1]。越來越多的證據表明缺氧預處理(hypoxic preconditioning，HPC)對機體有明確的保護作用[2]，然而缺氧預處理對顱腦外傷的保護作用，前期實驗雖已做了大量工作，但其病理改變及對神經元細胞的作用機制仍需進一步闡述。線粒體硫氧還蛋白還原酶2(TrxR2)是線粒體中重要酶類，具有抗氧化應激能力，在顱腦外傷中對線粒體起重要保護作用[3]。生長停滯DNA損害可誘導基因153(C/ EBP homologousprotein/growth arrest and DNA damage inducible gene153，CHOP/GADD153)是內質網應激(ERS)的經典標志物，內質網受損時介導相關凋亡的發(fā)生，從而影響內質網功能[4]。本實驗通過建立缺氧預處理與顱腦外傷大鼠模型，通過光鏡和電鏡下觀察腦組織病理改變，并檢測TrxR2和CHOP mRNA和蛋白的表達變化，探討缺氧預處理對顱腦外傷后大鼠皮層神經元細胞的保護作用。

材料與方法

一、實驗器材和試劑

兔抗鼠TrxR2抗體(美國Santa Cruz公司)，兔抗鼠CHOP抗體(美國Santa Cruz公司)，Feeney’s顱腦損傷打擊器(淮北正華生物科技公司)，低壓氧倉(上海減壓器廠)，WDZ-2000微型磨鉆(上海晶杰醫(yī)療器械有限公司)，JEM-1230型透視電鏡(日本產)，LKBNOVA型切片機(瑞典產)，戊二醛(美國SPI公司)，環(huán)氧樹脂(美國SPI公司)，醋酸雙氧鈾(美國SPI公司)，檸檬酸鉛(北京達昱科儀公司)，環(huán)氧丙烷(國藥集團化學試劑有限公司)，逆轉錄試劑盒(美國Fermentas公司)，熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

二、實驗動物與分組

48只SD雄性大鼠，體質量180～230 g，由安徽醫(yī)科大學動物實驗中心提供，隨機分為對照(Con)組，缺氧預處理(HPC)組，單純外傷(TBI)組和缺氧預處理顱腦外傷(HPCT)組，共4組，每組12只，TBI和HPCT組大鼠于傷后24 h處死。

三、動物模型制作和取材

缺氧預處理模型制作：將HPC組和HPCT組大鼠置于密封氧倉內，適應后連接真空泵，勻速減壓至-50.47 kPa(設定標準大氣壓為0 Pa，模擬5 500 m高度)，維持該壓力恒定訓練3 h，然后緩慢恢復正常，出倉。采用同樣方法連續(xù)訓練3 d，其余組不進行此處理。顱腦外傷模型制作經腹腔內注射10%水合氯醛對大鼠進行麻醉，麻醉效果滿意后，固定于顱腦外傷打擊器，剪毛，消毒，延中線矢狀位切開頭皮，暴露左頂骨骨膜，剝離骨膜，暴露顱骨，用微型磨鉆于前正中線左側旁開3 mm，前囟門后3 mm處鉆一骨窗(直徑5 mm)，保持硬腦膜完整，將50 g砝碼固定于25 cm高處自由落體打擊骨窗，打擊完畢后，隨即做頭皮清創(chuàng)縫合術。僅對TBI和HPCT組進行打擊。取挫傷區(qū)周圍新鮮皮質置于-80℃液氮罐中保存留做qRT-PCR和Western blotting檢測。

四、實驗方法

1.HE染色：造模完成后各組分別取3只大鼠，經麻醉，心臟灌注后，斷頭取腦，然后經浸蠟包埋等步驟處理后，制備成5 μm石蠟切片，常規(guī)行蘇木素-伊紅(HE)染色，操作嚴格按照染色方法步驟進行，光鏡下觀察并攝片。

2.神經元細胞電鏡觀察：造模完成后各組分別取6只大鼠，經麻醉，心臟灌注后，斷頭取腦，2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液固定，取大小約1 mm3腦組織置于1 ml離心管內，其余標本置于液氮罐中保存，離心(2 000 r/min)10 min，固定于2.5%戊二醛中(4℃) 4～6h，隨后固定于1%鋨酸1h，30%、50%乙醇脫水各15 min，隨后置于70%醋酸鈾飽和液中浸泡6～12 h；80%、95%乙醇脫水各15 min，無水乙醇40 min，2次；濃度分別為1:1和1:2的環(huán)氧丙烷浸泡1 h和2 h；再浸泡環(huán)氧樹脂中2 h，用環(huán)氧樹脂包埋并置于45℃烤箱中12 h，增加烤箱溫度至65℃繼續(xù)烘烤48 h，取出包埋好的組織進行超薄切片(片厚70 nm)，將切好的薄片置于醋酸鈾飽和水溶液中30 min，進行雙蒸水洗15 min/次，3次；枸櫞酸鉛液中浸泡15 min，取出繼續(xù)雙蒸水洗15 min/次，3次；用JEM-1230型透射電鏡攝片觀察。

