高鹽誘導(dǎo)Wistar大鼠腎損害的機(jī)制及替米沙坦的干預(yù)效果

王曉春 商黔惠 石耿輝

(遵義醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)研究所高血壓研究室，遵義 貴州 563003)

高鹽誘導(dǎo)Wistar大鼠腎損害的機(jī)制及替米沙坦的干預(yù)效果

王曉春 商黔惠 石耿輝

(遵義醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)研究所高血壓研究室，遵義 貴州 563003)

目的 探討長期高鹽飲食導(dǎo)致Wistar大鼠腎臟損害的機(jī)制及替米沙坦干預(yù)效果。方法 雄性Wistar大鼠49只，隨機(jī)分為對(duì)照組(NS組，n=13，用含0.5%NaCl顆粒飼料喂養(yǎng))、高鹽組(n=24，用含8%NaCl顆粒飼料喂養(yǎng))、干預(yù)組(GY組，n=12，用含8%NaCl顆粒飼料喂養(yǎng)+替米沙坦灌胃)，均自由飲水，飼養(yǎng)24 w。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)用尾動(dòng)脈測(cè)壓儀測(cè)血壓，用代謝籠收集24 h尿液測(cè)定尿蛋白量，HE染色觀察腎皮質(zhì)形態(tài)學(xué)的改變，生化方法測(cè)定腎組織超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、鈉泵(Na+-K+-ATPase)和鈣泵(Ca2+-ATPase)活性；Western印跡法檢測(cè)腎組織過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與NS組比較，24 w時(shí)高鹽組部分大鼠血壓增高，將血壓升高大鼠，分為高鹽高血壓組(HH組，n=13)其余大鼠分為高鹽正常血壓組(HN組，n=11)；HH組和HN組大鼠腎組織均有大量炎癥細(xì)胞浸潤，尿蛋白排泄增多，總SOD活力、Ca2+-ATPase活性降低(P<0.05)，PPAR-γ蛋白表達(dá)增高(P<0.05)，而GY組大鼠腎組織炎癥細(xì)胞浸潤程度、尿蛋白排泄量均較高鹽組低。結(jié)論 長期高鹽飲食飼養(yǎng)可導(dǎo)致Wistar大鼠的腎損害，其可能與炎癥和氧化應(yīng)激有關(guān)，PPAR-γ蛋白表達(dá)的增高可能對(duì)腎損害有拮抗作用。替米沙坦可能通過降低尿蛋白的排泄和抑制炎癥反應(yīng)對(duì)腎臟起保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激；過氧化物酶體增殖物激活受體-γ

大量的臨床試驗(yàn)和動(dòng)物研究均證實(shí)，高鹽有獨(dú)立于血壓的腎損害作用。Schindler等〔1〕發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激與慢性腎功能不全關(guān)系密切。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-γ可通過調(diào)控炎性反應(yīng)而阻止腎臟纖維化的進(jìn)展，其激動(dòng)劑能使高血壓大鼠模型血壓降低〔2〕。目前，高鹽與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)之間關(guān)系的研究報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)旨在觀察長期高鹽飲食飼養(yǎng)對(duì)Wistar大鼠腎組織炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和PPAR-γ蛋白表達(dá)的影響及替米沙坦的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 80～100 g的雄性Wistar大鼠49只〔合格證號(hào)：SCXK-(渝)2007-0005〕，置于室溫22℃～25℃、相對(duì)濕度45%的動(dòng)物房內(nèi)飼養(yǎng)，采用顆粒飼料〔合格證號(hào)：SCXK-(粵)2008-0002〕喂養(yǎng)且自由飲水。隨機(jī)分為對(duì)照組(NS組，n=13，含0.5%NaCl顆粒飼料喂養(yǎng))、高鹽組(n=24，含8%NaCl顆粒飼料喂養(yǎng))、干預(yù)組(GY組，n=12，含8%NaCl顆粒飼料喂養(yǎng)+替米沙坦灌胃)，均飼養(yǎng)24 w。

