新生期大鼠重復(fù)吸入七氟烷對(duì)其成年期Aβ、Tau蛋白的影響

馬歡歡，張 超，鄭淑文，朱昭瓊，劉 進(jìn)

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 麻醉學(xué)系，貴州 遵義 563099；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院 麻醉科，四川 成都 610041)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

新生期大鼠重復(fù)吸入七氟烷對(duì)其成年期Aβ、Tau蛋白的影響

馬歡歡1，張 超1，鄭淑文1，朱昭瓊1，劉 進(jìn)2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 麻醉學(xué)系，貴州 遵義 563099；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院 麻醉科，四川 成都 610041)

目的 研究新生期大鼠間斷、重復(fù)吸入七氟烷,對(duì)其成年期行為學(xué)及β淀粉樣蛋白(Aβ)、異常磷酸化Tau蛋白(PHF-Tau)在海馬CA1區(qū)的表達(dá)。方法 7日齡SD大鼠24只，隨機(jī)分為3組(n=8)，1.5%七氟烷組(S1組)，2.6%七氟烷組(S2組),對(duì)照組(C組)。分別于出生7、14、21 d(P7、P14、P21)吸入1.5%、2.6%七氟烷及運(yùn)載氣體1 h，于P91～P95行定位航行和空間探索實(shí)驗(yàn)。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取海馬組織，用免疫組織化學(xué)的方法測(cè)定CA1區(qū)Aβ、PHF-Tau蛋白的表達(dá)。結(jié)果 ①與C組相比，P94，S1組、S2組逃避潛伏期延長(zhǎng)(P<0.01或P<0.05)，P95，S1組潛伏期延長(zhǎng)(P<0.05)；②與P91相比，C組、S2組P94和P95逃避潛伏期縮短(P<0.05)；S1組，P93逃避潛伏期縮短(P<0.05)；③與C組比較，S1組原平臺(tái)象限滯留時(shí)間百分比減少(P<0.01)；④與C組比較，S1組PHF-Tau蛋白MOD增加(P<0.05),S1組、S2組Aβ蛋白MOD增加(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 新生期大鼠間斷、重復(fù)吸入1.5%、2.6%的七氟烷可使其成年期學(xué)習(xí)記憶能力下降，其中吸入1.5%七氟烷較2.6%七氟烷影響更持久。其機(jī)制可能與成年期海馬CA1區(qū)Aβ、PHF-Tau蛋白水平的改變有關(guān)。

七氟烷；學(xué)習(xí)記憶；Aβ蛋白；磷酸化Tau蛋白

臨床研究顯示：4歲以下的兒童接受手術(shù)麻醉后，可能影響孩子后期閱讀能力的發(fā)展、書面語(yǔ)言的學(xué)習(xí)以及數(shù)學(xué)計(jì)算的能力[1-3]。七氟烷以誘導(dǎo)、復(fù)蘇快及對(duì)氣道刺激性小等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于小兒麻醉，而接受七氟烷麻醉后對(duì)成年期學(xué)習(xí)記憶是否改變及其機(jī)制尚未明了。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)新生期大鼠間斷、重復(fù)吸入七氟烷，于成年期測(cè)試其行為學(xué)及大鼠海馬β淀粉樣蛋白(Aβ)、異常磷酸化Tau蛋白(PHF-Tau)水平的表達(dá)，以期對(duì)嬰幼兒期間斷、重復(fù)接受手術(shù)(如燒傷、創(chuàng)傷、整形)是否對(duì)其成年期的學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生影響，提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 7日齡SPF級(jí)SD大鼠24只，雌雄不拘，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。[sexk(渝)2007-0005]。隨機(jī)分為3組(n=8)，1.5%七氟烷組(S1組)，2.6%七氟烷組(S2組),對(duì)照組(C組)。環(huán)境溫度21±2 ℃，濕度55%～65%，12 h光照與黑暗交替。哺乳期母乳喂養(yǎng)。

1.2 藥品、試劑與儀器 七氟烷(批號(hào)：65120301，魯南貝特制藥有限公司), Anti-beta antibody(批號(hào)：ab14220,abcam 公司，英國(guó)),Anti-Tau antibody(批號(hào)：ab3205,abcam 公司，英國(guó))，GTVIsionⅢ鼠/兔通用二抗檢測(cè)系統(tǒng)，Morris 水迷宮測(cè)試儀(成都泰盟科技有限公司)，氣體監(jiān)測(cè)儀(Dragra,德國(guó))、自制吸入麻醉箱。

