UrocortinⅠ后處理對(duì)缺氧/復(fù)氧大鼠心肌線粒體膜電位的影響

田 偉，顧 燕，鄧勝利，張 琳

(遵義醫(yī)學(xué)院 麻醉學(xué)系暨貴州麻醉與器官保護(hù)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

UrocortinⅠ后處理對(duì)缺氧/復(fù)氧大鼠心肌線粒體膜電位的影響

田 偉，顧 燕，鄧勝利，張 琳

(遵義醫(yī)學(xué)院 麻醉學(xué)系暨貴州麻醉與器官保護(hù)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

目的 探討UrocortinⅠ后處理對(duì)缺氧/復(fù)氧后成年大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響。方法 利用離體心臟灌注裝置(MPA)分離成年大鼠心肌細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并隨機(jī)分為正常組(N組)、缺氧/復(fù)氧組(I/R組)、UrocortinⅠ后處理組(UcnⅠ組)、5-羥葵酸拮抗UrocortinⅠ組(5-HD+UcnⅠ組)。N組在預(yù)設(shè)37 ℃培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)135 min；余3組均予缺氧40 min，復(fù)氧60 min建立缺氧/復(fù)氧模型。其中UcnⅠ組在缺氧末復(fù)氧前給予UcnⅠ處理30 min；5-HD+UcnⅠ組在UcnⅠ處理前給予特異性線粒體ATP敏感性鉀通道(mito-KATP)拮抗劑5-HD處理5 min，余處理同UcnⅠ組。各組于復(fù)氧末加入JC-1熒光探針并用激光共聚焦顯微鏡觀察心肌細(xì)胞膜電位的變化。結(jié)果 N組心肌細(xì)胞高膜電位比例均高于其余各組(P<0.01)，而UcnⅠ組高膜電位比例高于I/R組和5-HD+UcnⅠ組(P<0.05)，I/R組與5-HD+Ucn I組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 UcnⅠ后處理可防止缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞線粒體膜電位的下降，保護(hù)復(fù)氧后心肌線粒體的膜電位。

UrocortinⅠ；后處理；缺氧/復(fù)氧；線粒體膜電位；心肌保護(hù)

相關(guān)研究表明線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential MMP)與心肌缺血再灌注損傷(MIRI)時(shí)的細(xì)胞凋亡有關(guān)，而線粒體ATP敏感性鉀通道(mito-KATP)的開放可抑制膜電位下降[1]。UrocortinⅠ(UcnⅠ)是一種內(nèi)源性神經(jīng)肽，研究發(fā)現(xiàn)其后處理可通過(guò)抑制線粒體凋亡通路的活化產(chǎn)生心肌保護(hù)[2]。但該保護(hù)作用是否與MMP變化有關(guān)及與mito-KATP 之間存在怎樣的關(guān)系尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)建立缺氧/復(fù)氧再灌注損傷模型，觀察UcnⅠ后處理對(duì)心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響，探討其發(fā)揮心肌保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 SPF級(jí)成年健康雄性Sprague Dawley大鼠24只，體重250～300g(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(渝)2012-0005)；M199型培養(yǎng)基，層黏連蛋白，EGTA，Ⅱ型膠原酶，BSA，UrocortinⅠ，5-羥葵酸(美國(guó)，sigma公司)；國(guó)產(chǎn)分析純；JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(江蘇碧云天生物研究所)；MPA離體心臟灌注裝置系列(北京吉安德爾科技有限公司)；SP2型激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)，萊卡公司)；倒置相差顯微鏡(日本，OLYMPUS CK2公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)，F(xiàn)orma公司)；超純水處理機(jī)(美國(guó)，Millipore)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理 成年SD大鼠心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng)參考文獻(xiàn)[3]，培養(yǎng)24h后的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為4組：正常組(N組)、缺氧/復(fù)氧組(I/R組)、UrocortinⅠ后處理組(UcnⅠ組)、5-羥葵酸拮抗UrocortinⅠ組(5-HD+UcnⅠ組)。其中N組在預(yù)設(shè)37 ℃95%O2+5% CO2培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)135 min；I/R組正常培養(yǎng)35 min后放入37 ℃95%N2+5% CO2培養(yǎng)箱缺氧40 min，再?gòu)?fù)氧60 min；UcnⅠ組缺氧40 min復(fù)氧5 min后在培養(yǎng)基中加入濃度為10-8mol/L UcnⅠ10 μL培養(yǎng)30 min，復(fù)氧60 min；5-羥葵酸拮抗UrocortinⅠ組(5-HD+UcnⅠ組)缺氧40 min后于培養(yǎng)基中加入濃度為0.1 mmol/L5-HD10 μL培養(yǎng)5 min，余處理同UcnⅠ組。各組于復(fù)氧末加入JC-1熒光染色工作液并行激光共聚焦顯微鏡測(cè)定線粒體膜電位變化。

