鬼針草總黃酮對心肌缺血再灌注大鼠的保護(hù)作用

馬瑜紅 李 玲 王 斌 夏西超

(南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 南陽 473003)

鬼針草總黃酮對心肌缺血再灌注大鼠的保護(hù)作用

馬瑜紅 李 玲 王 斌 夏西超

(南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 南陽 473003)

目的 研究鬼針草總黃酮(TFB)對缺血再灌注大鼠心肌的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。方法 將雄性Wistar大鼠50只隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組(SH組)、心肌缺血再灌注模型組(I/R組)、TFB低、中、高劑量組(TFBL組、TFBM組、TFBH組)，每組10只。TFB各組分別給予鬼針草總黃酮灌胃，劑量分別為40、80、160 mg/kg，1次/d，連續(xù)給藥14 d；除SH組外，其他各組結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，使心肌缺血30 min，再灌注120 min。ELISA法測定血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-8含量，測定心肌組織丙二醛(MDA)含量和過氧化物酶(SOD)活力，氯化三苯基四氮唑紅(TTC)染色法測定心肌梗死面積，透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果 與I/R組相比，TFB各組均能降低心肌組織MDA含量并提高SOD活力，減小心肌梗死面積，改善心肌超微結(jié)構(gòu)；TFBM、TFBH組能有效降低血清中LDH、CK、TNF-α和IL-8的釋放量。結(jié)論 TFB預(yù)處理可減輕缺血再灌注心肌損傷，可能與其抗炎和抗自由基作用有關(guān)。

鬼針草總黃酮；缺血再灌注；抗氧化；抗炎；超微結(jié)構(gòu)

急性心肌梗死后采用溶栓治療、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(PCI)或冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG)等手段對缺血心肌實(shí)施再灌注是主要治療手段，而缺血后再灌注，會(huì)使心肌細(xì)胞功能進(jìn)一步降低，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡甚至死亡，造成心肌缺血再灌注損傷(MIRI)。防治MIRI以提高急性心肌缺血再灌注療法的臨床療效，成為目前研究的熱點(diǎn)。中藥及其有效成分在防治MIRI方面發(fā)揮著越來越重要的作用〔1〕。鬼針草系菊科植物，全國大部分地區(qū)均有分布。其苦，平，無毒，有清熱解毒、祛風(fēng)、活血之功效〔2〕。鬼針草能有效治療高血壓、高脂血癥、糖尿病，并能抑制血小板聚集、抗血栓生成，并具有良好的抗氧化作用〔2～7〕。鬼針草總黃酮(TFB)是鬼針草中的主要有效成分之一，在抗肝纖維化中的作用多有報(bào)道〔8〕。但國內(nèi)外未見其對缺血再灌注心肌的保護(hù)作用及其機(jī)制的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究TFB對缺血再灌注大鼠心肌的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 鬼針草采自南陽市王村野外，經(jīng)我校藥用植物學(xué)袁國卿副教授鑒定，為三葉鬼針草，全草入藥。鬼針草總黃酮由南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校中藥分析實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑 丙二醛(MDA)、過氧化物酶(SOD)測試試劑盒均購自南京建成生物公司；大鼠乳酸脫氫酶(LDH)、大鼠肌酸激酶(CK)定量檢測試劑盒(ELISA)均購自美國Rapidbiol公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-8試劑盒(ELISA)均購自美國Genzyme公司。

1.3 儀器 7020全自動(dòng)生化分析儀(HITACHI公司，日本)； DMR+Q550型病理圖像分析系統(tǒng)(Leica公司，德國)；TU-1901紫外分光光度計(jì)(北京普析通用有限公司，北京)；精密電子天平(CP323P，德國)；多功能酶標(biāo)儀(Becton Dick-inson公司，美國)；DH-1型小動(dòng)物呼吸機(jī)(浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠，中國)。

1.4 動(dòng)物處理 健康雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量190～230 g，SPF級，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司質(zhì)檢中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，合格證號(hào)scxk魯2008-0002。在恒溫(19～25℃)、相對濕度40%～60%環(huán)境中，以普通飼料分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。隨機(jī)分成假手術(shù)組(SH組)、心肌缺血再灌注組(I/R組)、TFB低、中、高劑量組(TFBL、TFBM和TFBH組)5組各10只。SH組、I/R組每日灌胃給予等容量生理鹽水，給藥組分別每日灌胃給予TFB 40、80、160 mg/kg體質(zhì)量。每周稱重1次，調(diào)整給藥劑量。連續(xù)給藥14 d。第15天，用10%水合氯醛麻醉(3 ml/kg體重)大鼠后仰位固定于解剖臺(tái)，分離氣管并插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)(DH-1型)輔助呼吸(調(diào)整通氣量為1 L/min，EXP/INSP為1∶2，呼吸頻率70～80 次/min，潮氣量為 8～12 ml)。于胸骨左側(cè)第四肋間打開胸腔暴露心臟，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支30 min，以心肌顏色變暗為心肌缺血標(biāo)志。松開結(jié)扎線行心肌再灌注120 min。假手術(shù)組僅在冠狀動(dòng)脈前降支穿線，但不結(jié)扎。