1.3 麻醉方法 將SD大鼠置于自制的循環(huán)密閉麻醉劑箱(78 cm×48 cm×15 cm)中,連接麻醉機(jī)，箱底鋪一層(約2 cm)鈉石灰，覆蓋薄層紗布，每個(gè)實(shí)驗(yàn)日早上9∶00開(kāi)始，按S1、S2及C組分別于P7、P14、P21吸入 1.5%七氟烷、2.6%七氟烷、運(yùn)載氣體(1 L O2+ 1 L 空氣/min)1 h，實(shí)驗(yàn)中持續(xù)監(jiān)測(cè)進(jìn)氣孔、出氣孔的七氟烷濃度以控制實(shí)驗(yàn)條件。吸入結(jié)束待大鼠完全蘇醒后放回原籠飼養(yǎng)。

1.4 行為學(xué)認(rèn)知功能測(cè)試

1.4.1 定位航行 待3次吸入麻醉結(jié)束后，于P91～P95d行定位航行實(shí)驗(yàn)。采用Moriss水迷宮進(jìn)行測(cè)試，觀察并記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)所需的時(shí)間(即逃避潛伏期)。

1.4.2 空間探索 于定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，撤去平臺(tái)，行空間探索試驗(yàn)，記錄小鼠穿越平臺(tái)象限滯留時(shí)間百分比和進(jìn)入次數(shù)百分比。

1.5 免疫組織化學(xué)方法測(cè)定海馬CA1區(qū)Aβ、異常磷酸化Tau蛋白的表達(dá) 于Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)日，按C組、S1組、S2組分組以1%戊巴比妥(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛經(jīng)主動(dòng)脈行腦灌注，取出海馬組織行石蠟包埋、切片、二甲苯脫蠟、酒精梯度復(fù)水、微波抗原修復(fù)、BSA封閉(30 min)、加入Aβ、磷酸化Tau蛋白抗體(Aβ1∶400、Tau 1∶400)檢測(cè)其表達(dá)。4 ℃孵育過(guò)夜、復(fù)溫、生物素標(biāo)記二抗、DAB顯色(顯微鏡鏡下控制反應(yīng))，蘇木素復(fù)染，脫水、透明，中性樹(shù)膠封片。PBS代替一抗作陰性對(duì)照。 400倍光鏡下顯微鏡熒光圖像分析系統(tǒng)(Leica公司，德國(guó))分析海馬在CA1區(qū)Aβ、PHF-Tau蛋白的表達(dá)，每張切片取CAl區(qū)，每區(qū)隨機(jī)取4個(gè)視野，應(yīng)用Image-Pro Plus分析系統(tǒng)觀察192(2蛋白×24標(biāo)本×4視野=192)個(gè)視野細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)平均光密度(MOD)值進(jìn)行測(cè)量分析[4]。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)測(cè)試結(jié)果

2.1.1 組間比較 P94，與C組比較， S1組、S2組逃避潛伏期延長(zhǎng)(P<0.01或P<0.05)；P95，與C組比較，S1組潛伏期延長(zhǎng)(P<0.05)。

2.1.2 組內(nèi)比較 C組中，與P91比較，P94、P95逃避潛伏期縮短(P<0.05),S1組中，與P91比較，P93逃避潛伏期縮短(P<0.05)；S2組中，與P91比較，P94、P95逃避潛伏期均縮短(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

2.1.3 空間探索 與C組比較，S1組原平臺(tái)象限滯留時(shí)間百分比明顯減少(P<0.01)(見(jiàn)表2)。

組別第91天第92天第93天第94天第95天C組17．25±6．5015．72±7．1914．56±4．0710．98±2．22&10．92±2．64&S1組19．47±8．3615．57±7．5713．34±4．05&13．94±2．89?14．55±2．83#S2組20．27±8．1220．07±7．4616．16±5．3515．55±2．69#&13．08±3．27&

與對(duì)照組比較，*P<0.01,#P<0.05, 與P91比較，&P<0.05。

組別原平臺(tái)象限滯留時(shí)間(%)原平臺(tái)象限進(jìn)入次數(shù)(%)C組31．92±4．5326．00±5．98S1組21．50±7．17?25．88±5．49S2組27．09±4．9221．75±5．75

與對(duì)照組比較，*P<0.01。

2.2 生化指標(biāo)Aβ、PHF-Tau蛋白檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 Aβ蛋白與C組比較，S1組、S2組Aβ的MOD顯著增加(P<0.05或P<0.01)。