3.qRT-PCR檢測TrxR2、CHOP mRNA表達：取挫傷區(qū)周圍皮層腦組織100 mg，提取總mRNA，紫外分光光度計OD260 nm定量完成后，取8 μl按逆轉錄試劑盒操作進行逆轉錄，取2 μl的cDNA產物進行PCR擴增，分別加入10 μl含Taq酶及4種dNTP混合物，0.4 μl TrxR2引物序列上游：5’-GGCTTCCTCACTGGTATTGG-3’下游：5’-AGTTGGTTAGTCGGGAGTTTT-3’(或0.4 μl CHOP引物序列上游：5’-AGCAGAGGTCACAAGCACCT-3’，下游：5’-CTTCTCCTTCATGCGCTGTT-3’)；0.4μl β-actin引物序列上游：5’-GGGCTCTCTGCTCCTCCCTGT-3’，下游：5’-ACGGCCAAATCCGTTCACACC-3’，7.2 μl雙蒸水共20 μl，充分混勻后置于PCR儀中，先95℃10 min預變性，然后依次經95℃15 s、60℃60 s、72℃60 s，共循環(huán)40次，獲取TrxR2、CHOP和β-actin的Ct值，以β-actin為內參，算出TrxR2、CHOP mRNA的相對表達量，以2-△△Ct為指標。

4.Western blotting法檢測TrxR2、CHOP蛋白表達：取挫傷區(qū)周圍皮層100 mg，嚴格按Western blotting實驗步驟及抗體說明書進行操作，經離心，留取上清，提取蛋白，SDS-PAGE電泳、轉膜，滴加一、二抗免疫反應，化學發(fā)光、顯影、定影，最后拍照。采用Quantity one4.6.2軟件分析各條帶積分灰度值，分別與β-actin蛋白產物條帶灰度值之比，表示目的蛋白TrxR2、CHOP的相對表達量。

五、統計學分析

采用SPPS19.0軟件進行統計處理，TrxR2、 CHOP mRNA和蛋白的表達以均數±標準差(x±s)表示，多組間比較用單因素方差分析檢驗，兩獨立樣本比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

一、HE染色結果

光鏡下觀察，Con組與HPC組腦組織無明顯改變；HPCT組較TBI組腦組織損傷明顯減輕(圖1)。

二、神經元細胞電鏡下改變

電鏡下觀察發(fā)現Con組：神經元細胞形態(tài)、結構正常，細胞膜完整，尼氏體存在，線粒體結構完整、粗面內質網豐富；HPC組：神經元細胞形態(tài)、結構與Con組基本相似；TBI組：神經元細胞形態(tài)、結構異常，尼氏體消失，細胞膜結構不完整，基質內大量空泡變性，微細結構紊亂，線粒體嚴重受損、腫脹，粗面內質網受損嚴重；HPCT組：神經元細胞損傷較TBI組輕，尼氏體可見，細胞輪廓存在，細胞膜基本完整，基質內少量空泡變性，微細結構較完整，線粒體損傷輕、稍腫脹，粗面內質網膜腫脹、擴張(圖2)。

三、qRT-PCR檢測TrxR2、CHOP mRNA的結果

qRT-PCR結果顯示TrxR2、CHOP mRNA表達，Con組與HPC組比較差異無統計學意義(P＞0.05)；TBI與Con組，HPCT與HPC組比較，TrxR2 mRNA表達顯著上調，CHOP mRNA表達明顯下調，差異均有統計學意義(P＜0.05)；其中，HPCT與TBI組比較，TrxR2 mRNA表達顯著上調，CHOP mRNA表達明顯下調，差異有統計學意義(P＜0.05)(表1；圖3)。

四、TrxR2、CHOP蛋白的表達變化

圖1 各處理組大鼠HE染色(×400)

圖2 各組大鼠挫傷區(qū)周圍皮層神經元細胞電鏡觀察(×1萬倍)

TrxR2、CHOP蛋白的表達結果，Con組與HPC組比差異無統計學意義(P＞0.05)；TBI與Con組，HPCT與HPC組比，差異有統計學意義(P＜0.05)；HPCT與TBI組比，TrxR2蛋白表達上調，CHOP蛋白表達下調，差異有統計學意義(P＜0.05)(圖4)。

