偏硅酸鈉對高脂血癥家兔外周血白細胞活性氧生成的影響

谷麗娟 馬海濤 侯建明 甄艷軍 李愛英

(河北中醫(yī)學院，河北 石家莊 050091)

偏硅酸鈉對高脂血癥家兔外周血白細胞活性氧生成的影響

谷麗娟1馬海濤2侯建明 甄艷軍 李愛英

(河北中醫(yī)學院，河北 石家莊 050091)

目的 觀察偏硅酸鈉(Na2SiO3)對高脂血癥家兔外周血白細胞活性氧(ROS)生成的影響，為其抗動脈粥樣硬化(AS)作用提供進一步支持。方法 12只健康雄性新西蘭大白兔隨機分為正常對照組，高脂血癥組，喂硅組，每組4只。分離各組家兔外周血白細胞后檢測加或不加脂多糖(LPS)和N-甲酰-甲硫氨酰亮氨酰苯丙氨酸(fMLP)條件下的ROS。以RT-PCR的方法檢測CD36，TLR4，TLR2及gp91phox mRNA的表達。結(jié)果 高脂血癥組和喂硅組血漿膽固醇均顯著高于正常對照組，但兩組間無顯著差異(P>0.05)，高脂血癥組白細胞ROS的生成量比正常對照組增加(P<0.01)，喂硅組比高脂血癥組ROS生成量減少(P<0.01)，高脂血癥組單個核細胞及中性粒細胞CD36 、TLR4、TLR2和gp91phox 的mRNA均比正常對照組顯著增加(P<0.01)，喂硅組這四種基因的mRNA均顯著下調(diào)(P<0.01)。結(jié)論 Na2SiO3對LPS和fMLP刺激的高脂血癥家兔外周血白細胞產(chǎn)生ROS有抑制作用；飲用Na2SiO3可以下調(diào)高脂血癥家兔外周血單個核細胞和中性粒細胞CD36、TLR4、TLR2及gp91phox mRNA水平，Na2SiO3的這種作用不通過降低血脂而實現(xiàn)。

Na2SiO3；白細胞；活性氧；高脂血癥；CD36；TLR4；TLR2；gp91phox

以往實驗證實偏硅酸鈉(Na2SiO3)抑制氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)、氟波醇豆蔻酸鹽乙酸酯(PMA)刺激的家兔外周血白細胞活性氧(ROS)的生成〔1〕。因不同刺激物引起ROS增加途徑不完全相同，所以本實驗觀察Na2SiO3對細菌脂多糖(LPS)和N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰苯丙氨酸(fMLP)刺激的高脂血癥家兔外周血白細胞產(chǎn)生ROS的影響，并同時檢測與ROS生成相關的CD36、TLR4、TLR2和gp91phox等基因表達，以期進一步認識Na2SiO3對白細胞產(chǎn)生ROS的影響，為Na2SiO3抗動脈粥樣硬化(AS)作用提供進一步支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 12只清潔級雄性新西蘭家兔(河北醫(yī)科大學動物中心，合格證號：1004218，體質(zhì)量1 500 ～2 000 g)隨機分為正常對照組，高脂血癥組，喂硅組。正常對照組普通飼料喂養(yǎng)，高脂血癥組高脂飼料喂養(yǎng)，喂硅組與高脂血癥組同步飼喂高脂飼料3 w，第4周按每日2 mg硅/kg的量給予Na2SiO3溶液100 ml為飲用水，仍然高脂飼料喂養(yǎng)。共計4 w后分離外周血白細胞。

1.2 分離白細胞 從家兔耳中動脈取血，兔淋巴細胞分離液分離家兔血細胞，取出單個核細胞層和中性粒細胞層混合，得到白細胞懸液，用于ROS測定。分別提取單個核細胞和中性粒細胞總RNA，用于RT-PCR。

1.3 家兔外周血白細胞ROS測定 飼養(yǎng)總計4 w后，將每只家兔分離的白細胞分成五組：空白組(細胞培養(yǎng)液中不加其他試劑)；LPS組、fMLP組(分別在培養(yǎng)液中加入LPS和fMLP)；LPS+硅、fMLP+硅組(在培養(yǎng)液中加入LPS和fMLP的同時加入Na2SiO3)。實驗所用LPS和fMLP的終濃度為2 μg/ml和10-6mol/L，硅的終濃度8.5 mg/L。分別在5 min、15 min、30 min、45 min和60 min以DCFH-DA探針法測定熒光值，各組細胞取60 min內(nèi)最高熒光值表示細胞ROS的量。