1.2 尾動(dòng)脈收縮壓測(cè)量 標(biāo)準(zhǔn)尾部測(cè)壓法測(cè)量實(shí)驗(yàn)前及24 w時(shí)的尾動(dòng)脈收縮壓，每只大鼠測(cè)量5次，每次間隔1 min，取5次測(cè)量的平均值作為大鼠尾動(dòng)脈收縮壓。

1.3 尿蛋白測(cè)定 24 w時(shí)，用代謝籠收集24 h尿液，測(cè)定24 h尿微量白蛋白和24 h尿總蛋白。

1.4 取材及腎組織指標(biāo)的檢測(cè) 24 w時(shí)斷頭處死大鼠，迅速摘取左側(cè)腎臟投入冰冷的生理鹽水中清洗，清洗完畢后置濾紙上吸干，將左腎沿長軸冠狀切為三部分，取中間厚約0.2～0.3 cm的組織塊在冰冷的生理鹽水中漂洗，置濾紙上吸干，放入盛有4%多聚甲醛緩沖液中，室溫下固定24 h，石蠟包埋，切片，HE染色；取左腎腹側(cè)部分皮質(zhì)于-80℃冰箱中凍存，用于檢測(cè)總超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量、鈉泵(Na+-K+-ATPase)及鈣泵(Ca2+-ATPase)活性，背側(cè)部分皮質(zhì)于-80℃冰箱中凍存，用于Western印跡法檢測(cè)PPAR-γ蛋白的表達(dá)。

1.5 Western印跡的檢測(cè) 取適量腎皮質(zhì)加入RIPA裂解液(強(qiáng))中，充分裂解后離心取上清液，根據(jù)BCA法蛋白定量試劑盒操作步驟測(cè)定蛋白原液濃度，蛋白定量(100 mg/10 μl)，配8%的分離膠及5%積層膠，取10 μl總蛋白加入 2×SDS-PAGE，總體積為20 μl，混勻，煮沸5 min變性，加樣，80 V電壓跑積層膠，120 V電壓跑分離膠，根據(jù)各條帶情況決定電泳時(shí)間，當(dāng)溴酚藍(lán)染液到達(dá)分離膠底邊時(shí)，停止電泳；電轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉或1%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，0.1%TBST洗膜3次，每次10 min，加入一抗(濃度1∶500)4℃孵育過夜，0.1%TBST洗膜3次，每次10 min，室溫下加入二抗(濃度1∶1 000)孵育1 h，再次0.1%TBST洗膜3次，每次10 min。將混合好的ECL工作液均勻加至PVDF膜上，曝光顯影成像。用SYNGENE凝膠圖像分析儀進(jìn)行結(jié)果的分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS16.0軟件。組間正態(tài)分布資料比較采用單因素方差分析，方差齊使用LSD法，方差不齊使用Tamhane′s T2法，偏態(tài)分布資料比較采用秩和檢驗(yàn)；兩變量間的相關(guān)性分析使用Pearson法。

2 結(jié) 果

2.1 尾動(dòng)脈收縮壓測(cè)量結(jié)果 各組大鼠基礎(chǔ)尾動(dòng)脈收縮壓相似。實(shí)驗(yàn)24 w時(shí)，與NS組比較，高鹽組部分大鼠尾動(dòng)脈收縮壓增高。因此，根據(jù)大鼠尾動(dòng)脈收縮壓測(cè)定結(jié)果及顧德官等〔3〕的大鼠高血壓判定標(biāo)準(zhǔn)，將高鹽組分為高鹽高血壓組(HH組，n=13)、高鹽正常血壓組(HN組，n=11)。HH組與其余各組比較，實(shí)驗(yàn)24 w時(shí)血壓均明顯增高，見圖1。