圖3 qRT-PCR檢測結果

圖4 TrxR2、CHOP蛋白電泳條帶

討論

顱腦外傷后腦組織損傷是一個復雜過程，其復雜原因一方面由力生物學作用引起，另一方面則有繼發(fā)性應激反應引起[1]，涉及炎性應激、氧化應激、內質網應激等。外傷后引起的神經元細胞微觀結構的改變以及繼發(fā)的細胞內應激反應，如氧化應激、內質網應激，嚴重影響細胞力傳導、信號傳導功能，導致神經元細胞微環(huán)境改變[2]。及時尋找一種能有效降低外傷后腦組織直接和間接應激損傷的方法，對于恢復神經元細胞功能具有重要意義。缺氧預處理是指預先予以短暫的(3 h/d)、重復性(連續(xù)3 d)的缺氧訓練，可顯著增強腦組織對隨后發(fā)生的缺氧、缺血等的耐受力[5]。盡管諸多研究已證實缺氧預處理的神經保護作用，但其對神經元細胞超微結構改變的影響仍需更多證據。

神經元細胞超微結構穩(wěn)定是維持細胞正常生理功能、信號轉導、離子平衡等的重要前提[1]。其中最重要的是線粒體、內質網的穩(wěn)定。線粒體是細胞氧化呼吸鏈的場所，TrxR2是線粒體中重要酶類，參與線粒體的氧化應激，提高缺氧等狀態(tài)下線粒體提供ATP能力[3,6]。內質網是細胞內蛋白質加工、合成、鈣離子儲存的重要場所，當缺血缺氧、能量匱乏等條件下內質網正常功能被打破，誘發(fā)內質網應激(ERS)反應，CHOP是ERS經典標志物之一，在內質網功能嚴重受損時表達上調[4,7]。

表1 各組大鼠皮層TrxR2、CHOP mRNA和蛋白表達(n=6

表1 各組大鼠皮層TrxR2、CHOP mRNA和蛋白表達(n=6

注：aP＜0.05：TBI與Con組，HPCT與HPC組比較；bP＜0.05：與TBI組比較。

分組Con組HPC組TBI組HPCT組F值P值鼠數(例) 12 12 12 12 TrxR2CHOP mRNA 1.01±0.01 1.02±0.01 3.92±0.12a4.03±0.14ab2136.000 0.000蛋白0.19±0.00 0.19±0.00 0.73±0.01a0.78±0.03ab2129.000 0.000 mRNA 0.42±0.08 0.38±0.08 1.02±0.01a0.95±0.02ab220.500 0.000蛋白0.35±0.01 0.35±0.01 0.67±0.01a0.66±0.01ab2209.000 0.000

本實驗結果顯示：通過HE染色和電鏡觀察發(fā)現，HPC與Con組腦組織形態(tài)結構均無異常。TBI組與HPCT組，光鏡下腦組織形態(tài)結構紊亂，大量炎性細胞浸潤；電鏡下神經元細胞微細結構紊亂，線粒體、內質網等細胞器受損嚴重；然而，HPCT組與TBI組比較，腦組織受損較輕，神經元細胞超微結構具有較好的完整性。這與Liu等[8]缺氧預處理可保護神經細胞微觀結構相一致。傷后24 h挫傷區(qū)周圍皮層TrxR2、CHOP mRNA和蛋白表達，Con與HPC組無明顯差異，HPCT組較TBI組TrxR2 mRNA和蛋白表達顯著上調，CHOP mRNA和蛋白表達明顯下調，提示缺氧預處理可顯著誘導顱腦外傷大鼠TrxR2 mRNA和蛋白的表達，增強線粒體抗氧化應激能力，降低線粒體損傷；同時，下調CHOP mRNA和蛋白的表達，降低內質網應激性損傷。提示缺氧預處理可顯著增強外傷后神經元細胞的神經保護作用，這與Galle等[9]的實驗研究，缺氧預處理對缺氧缺血性腦損傷具有神經保護作用一致。然而，Liamina等[10]還提出，機體對缺氧、缺血的適應若更好的服務于臨床，須提供更多有關細胞內部耐受機制的證據。

綜上所述，缺氧預處理可顯著減輕顱腦外傷大鼠病理損傷，較好的保持線粒體、內質網細胞器超微結構的完整性，這可能與上調TrxR2，同時下調CHOP的表達密切相關，降低線粒體、內質網細胞器損傷，促進神經元細胞功能恢復。然而對于功能較難恢復的細胞，最終將走向凋亡或死亡。缺氧預處理對這部分細胞的作用如何，也將在后期實驗中進一步探討。

[1]Hemphill MA,Dauth S,Yu CJ,et al.Traumatic Brain Injury and the Neuronal Microenvironment:A Potential Role for Neuropathological Mechanotransduction[J].Neuron,2015,85 (6):1177-1192.