1.3 激光共聚焦顯微鏡測(cè)定線粒體膜電位 上述各組復(fù)氧末心肌細(xì)胞按JC-1膜電位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作：室溫避光條件下，吸除細(xì)胞培養(yǎng)基，另加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)基及1 mLJC-1染色工作液，放置37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20min。孵育期間，用去離子水將JC-1(5×)染色緩沖液按照4∶1比例稀釋，并放置37 ℃水浴箱中預(yù)熱。孵育結(jié)束后，吸除上清液，用JC-1(1×)染色緩沖液洗滌4次，加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)基。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中形成JC-1聚合物產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體形式產(chǎn)生綠色熒光。激光共聚焦顯微鏡單盲(實(shí)驗(yàn)者不盲、圖像及數(shù)據(jù)采集者盲)法隨機(jī)各組采集8個(gè)不同視野內(nèi)的30個(gè)心肌細(xì)胞分別測(cè)定紅、綠熒光強(qiáng)度并計(jì)算其紅/綠熒光比值，以判斷線粒體高膜電位比例的變化。

2 結(jié)果

激光共聚焦顯微鏡下各組心肌細(xì)胞膜電位熒光圖(見圖1)。其熒光比值結(jié)果顯示N組心肌細(xì)胞高膜電位比例均高于其余各組(P<0.01)，而UcnⅠ組高膜電位比例高于I/R組和5-HD+UcnⅠ組(P<0.05)，I/R組與5-HD+Ucn I組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

A：N組；B：I/R組；C：UcnⅠ組；D：5-HD+UcnⅠ組。

組別紅/綠熒光比例Nor組1．57±0．14I/R組0．67±0．03aUcnⅠ組1．31±0．04ab5-HD+UcnⅠ組0．69±0．04ac

a:與 Nor組比較，P﹤0.01；b:與I/R組比較，P﹤0.05；c:與UcnⅠ組比較，P﹤0.05。

3 討論

1986年Murry[4]首次提出缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning,IP)：預(yù)先反復(fù)、短暫進(jìn)行心肌缺血再灌注，可減輕后續(xù)心肌較長(zhǎng)時(shí)間缺血所致的心肌損傷并增強(qiáng)其耐受性。然而預(yù)處理需在缺血前實(shí)施，而臨床工作中缺血時(shí)間具有不可預(yù)測(cè)性，故限制了其在臨床上的應(yīng)用。繼而Zhao等[5]于2003年提出了缺血后處理(ischemic postconditioning，IPO)概念：即在心肌缺血后再灌前給予數(shù)次短暫重復(fù)缺血/再灌注，有與缺血預(yù)處理相似的心肌保護(hù)作用。然而IPO需阻斷血流，存在反復(fù)嵌閉血管并增加手術(shù)操作步驟所帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。因此為了提高其安全性及可控性，有學(xué)者提出藥物后處理將可能成為很好的替代方式。藥物后處理為心肌缺血后再灌前使用的作用于特異靶點(diǎn)的藥物，能產(chǎn)生與IPO相同的抗MIRI作用且減少IPO過(guò)程中反復(fù)操作帶來(lái)的血管機(jī)械性損傷，因此備受關(guān)注。