1.5 透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu) 每組選2只大鼠取缺血區(qū)心肌組織，經(jīng)2.5%戊二醛溶液中固定、冷藏后送紹興文理學(xué)院，用透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)。

1.6 血清LDH、CK、TNF-α和IL-8活性測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)于大鼠右頸內(nèi)靜脈采血2 ml，靜置15 min，以3 000 r/min高速冷凍離心5 min，取上清液保存于-20℃中，ELISA法檢測CK、LDH、TNF-α、IL-8活性。

1.7 心肌組織中MDA含量、SOD活性測定 取缺血區(qū)心肌組織，冰生理鹽水反復(fù)沖洗，用磷酸鹽緩沖液配置成10%的心肌組織勻漿，離心后取上清液，按試劑盒要求測定MDA含量和SOD活性。

1.8 心肌梗死面積的測定 取結(jié)扎線下缺血區(qū)心室肌凍存5 min后取出，從心尖至心底橫切制心室肌組織切片，厚度約為2 mm，在37℃下用氯化三苯基四氮唑紅(TTC，1%)的磷酸緩沖液溫孵10 min。梗死心肌不染色呈白色，未梗死心肌染色后呈紅色，描計(jì)輪廓并掃描輸入病理圖像分析系統(tǒng)，用左心室組織切片梗死區(qū)面積除以左心室組織切片總面積計(jì)算梗死面積百分率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)進(jìn)行F檢驗(yàn)，q檢驗(yàn)，秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 透射電鏡下各組心肌超微結(jié)構(gòu)改變 SH組心肌細(xì)胞核完整，線粒體形態(tài)和數(shù)量正常，嵴排列整齊；I/R組少見細(xì)胞核，核膜缺損，線粒體內(nèi)無嵴結(jié)構(gòu)；I/R+TFBL組心肌細(xì)胞核仁內(nèi)陷，線粒體數(shù)量增多，內(nèi)有少量空泡，嵴尚可見；I/R+TFBM組心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量正常，核膜微內(nèi)陷，毛細(xì)血管細(xì)胞完好；I/R+TFBH組心肌細(xì)胞內(nèi)核完好，胞膜清晰，線粒體稍多，嵴清晰可見。見圖1。

圖1 各組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(透射電鏡，×20 000)

2.2 TFB預(yù)處理對血清LDH、CK、TNF-α 和IL-8的影響 與SH組比較，I/R組心肌缺血再灌注后血清中的LDH、CK、TNF-α和IL-8水平升高明顯(P<0.05)；與I/R組比較，TFB M和TFBH組血清中的LDH、CK、TNF-α和IL-8水平降低，且存在一定的量效關(guān)系(P<0.05)。見表1。

2.3 TFB預(yù)處理對心肌組織MDA含量、SOD活性的影響 與SH組比較，I/R組心肌組織中MDA含量水平明顯升高、SOD活性顯著增高(P<0.05)； 與 I/R組比較，TFB各劑量組均可降低MDA含量，提高SOD活性，且有一定的量效關(guān)系(P<0.05)。見表1。

2.4 各組心肌梗死面積 與I/R組相比，TFB各組均有效降低心肌梗死面積，劑量愈大效果愈明顯(P<0.05)。見表1。

表1 TFB對血清LDH、CK、TNF-α、IL-8、心肌組織MDA、SOD、心肌梗死面積的影響

與SH組相比：1)P<0.05；與I/R組相比：2)P<0.05

3 討 論

心肌酶CK和LDH水平是反映心肌損傷的重要標(biāo)志，心肌缺血再灌注后CK和LDH含量明顯升高。本文結(jié)果顯示TFB可有效降低血漿CK和LDH含量，對缺血再灌注心肌有良好的保護(hù)作用。心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，研究表明與自由基、炎癥、鈣超載、心肌纖維能量代謝障礙、細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)〔9，10〕。