2.2 HE染色結(jié)果 24 w時(shí)，與NS組比較，HH組、HN組大鼠腎皮質(zhì)區(qū)有大量炎癥細(xì)胞浸潤，而GY組大鼠腎皮質(zhì)炎癥細(xì)胞的浸潤較HH組、HN組均更少，見圖2。

2.3 24 w時(shí)組間尿蛋白比較 見表1。24 w時(shí)，與NS組比較，HH組、HN組的24 h尿微量白蛋白和總蛋白均增高；且GY組較HH組、HN組降低。

2.4 大鼠腎皮質(zhì)組織各指標(biāo)比較 見表2。

2.5 相關(guān)性分析 高鹽組大鼠24 h尿微量白蛋白和總蛋白的排泄與腎組織總SOD活力、Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性均無相關(guān)性，但高鹽組大鼠腎組織總SOD活力與Ca2+-ATPase活性呈顯著正相關(guān)(r=0.574，P=0.003，n=24)，見圖3。

2.6 Western印跡法檢測(cè)腎皮質(zhì)PPAR-γ蛋白表達(dá)結(jié)果 與NS組(0.22±0.03)比較，實(shí)驗(yàn)24 w時(shí)HH組(0.70±0.14)、HN組(0.43±0.11)大鼠腎皮質(zhì)PPAR-γ蛋白的相對(duì)表達(dá)增高(P<0.05)；與HH組比較，HN組、GY組(0.42±0.09)腎皮質(zhì)區(qū)PPAR-γ蛋白的表達(dá)降低(P<0.05)，見圖4。

與HH組比較：1)P<0.05

圖2 Wistar大鼠腎皮質(zhì)HE染色(×200)

表1 24 w時(shí)各組尿蛋白比較

組別n24h尿微量白蛋白平均秩次χ2值P值24h尿總蛋白平均秩次χ2值P值NS組138 2127 510 0023 3116 620 00HH組1336 9236 46HN組1128 6426 18GY組1223 5413 33

表2 腎皮質(zhì)總SOD活力、MDA含量、Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性比較

與NS組比較：1)P<0.05

圖3 高鹽組大鼠腎皮質(zhì)總SOD活力與Ca2+-ATPase活性的相關(guān)性

圖4 腎皮質(zhì)PPAR-γ蛋白的相對(duì)表達(dá)

3 討 論

近年來國內(nèi)外動(dòng)物研究均發(fā)現(xiàn)高鹽飲食可以引起Wistar大鼠血壓增高，有獨(dú)立于血壓的靶器官損害作用〔4，5〕。本研究結(jié)果與上述研究發(fā)現(xiàn)相一致，不同的是，既往文獻(xiàn)鮮見長期高鹽飲食飼養(yǎng)Wistar大鼠發(fā)現(xiàn)血壓僅部分增高的報(bào)道，其原因考慮可能與不同研究使用的高鹽濃度和飼養(yǎng)時(shí)間長短不一所致有關(guān)。

氧化應(yīng)激存在于腎臟病的始末，參與其發(fā)生、發(fā)展，是影響慢性腎臟病患者預(yù)后的重要危險(xiǎn)因素〔6〕。生理情況下腎臟的抗氧化能力與氧自由基的氧化能力相平衡，可保持細(xì)胞的正常生存。當(dāng)腎臟細(xì)胞產(chǎn)生過多的氧自由基或腎臟疾病使其抗氧化能力下降時(shí)，就會(huì)引起或加重腎臟損傷〔7〕。SOD是較好的抗氧化指標(biāo)，慢性腎功能不全患者SOD 明顯缺乏時(shí)，過量的氧自由基即可引起腎組織細(xì)胞損傷。此外，大量研究證實(shí)，ROS還可以作為重要的細(xì)胞內(nèi)信使，對(duì)鈣離子信號(hào)傳遞、蛋白質(zhì)磷酸化過程及轉(zhuǎn)錄因子等均有不同的作用，通過活化許多信號(hào)傳導(dǎo)通路，間接導(dǎo)致組織損傷。近年來研究顯示O2-和H2O2都能抑制細(xì)胞膜Ca2+-ATPase活性，胞質(zhì)游離Ca2+排出障礙，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載可引發(fā)氧自由基的產(chǎn)生，引起或促進(jìn)靶器官的損害，而高鹽可誘發(fā)或加重氧化應(yīng)激〔8，9〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)長期高鹽飲食可使Wistar大鼠腎組織抗氧化能力減弱，氧自由基生成增多，進(jìn)而抑制細(xì)胞膜Ca2+-ATPase活性，使胞質(zhì)游離Ca2+排出障礙，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載又進(jìn)一步加重氧自由基的產(chǎn)生，兩者形成惡性循環(huán)，逐漸誘發(fā)和加重腎損害。