線粒體是細(xì)胞能量生成與儲(chǔ)存的場(chǎng)所。其內(nèi)膜上的質(zhì)子泵通過(guò)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)使線粒體內(nèi)膜間隙帶大量正電荷，而膜內(nèi)基質(zhì)帶大量負(fù)電荷，使線粒體膜內(nèi)外形成質(zhì)子梯度的電位差即線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential MMP)。其線粒體內(nèi)膜上的ATP合成酶可利用此跨膜電勢(shì)能合成細(xì)胞發(fā)揮正常功能所需的ATP。故線粒體MMP的正常與否將影響細(xì)胞乃至整個(gè)機(jī)體的正常生理功能。

既往研究已證實(shí)：細(xì)胞凋亡(apoptosis)可能是導(dǎo)致MIRI的重要原因[6]，它是一種有序的或程序性的細(xì)胞主動(dòng)死亡方式。而在導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的三條基本途徑中，線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑被認(rèn)為是MIRI后細(xì)胞凋亡的主要途徑[7]。且發(fā)現(xiàn)在各種不同作用因子誘導(dǎo)的不同類型的細(xì)胞凋亡過(guò)程中，均出現(xiàn)了MMP下降，其MMP下降還往往早于細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。UcnⅠ預(yù)處理可通過(guò)自分泌或旁分泌方式激活多種蛋白激酶或保護(hù)MMP、抑制細(xì)胞凋亡等方式發(fā)揮抗MIRI作用[8-9]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，UcnⅠ后處理也具有抗MIRI的作用[10]，但其后處理的心肌保護(hù)作用與MMP之間的關(guān)系不是十分明了。

本研究利用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)：N組線粒體MMP高于其余各組，說(shuō)明 MMP下降是MIRI后的重要表現(xiàn)之一，與以往研究結(jié)果一致[11]。而UcnⅠ后處理其線粒體MMP高于I/R組和5-HD+UcnⅠ組，表明UcnⅠ后處理可穩(wěn)定缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞線粒體的膜電位。為了證實(shí)UcnⅠ穩(wěn)定MMP的作用是否與mito-KATP通道的開放有關(guān)，本研究選擇了mito-KATP特異性阻斷劑5-HD。從表1結(jié)果中可看出5-HD+UcnⅠ組MMP較N組及UcnⅠ組低，與I/R組無(wú)差異。提示5-HD阻斷了UcnⅠ后處理對(duì)MMP的穩(wěn)定作用，證明UcnⅠ后處理穩(wěn)定MMP的作用是通過(guò)開放mito-KATP實(shí)現(xiàn)。其機(jī)制可能是UcnⅠ后處理通過(guò)開放mito-KATP通道，增加K+外流，抑制電壓依賴性鈣通道的Ca2+內(nèi)流，致細(xì)胞膜超極化，超級(jí)化阻止細(xì)胞對(duì)鈣的重?cái)z取，加速鈉鈣交換，減輕線粒體鈣超載，恢復(fù)線粒體內(nèi)膜質(zhì)子泵功能，阻止線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)過(guò)度開放，從而穩(wěn)定線粒體膜電位。而MMP的穩(wěn)定又可防止細(xì)胞凋亡進(jìn)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用[12]。

綜上所述，UcnⅠ后處理可穩(wěn)定缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞線粒體膜電位，其機(jī)制可能與mito-KA0TP

開放有關(guān)。但UcnⅠ后處理發(fā)揮的心肌保護(hù)效應(yīng)與MMP之間的直接證據(jù)尚待證明。

[1] Li J, Lang M J,Mao X B,et al.Antiapoptosis and mitochondrial effect of pioglita-zone preconditioning in the ischemic/reperfused heart of rat[J].Cardiovasc Drugs Ther,2008,22(4):283-291.

[2] 歐袁,楊雙強(qiáng),辛東.Urocortin后處理抑制線粒體凋亡通路保護(hù)心肌缺血再灌注損傷[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,35(8):1187-1190.

[3] 張琳,鄧勝利,姚剛,等. UrocortinⅠ對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞鈣離子的影響[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2012,35(3):193-195.