2.2.2 異常磷酸化Tau蛋白 與C組比較，S1組PHF-Tau蛋白的MOD顯著增加(P<0.05，見(jiàn)表3)。

組別AβPHF-TauC組0．334±0．1100．415±0．067S1組0．462±O．142?0．460±O．099#S2組0．414±0．123#0．437±0．094

與C組比較，*P<0.01，#P<0.05。

3 討論

研究表明，嚙齒類動(dòng)物的腦神經(jīng)元在新生期的發(fā)育最為敏感，包括神經(jīng)元再生、分化、遷移和細(xì)胞死亡都在這一時(shí)期快速形成，而這些大多與海馬的學(xué)習(xí)和記憶有關(guān)。腦發(fā)育的高峰在產(chǎn)后第2 周(P7～P14)，P21后幾乎沒(méi)有出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡[5]。因倫理問(wèn)題無(wú)法直接使用人類進(jìn)行海馬相關(guān)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)大鼠與人類基因的同源性，本實(shí)驗(yàn)選取新生SD大鼠同時(shí)在P7、P14、P21天間斷重復(fù)吸入七氟烷亞麻醉濃度0.75MAC[6](1.5%七氟烷)，臨床麻醉濃度1.3MAC(2.6%七氟烷)，模擬臨床在0～6月、1歲、3歲期間反復(fù)多次接受麻醉的患兒，觀察對(duì)其在成年期的學(xué)習(xí)記憶影響情況。

CA1區(qū)被認(rèn)為是海馬記憶信號(hào)的主要輸出區(qū)域，是學(xué)習(xí)、記憶，信息處理及信號(hào)傳遞的重要部位[7]。CA3區(qū)的錐體細(xì)胞將信息通過(guò)Schaffer側(cè)支突觸傳給CA1區(qū)，CA1區(qū)的記憶細(xì)胞隨位置編碼的動(dòng)態(tài)變化，可以促進(jìn)在同樣的環(huán)境下發(fā)生的不同事件具有不同記憶痕跡[8]，此區(qū)域β淀粉樣蛋白聚集和Tau蛋白異常磷酸化可引起學(xué)習(xí)記憶能力的改變[9]，因此本實(shí)驗(yàn)選取海馬CA1區(qū)并觀察其上蛋白的變化。

Morris水迷宮為檢測(cè)行為學(xué)的“金指標(biāo)”，其中包括定位航行和空間探索，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：P94，S1組、S2組與C組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且S1組差異更顯著(P<0.01)，表明大鼠在新生期間斷、重復(fù)吸入七氟烷后，在其成年期第94天出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力下降；P95,與C組比較，S1組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，S2組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明吸入1.5%七氟烷對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響更持久，而2.6%七氟烷對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響相對(duì)短暫。組內(nèi)比較，C組，P94、P95與P91比較，逃避潛伏期縮短(P<0.05)，說(shuō)明建模成功。S1組，P93與P91比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，S2組，P94與P91比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明吸入七氟烷的大鼠仍然具有學(xué)習(xí)記憶能力，且吸入1.5%七氟烷較2.6%七氟烷的大鼠提前具備，且峰值在成年期第93天?？臻g探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，與C組比較，S1組原平臺(tái)象限滯留時(shí)間百分比減少(P<0.01)，說(shuō)明空間整合記憶受損[10]。

大量研究表明，吸入麻醉藥可引起β淀粉樣蛋白聚集和Tau蛋白過(guò)度磷酸化，其病理改變?cè)诖竽X皮層和海馬形成老年斑(SP)和大量的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs),并伴隨大量神經(jīng)喪失，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶功能障礙[11-12]。MOD是通過(guò)比較光密度來(lái)反映陽(yáng)性細(xì)胞所表達(dá)的蛋白量大小,其原理是根據(jù)細(xì)胞內(nèi)不同化學(xué)成分的染色反應(yīng)具有不同的吸收波長(zhǎng)，并且化學(xué)反應(yīng)在吸收值和細(xì)胞化學(xué)含量間存在一定的化學(xué)劑量關(guān)系的特點(diǎn)，衡量組織或細(xì)胞中某種成分的含量，因此本實(shí)驗(yàn)選擇MOD來(lái)測(cè)Aβ、異常磷酸化Tau蛋白其結(jié)果相對(duì)可靠[4]。