TNF-α是機(jī)體處于應(yīng)激、炎癥、感染、組織損傷和休克時(shí)產(chǎn)生的促炎癥性細(xì)胞因子，與心肌梗死、充血性心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化等多種心臟疾病密切相關(guān)。TNF-α可抑制心肌收縮力、左室射血分?jǐn)?shù)，降低全身血管阻力，降低血壓，擴(kuò)張心室，還可誘導(dǎo)白三烯、血小板活性因子和血栓素A2等釋放，通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞與缺血再灌注部位心肌細(xì)胞黏附而損傷心肌〔11〕。IL-8主要由單核-巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生〔12〕，在通過誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮下基質(zhì)造成心肌損傷中發(fā)揮重要作用〔13〕。TNF-α還可誘導(dǎo)IL-8等其他體液炎性介質(zhì)的生成，這些細(xì)胞因子相互作用，形成炎性反應(yīng)鏈，進(jìn)一步加重機(jī)體損傷〔14〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TFB可降低缺血再灌注大鼠血清TNF-α、IL-8含量，具有抗炎作用，并具有劑量依賴性。

氧化應(yīng)激是心肌缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的啟動(dòng)因素之一〔15〕。在缺血、缺氧條件下，氧自由基既可促使心肌細(xì)胞壞死，又可通過多種途徑介導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡。缺血再灌注時(shí)大量自由基引起脂質(zhì)過氧過， MDA水平升高損傷心肌，MDA是反映心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。SOD是體內(nèi)的主要抗氧化酶，是反映機(jī)體抗氧化能力的特異性指標(biāo)，可清除氧自由基，保護(hù)細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示TFB可提高缺血再灌注大鼠心肌組織SOD活性，降低MDA含量。綜上，TFB有較好防治心肌缺血再灌注損傷、保護(hù)心肌作用，可能與其抗炎和抗脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)。

1 潘贊紅,金 鑫.中醫(yī)藥對心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用研究概況〔J〕.天津藥學(xué),2008;20(4):64-6.

2 孟祥穎,李向高,羅維穎,等.鬼針草的研究概況〔J〕.中藥材,2001;24(6):452-4.

3 趙 燕,趙 瑩,王緒成,等.鬼針草的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展〔J〕.中國藥房,2007;18(15):1189-90.

4 錢岳晟,張偉忠,周懷發(fā),等.鬼針草對血壓影響的臨床研究〔J〕.浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003;27(1)：23-5.

5 李 玲,劉旭杰,郝 洪.鬼針草降壓作用與腎上腺素受體的關(guān)系〔J〕.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2004;25(23):51.

6 李 帥,匡海學(xué),畢明剛,等.鬼針草提取物對Ⅱ型糖尿病小鼠降血糖作用的研究〔J〕.中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2003;31(5):37-9.

7 黃川鋒,馬瑜紅,周 新,等.鬼針草提取物對實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠血脂和NO及NOS的影響 〔J〕.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2009;3(17):14-6.

8 程新燕.鬼針草總黃酮對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1/smad通路的影響〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué),2013;19(21):253-7.

9 楊葉猗,楊作成.心肌缺血再灌注損傷保護(hù)劑研究進(jìn)展〔J〕.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2008;15(2)：606-8.

10 Magaki S，Mueller C，Dickson C，etal.Increased production of inflammatory cytokines in mild cognitive impairment〔J〕.Exp Gerontol，2007;42(3)：233-40.

11 Meldrum DR.Tumor necrosis factor in the heart〔J〕.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，1998;274(11):R577-95.

12 White MY，Tehen AS，Mc Carron HC，etal.Proteomics of ischemia and reperfusion iniunes in rabbit myocardium with and without intervention by an Oxygen-free radical scavenger〔J〕.Proteomies，2006;6(23)：6221-33.

13 尚 曉,陸 紅.阿托伐他汀對大鼠心肌缺血再灌注的影響及作用機(jī)制〔J〕.陜西醫(yī)學(xué)雜志,2010;39(11):1458-60.

14 Wang M,Tsai BM,Kher A,etal.Role of endogenous testosterone in myocardial proinflammatory and proapoptotic signaling after acute ischemia-reperfusion〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2005;288(1):H221-6.

15 Di Filippo C,Cuzzocrea S,Rossi F,etal.Oxidative stress as the leading cause of acute myocardial infarction in diabetics〔J〕.Cardiovasc Drug Rev,2006;24(2):77-87.

〔2013-12-17修回〕

(編輯 苑云杰)

河南省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(No.2011C310007)

馬瑜紅(1974-)，女，碩士，副教授，主要從事中藥藥理和毒理學(xué)研究。

R285.5

A

1005-9202(2015)12-3240-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.023