[4] Murry C E, Jennings R B, Reimer K A. Preconditioning with isichemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J].Circulation,1986,74(5):1124-1136.

[5] Zhao Z Q, Corvera J S, Halkos M E, et al. Inhabition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparision with preconditioning[J].AM J Physiol Heart Circ Physiol,2003,285(2):579-588.

[6] Eefting F,Rensing B,Wigman J,et al.Role of apoptosis in reperfusion injury [J].Cardiovascular Research,2004,61(3):414-426.

[7] Gomez L,Chavanis N,Arqaud L,et al.Fas-independent mitochondrial damage triggers cardio myocyte death after ischemia-reperfusion[J].Am J Physiol Heart Circ Phvsiol,2005,289(5):2153-2158.

[8] Cong B,Wang L,Zhu X,et al.SGK1 Is Involved in Cardioprotection of Urocortin-I Against Hypoxia/Reoxygenation in Cardiomyocytes[J]. Can J Cardiol,2014,30(6):687-695.

[9] 顧燕,孫文婷,鄧勝利,等.UrocortinⅠ預(yù)處理對(duì)缺氧/復(fù)氧大鼠心肌線粒體膜電位的影響[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,36(4):336-338.

[10] 尹雪蓮, 成蓓. Urocortin調(diào)控Bcl-2家族與大鼠/復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡[J].循環(huán)學(xué)雜志,2005,15(4):22-24.

[11] Sharikabad M N,Ostbye K M,Brors O,et al.Increased Mg2+reduces Ca2+influx and disruption of mitochondrial membrane potential during reoxygenation[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2001,281(5):2113-2123.

[12] Eirin A,Li Z,Zhang X,et al. A mitochondrial permeability transition pore inhibitor Improves renal outcomes after revascularization in experimental atherosclerotic renal artery stenosis[J].Hypertension,2012,60(5):1242-1249.

[收稿2014-11-04;修回2014-12-08]

(編輯：王福軍)

Effects of Urocortin I postconditioning on mitochondrial membrane potential during myocardial hypoxia/reoxygenation injury

TianWei,GuYan,DengShengli,ZhangLin

(Department of Anesthesiology,Zunyi Medical University,Guizhou Key Laboratory of Anesthesia and Organ Protection,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To investigate the effects of mitochondrial membrane potential changes in Urocortin I-postconditioning of myocardial hypoxia/reoxygenation injury.Methods Myocardial cells of adult rats were isolated using the MPA isolated heart-perfusion system. Myocardial cells were divided into four groups after 24 h cultures : normal group (N), hypoxia/reoxygenation group (I/R), Urocortin I group (Ucn I), and 5-hydroxydecanoate + Urocortin I group(5-HD+Ucn I). The cells of group N was cultured continuously in the 37 ℃ incubator for 135 minutes while other groups experienced anoxia for 40 minutes and reoxygenation for 60 minutes to produce hypoxia/reoxygenation model. Ucn I group and group 5-HD were given Ucn I-postconditioning for 30 minutes after hypoxia. 5-HD was added to group 5-HD + Ucn I for 5 minutes before adding Ucn I.at the end of reoxygenation process.The cultured cardiomyocytes were mixd with JC-1 to detect the changes of mitochondrial membrane potential by laser scanning confocal microscope.Results Normal group had the highest mitochondrial membrane potential(P<0.05)while the potential of Ucn I group is higher than that that in I/R group and 5-HD+ Ucn I group(P<0.05).There was no significant difference between group I/R and group 5-HD+Ucn I(P>0.05).Conclusion Ucn I-postconditioning could prevent the mitochondrial membrane potential reduction after myocardial cells suffer from hypoxia/reoxygenation and the mechanism may be mediated through the opening of mito-KATPchannel.

UrocortinⅠ; postconditioning; Hypoxia/reoxygenation; mitochondrial membrane potential;myocardial protection

貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(NO：黔科合SY字[2013]3024)。

鄧勝利，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心肌保護(hù)，E-mail:zydsl2004@163.com。

R614

A

1000-2715(2015)01-0064-03