β淀粉樣蛋白存在于正常大腦中，是一個(gè)產(chǎn)生、降解和清除的平衡過(guò)程。正常生理?xiàng)l件下，淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)非Aβ生成途徑代謝。病理狀態(tài)下，APP的非Aβ源加工途徑受抑制，Aβ途徑被激活，導(dǎo)致Aβ的生成過(guò)多及Aβ的降解和清除受抑制，最終導(dǎo)致Aβ的積聚，成老年斑(SP)[13]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，S1組、S2組Aβ的MOD高于C組，推測(cè)本實(shí)驗(yàn)觀察到的大鼠在新生期間斷、重復(fù)吸入七氟烷后，在其成年期學(xué)習(xí)和記憶能力下降可能與Aβ的積聚有關(guān)。

Tau蛋白為含磷酸基的微管相關(guān)蛋白，正常成熟腦中含2～3個(gè)磷酸基，在微管組裝中起著重要的作用，有利于正常成熟神經(jīng)元軸突的完整性和穩(wěn)定性；過(guò)度異常磷酸化的Tau蛋白含5～9個(gè)磷酸基，其引起主要病理改變?yōu)椋涸谏窠?jīng)元中重新分布組合成不溶性、不能與微管結(jié)合的雙螺旋細(xì)絲(PHFs)，進(jìn)而聚集成神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)。而NFTs長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是神經(jīng)退行性病變和進(jìn)行性功能障礙的主要參與者[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與C組比較，S1組PHF-Tau的MOD顯著升高(P<0.05)，而S2組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與行為學(xué)結(jié)果相一致，推測(cè)吸入1.5%七氟烷后在其成年期P95依然存在行為學(xué)能力下降，可能與此時(shí)仍然存在異常磷酸化的Tau蛋白有關(guān)。

綜上所述，新生期大鼠間斷、重復(fù)吸入1.5%、2.6%七氟烷可使其成年期學(xué)習(xí)記憶能力下降，其中吸入1.5%七氟烷較2.6%七氟烷影響更持久。其機(jī)制可能與海馬CA1區(qū)β淀粉樣蛋白的沉積和異常磷酸化的Tau蛋白水平的改變有關(guān)。

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[收稿2014-09-17;修回2014-10-20]

(編輯：王福軍)

Effects of repeatedly-inhaled sevoflurane in the neonatal period on Tau and amyloid beta protein expressions in adulthood

MaHuanhuan1,ZhangChao1,ZhengShuwen1,ZhuZhaoqiong1，LiuJin2

(1.Department of Anesthesiology, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China;2.Deparment of Anesthesiology,West China Hospital of Sichuan University,Chengdu Sichuan 610041,China)

Objective To study the effects of interrupted and repeated inhalation of sevoflurane in neonatal rats on praxiology of adulthood and the expressions of amyloid beta-protein (Aβ) and abnormal phosphorylated Tau (PHF-Tau) protein in the CA1 area of hippocampus.Methods Twenty-four Seven-day old neonatal SD rats were divided into 3 groups randomly (n=8 in each group), 1.5% sevoflurane (group S1), 2.6% sevoflurane (group S2) and the control group ( group C). Rats in each group were inhalated 1.5%, 2.6% sevoflurane and carrier gas for 1 h in the 7th(P7),14th(P14), 21thday (P21), respectively. Rats were tested via a water maze experiment in P91-P95 and the escape latency and retention time in the original platform quadrant and the percentage of entering times in spatial probe test were recorded. The hippocampus afer morris water maze test was collected to determine the expressions of Aβ and PHF-Tau protein with immunohistochemical method.Results 1)Compared with group C, escape latencies in groupS1and group S2were prlonged (P<0.01 orP<0.05) in the 94th day and in group S1in the 95th day (P<0.05);2)The escape latency was decreased in P94 and P95 of group C and group S2 and P93 of group S1 compared with that in P91 (P<0.05);3)Compared with group C, the percentage of retention time in the original platform quadrant was significantly reduced in group S1 (P<0.01);4)Compared with group C, the mean opticaldensity (MOD) of PHF-Tau protein in group S1 (P<0.05) and Aβ in group S1 and S2 (P<0.01 orP<0.05) was increased.Conclusion The interrupted and repeated inhalation of 1.5% and 2.6% sevoflurane on neonatal rats could impair learning and memory in adulthood, in which the effects of inhalation of 1.5% sevoflurane lasted longer than those of 2.6% sevoflurane. The mechanisms might be related to the deposition of Aβ protein and changes of the PHF-Tau protein expression.

sevoflurane; learning and memory; Aβ; PHF-Tau

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO:81360180)；山東魯南制藥集團(tuán)資助項(xiàng)目(NO:遵魯藥[2010]001)。

朱昭瓊，女，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：吸入麻醉，E-mail:13511805815@163.com。

R614.2

A

1000-2715(2015)01-0060-04