1.4 RT-PCR檢測 CD36，TLR4，TLR2及gp91phox mRNA RNA的提取過程、反轉(zhuǎn)錄過程及擴增過程分別按試劑盒說明書進行(北京TIANGEN公司)。CD36上游引物5'-ttggtgtgttttatccttac-3'，下游引物5'-ggttccagtctcattaagcc-3'，擴增片段361 bp；TLR4上游引物5'-gagcacctggacctttcaaataac-3'，下游引物5'-gaacttctaaaccactcagcccttg-3'，擴增片段235 bp；TLR2上游引物5'-tgtctcttcaccgaaccgaatccac-3'，下游引物5'-tcaggtttttcagcgtcagcaggg-3'，擴增片段134 bp；gp91phox上游引物5'-gcttgtggctgtgataagca-3'，下游引物5'-ctcctgcatctgtgtctcca-3'，擴增片段330 bp；GAPDH上游引物5'-gcgcctggtcaccagggctgcttt-3'，下游引物5'-tgccgaagtggtcgtggatgacct-3'，擴增片段465 bp。PCR循環(huán)條件為CD36：94℃預變性5 min，95℃變性30 s，56.1℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)后，72℃延伸5 min；TLR4：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán)后，72℃延伸5 min；TLR2：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán)后，72℃延伸5 min；gp91 phox：95℃預變性15 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán)后，72℃延伸5 min；GAPDH：94℃預變5 min，95℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)后，72℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物10 μl，1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像儀攝影，并掃描灰度，用與GAPDH的比值作為相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1 膽固醇濃度檢測 動物飼養(yǎng)4 w后，高脂血癥組家兔血漿膽固醇濃度(10.5 mmol/L)高于正常對照組(10.5 mmol/L)(P<0.05)，喂硅組(10.8 mmol/L)與高脂血癥組無顯著差別(P<0.05)。

2.2 白細胞ROS的檢測 高脂血癥家兔空白組白細胞ROS量較正常對照組明顯升高(35.2±4.8 vs 24.4±2.8，P<0.01)；喂硅組較高脂血癥組ROS量降低(28.3±5.6，P<0.01)。

2.3 LPS和fMLP對白細胞ROS的影響 高脂血癥組家兔分離的白細胞分別給予LPS和fMLP刺激后，ROS量均比同樣刺激的空白組家兔白細胞顯著增加(P<0.05)，喂硅組家兔白細胞ROS受LPS和fMLP刺激后的ROS量比高脂組顯著下降(P<0.05)，見表1。

2.4 培養(yǎng)液中加硅對LPS和fMLP刺激的白細胞ROS影響 培養(yǎng)液中加硅使空白組和高脂血癥組家兔白細胞受LPS刺激的ROS生成減少(P<0.01)，對喂硅組家兔白細胞受LPS刺激的ROS生成無顯著影響；培養(yǎng)液中加硅使空白組、高脂血癥組和喂硅組家兔白細胞受fMLP刺激的ROS生成均減少(P<0.01)，見表2。

2.5 RT-RCR結(jié)果 高脂血癥組單個核細胞及中性粒細胞CD36 、TLR4、TLR2和gp91phox 的mRNA均比空白組顯著增加，喂硅組這四種基因的mRNA均顯著下調(diào)，見圖1，圖2，表3，表4。

表1 LPS和fMLP對白細胞ROS水平的影響

與高脂血癥組比較：1)P<0.01；與LPS組比較：2)P<0.01，表2同

表2 培養(yǎng)液中加硅對LPS和fMLP刺激的白細胞ROS水平的影響

圖1 單個核細胞CD36，TLR4，TLR2，gp91phox mRNA表達

組別CD36TLR4TLR2gp91phox空白組 0 355±0 00360 689±0 00690 494±0 00300 492±0 0025高脂血癥組 0 424±0 0081)0 757±0 00471)0 532±0 00351)0 526±0 00271)喂硅組0 371±0 00592)0 730±0 00312)0 502±0 00272)0 503±0 00312)