研究〔10,11〕表明PPARs參與機(jī)體多種生理和病理過程，PAR-γ作為PPARs的亞型之一，具有多種生物效應(yīng)，在糖代謝、脂質(zhì)代謝、動(dòng)脈粥樣硬化形成及炎性反應(yīng)中起重要作用，是一個(gè)炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，可調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。PPARγ活化后不僅積極調(diào)節(jié)腎臟組織細(xì)胞的分化和凋亡，還可以逆轉(zhuǎn)腎小球硬化和間質(zhì)纖維化進(jìn)展，在腎臟疾病中發(fā)揮抗炎、降壓、降蛋白尿等腎臟保護(hù)作用〔12，13〕。對(duì)人類及腎臟病動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶增殖物激活受體激動(dòng)劑羅格列酮可減輕腎臟病的蛋白尿，抑制腎臟纖維化〔14〕；Villegas等〔15〕報(bào)道羅格列酮具有增加SOD活性，進(jìn)而減少ROS的產(chǎn)生，以對(duì)抗氧化應(yīng)激的作用。Li等〔16〕研究表明，與WKY比較，自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)腎、肝、心、腦等組織的炎癥相關(guān)因子表達(dá)增強(qiáng)，總抗氧化能力水平顯著降低，而PPAR-γ蛋白表達(dá)增加。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示高鹽組腎組織均有炎癥細(xì)胞的浸潤，SOD活力下降，而PPAR-γ蛋白的相對(duì)表達(dá)卻增高，由此推測(cè)長期高鹽飲食誘導(dǎo)Wistar大鼠腎損害的機(jī)制與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激有關(guān)，而PPAR-γ蛋白表達(dá)的上調(diào)可能是機(jī)體的一種保護(hù)性反應(yīng)。

近年來，研究表明尿蛋白作為一個(gè)獨(dú)立的致病因素與腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)〔17〕。Sugiyama等〔18，19〕研究發(fā)現(xiàn)長期替米沙坦治療可通過降低尿蛋白，抑制上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1/Smad和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑改善高血壓鼠模型中的腎損害和炎癥反應(yīng)。本課題組的研究亦發(fā)現(xiàn)，替米沙坦能降低高鹽飲食大鼠腎皮質(zhì)TGF-β1/Smads信號(hào)通路的基因和蛋白表達(dá)〔20〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，替米沙坦對(duì)長期高鹽飲食飼養(yǎng)Wistar大鼠的腎保護(hù)作用可能與降低尿蛋白、減輕炎性反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，長期高鹽飲食飼養(yǎng)導(dǎo)致Wistar大鼠的腎損害與炎癥和氧化應(yīng)激有關(guān)，PPAR-γ蛋白表達(dá)的增高可能對(duì)其有拮抗作用，替米沙坦可能通過降低尿蛋白的排泄和抑制炎癥反應(yīng)對(duì)腎臟起保護(hù)作用。

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〔2014-07-15修回〕

(編輯 郭 菁)

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81160041)；貴州省社會(huì)發(fā)展攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目和省高層次人才科研條件特助項(xiàng)目〔黔科合SY字(2011)3047號(hào)，TZJF-2009年-42〕

商黔惠(1960-)，女，教授，主要從事高血壓及其靶器官損害的研究。

王曉春(1982-)，女，主治醫(yī)師，主要從事高血壓及其靶器官損害的研究。

R544.1

A

1005-9202(2015)12-3213-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.012