[2]Yokobori S,Mazzeo AT,Hosein K,et al.Preconditioning for traumatic brain injury[J].Transl Stroke Res,2013,4(1):25-39.

[3]疏龍飛,劉家傳,王金標,等.硫氧還蛋白還原酶TrxR2在顱腦損傷大鼠皮質的表達變化[J].中國微侵襲神經外科雜志, 2014,19(11):517-519.

[4]Oyadomari S,Mori M.Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress[J].Cell Death and Differentiation,2004,11:381-389.

[5]武孝剛,劉家傳,楊艷艷,等.缺氧預處理對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠缺氧誘導因子-1α、葡萄糖轉運體3型及神經元核蛋白表達的影響[J].中華神經創(chuàng)傷外科電子雜志,2015,4(1):11-15.

[6]Meyer Y,Buchanan BB,Vignols F,et al.Thioredoxins and glutare-doxins:unifying elements in redox biology[J].Annual Review of Genetics,2009,43:335-367.

[7]Seiji Tajiria,Shigetoshi Yano,Motohiro Morioka,et al.CHOP is involved in neuronal apoptosis induced by neurotrophic factor deprivation[J].FEBS Letters,2006,580:3462-3468.

[8]Liu Y,Sun Z,Sun S,et al.Effects of hypoxic preconditioning on synaptic ultrastructure in mice[J].Synapse,2015,69(1): 7-14.

[9]Galle A,N.M.Jones.The neuroprotective actions of hypoxic preconditioning and postconditioning in a neonatal rat model of hypoxic-ischemic brain injury[J].brain Res,2013,1498:1-8.

[10]Liamina NP,Karpova ES,Kotel'nikova EV,et al.Adaptation to hypoxia and ischemic preconditioning:from basic research to clinical practice[J].Klin Med,2014,92(2):23-29.

Effects of hypoxic preconditioning on cortical expression of TrxR2 and CHOP of rats with craniocerebral injury and ultramicrostructural changes of neurons

Liu Guangjie, Liu Jiachuan,Wang Jinbiao,Yang Yanyan,Zhang Xing,Wang Chunlin,Tang Hong,Xu shen.
Department of Neurosurgery,the No.105 Hospital of PLA,Hefei 230031,China

Liu Jiachuan,Email:ljc571017@sina.com

ObjectiveTo investigate the effects of hypoxic preconditioning on the expression of TrxR2、CHOP and the ultra-structure of the neuronal cells of rats suffered traumatic brain injury.MethodsForty eight Sprague Dawley rats were randomly divided into control group(Con),hypoxic preconditioning group(HPC),traumatic brain injury group(TBI)and hypoxic preconditioning traumatic brain injury group(HPCT).The traumatic brain injury model of rats were made by the Feeney’s improved equipment and hypoxic preconditioning model were made by Hypobaric chamber for successive 3 days(-50 kPa、3 h/d).Staining HE and making ultra-thin slicing by fresh specimen to observe the potential change of general structure and ultra-structure of rats’brain tissue of each group respectively under light microscope and electron microscope.Expressions of TrxR2、CHOP mRNA and proteins were detected in the brain cortex around the contusion area by qRT-PCR and Western blotting.ResultsThe pathologic change has no difference between Con gourp and HPC group.HPCT group has a lighter pathologic change than the TBI group.The expressions of TrxR2 mRNA and protein was significantly higher in the brain cortex in the HPCT group than the TBI group,the difference between the two group was significant(P＜0.05),the expressions of CHOP mRNA and protein was significantlylower in the brain cortex in the HPCT group than the TBI group,the difference between the two group was significant(P＜0.05),while the difference between the Con group and the HPC group was not significant(P＞0.05).ConclusionHypoxia preconditioning can obviously reduce the craniocerebral trauma rats cortex neuron cell morphology change,which has a close relationship with the upregulated expression of TrxR2 and the downregulated expression of CHOP,in order to protection of neurons.

Traumatic brain injury;Hypoxic preconditioning;TrxR2;CHOP; Ultra-structure

2015-04-25)
(本文編輯：楊藝)

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2015.03.010

全軍醫(yī)學科技“十二五”科研面上項目(編號：CWS11J262)；2009年度南京軍區(qū)醫(yī)學科技創(chuàng)新重點課題(編號：09Z009)

230031合肥，解放軍第105醫(yī)院神經外科

劉家傳，Email：ljc571017@sina.com

劉光杰,劉家傳,王金標,等.缺氧預處理對顱腦外傷大鼠皮層TrxR2、CHOP表達及神經元細胞超微結構改變的影響[J/CD].中華神經創(chuàng)傷外科電子雜志,2015,1(3):164-168.