與空白組比較：1)P<0.01；與高脂血癥組比較：2)P<0.01；表4同

表4 中性粒細胞CD36，TLR4，TLR2，gp91phox mRNA表達

圖2 中性粒細胞CD36，TLR4，TLR2，gp91phox mRNA表達

3 討 論

高脂血癥條件下外周血白細胞引爆和激活，產(chǎn)生過多的ROS。ROS可引起低密度脂蛋白氧化并直接損傷血管內(nèi)皮細胞。所以，外周血白細胞引爆和激活是引發(fā)AS的重要原因之一〔2〕。本文前期實驗證實，飲用Na2SiO3或在細胞培養(yǎng)液中加入Na2SiO3能夠抑制PMA刺激的高脂家兔外周血白細胞ROS生成〔1〕。PMA激活白細胞作用不通過受體介導，本實驗以需要受體介導激活作用的LPS和fMLP為刺激物，得到與PMA類似結(jié)果，進一步證實了Na2SiO3可以下調(diào)高脂條件下白細胞引爆狀態(tài)、減少白細胞的ROS生成，并提示Na2SiO3可能在多個途徑發(fā)揮其抑制ROS作用。

清道夫受體CD36、Toll樣受體(TLR)家族中的TLR2和TLR4介導ox-LDL和LPS激活白細胞〔3，4〕。刺激物與相應受體結(jié)合后激活NADPH氧化酶，此酶在ROS生成過程中起重要作用。NADPH氧化酶由多個亞基組成，gp91phox是其核心組分之一〔5〕。本實驗mRNA檢測結(jié)果表明家兔高脂血癥時白細胞引爆和激活與CD36，TLR2、TLR4和gp91phox的基因表達上調(diào)有關。短期飲用Na2SiO3后，家兔血脂未降低，但是這四種基因的mRNA水平均下降，提示Na2SiO3能夠調(diào)節(jié)相關基因表達而抑制白細胞ROS的產(chǎn)生，并且這種效應獨立于降血脂作用。本文分別測定了單個核細胞和中性粒細胞的RNA，上述四種RNA在兩類細胞中均被Na2SiO3下調(diào)。近年，中性粒細胞活化在AS形成中的作用逐步受到重視，抑制該過程對防控AS、冠心病有重要意義〔6〕。

動物實驗已經(jīng)證實Na2SiO3降低血脂、減輕動脈粥樣硬化斑塊，并曾發(fā)現(xiàn)Na2SiO3可以抑制白細胞黏附分子CD54、CD106表達〔7〕。本文結(jié)果表明Na2SiO3不依賴降血脂而抑制白細胞ROS的生成，提示Na2SiO3在多環(huán)節(jié)抑制外周血白細胞炎癥反應，其具體機制值得深入研究。

1 谷麗娟，侯建明，甄顏君，等.偏硅酸鈉抑制家兔外周血白細胞活性氧的生成〔J〕.基礎醫(yī)學與臨床，2012；32(1)：94-5.

2 Mazor R，Shurtz-Swirski R，F(xiàn)arah R，etal. Primed polymorphonuclearleukocytes constitute a possible link between inflammation and oxidative stress in hyperlipidemic patients〔J〕. Atherosclerosis，2008；197(2)：937-43.

3 Lundberg AM，Hansson GK.Innate immune signals in atherosclerosis〔J〕.Clin Immunol，2010；134(1)：5-24.

4 Stewart BW，Nagarajan S.Recombinant CD36 inhibits ox-LDL-induced ICAM-1-dependent monocyte adhesion〔J〕. Mol Immunol，2006；43(3)：255-67.

5 Sheppard FR，Kelher MR，Moore EE，etal.Structural organization of the neutrophil NADPH oxidase：phosphorylation and translocation during priming and activation〔J〕. J Leukocyte Biol，2005；78(11)：1025-42.

6 Sugano R，Matsuoka H，Haramaki N，etal. Polymorphonuclear leukocytes may impair endothelial function：results of crossover randomized study of lipid-lowering therapies〔J〕. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005；25(6)：1262-7.

7 王 林，侯建明，甄艷軍，等. Na2SiO3對高脂血癥大鼠外周血白細胞黏附分子表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2007；27(15)：1466-7.

〔2013-12-07修回〕

(編輯 安冉冉/曹夢園)

河北省科技支撐計劃項目(08276101D-103)

侯建明(1957-)，男，教授，碩士生導師，主要從事動脈粥樣硬化基礎研究。

谷麗娟(1982-)，女，住院醫(yī)師，碩士，主要從事臨床病理診斷研究。

R543

A

1005-9202(2015)12-3196-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.005

1 北京市延慶縣醫(yī)院病理科 2 北京市延慶縣醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科